許云姣 吳文笛△ 張志畢 蔡悅青 張?zhí)m春 周瑞彬 楊翼豪 姜莉云

(1.云南省昆明市中醫(yī)醫(yī)院脾胃肝病科，云南 昆明 650011；2.昆明醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程研究院，云南 昆明 650500)

應(yīng)激性潰瘍(stress ulcer, SU)是指嚴(yán)重創(chuàng)傷包括燒傷、敗血癥、休克、多器官功能衰竭、大手術(shù)后等危重病及嚴(yán)重心理疾病等應(yīng)激狀態(tài)下導(dǎo)致胃和十二指腸的急性出血性黏膜糜爛，其病情危重，病死率高[1-2]。研究顯示，SU是多種因素綜合作用的結(jié)果，可歸納為3個(gè)方面，即胃酸分泌增加、胃腸黏膜的屏障保護(hù)功能減低、神經(jīng)內(nèi)分泌功能失調(diào)[3]。其中，胃酸是SU發(fā)生的決定因素之一，但胃腸黏膜屏障與SU發(fā)生密切相關(guān)，SU的發(fā)生是胃黏膜防御因素與侵襲因素間失衡的結(jié)果[3]。研究證實(shí)，充足的胃黏膜微循環(huán)灌注是維持胃液分泌、正常胃黏膜結(jié)構(gòu)保護(hù)屏障及胃的消化吸收等功能的重要保證和前提條件[4]，胃黏膜微循環(huán)障礙被認(rèn)為是SU發(fā)生最主要的核心病理生理過(guò)程。氧化應(yīng)激是指體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡，趨向于氧化，進(jìn)而產(chǎn)生大量氧化中間產(chǎn)物的過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)，氧自由基的堆積會(huì)使黏膜毛細(xì)血管擴(kuò)張，通透性增加，發(fā)生組織充血、水腫、出血、糜爛和潰瘍，導(dǎo)致胃黏膜微循環(huán)障礙而損傷胃黏膜[5-7]。氧化應(yīng)激是SU形成和發(fā)展的重要因素。

國(guó)內(nèi)外已有大量有關(guān)中醫(yī)藥對(duì)SU的實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道，但尚無(wú)從胃黏膜微循環(huán)障礙和氧化應(yīng)激角度對(duì)SU研究的相關(guān)報(bào)道。我們多年臨床研究表明，胃血止糊劑具有保護(hù)胃黏膜、抑酸、促進(jìn)胃腸蠕動(dòng)、止血等作用，可顯著控制臨床癥狀，降低復(fù)發(fā)率[8-9]，但其作用機(jī)制，尤其對(duì)胃黏膜保護(hù)修復(fù)機(jī)制值得深入研究。故本研究把SU形成的核心病理生理—胃黏膜微循環(huán)障礙作為研究切入點(diǎn)，選擇與SU胃黏膜微循環(huán)障礙密切相關(guān)的抗氧化應(yīng)激關(guān)鍵因子，包括超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、過(guò)氧化氫酶(CAT)作為具體研究靶點(diǎn)，以期闡明胃血止糊劑對(duì)SU胃黏膜保護(hù)的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD雄性大鼠72只，8周齡，體質(zhì)量(200±20)g，由昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(滇)K2015-0002。飼養(yǎng)條件：室溫(20±2)℃，相對(duì)濕度60%～70%，水食自取。

1.2 藥物及試劑 胃血止糊劑(藥物組成：大黃15 g，白及20 g，海螵蛸15 g，浙貝母15 g，白芍15 g，炒蒼術(shù)10 g，厚樸10 g，烏藥10 g，枳實(shí)10 g，柴胡10 g，炙甘草6 g，藕粉25 g，由昆明市中醫(yī)醫(yī)院制劑室制備成糊劑)；奧美拉唑腸溶膠囊(山東羅欣藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20033444)。

SOD試劑盒(批號(hào)ml077379)、GSH-Px試劑盒(批號(hào)ml097316)、CAT試劑盒(批號(hào)ml037079)，均購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；丙二醛(MDA)試劑盒(批號(hào)20180801)，購(gòu)自南京建成生物工程研究所；4%水合氯醛(昆山市石浦年沙助劑廠，國(guó)藥準(zhǔn)字H32022265)；蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)G1120-3)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 Moor LDI2-HIR激光多普勒血流儀(北京吉安得爾科技有限公司)，Synergy2多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)伯騰公司)，Centrifuge 5804R冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)，EG1160包埋機(jī)(德國(guó)萊卡公司)；DM500光學(xué)顯微鏡(德國(guó)萊卡公司)；電子天平(美國(guó)丹佛儀器公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 分組 將72只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、模型組、奧美拉唑組及胃血止糊劑高、中、低劑量組，每組12只。

1.4.2 大鼠給藥及建立水浸束縛SU模型[10]大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，采用灌胃方法給藥，藥物劑量參考人和動(dòng)物體表面積折算的等效劑量比率表，將其等效量設(shè)為中劑量，1/2等效量為低劑量，2倍等效量為高劑量，采用0.4%羧甲基纖維素鈉作為溶媒，配制成相應(yīng)濃度。其中奧美拉唑組給藥劑量為5 mg/(kg·d)，胃血止糊劑高、中、低劑量組給藥劑量分別為4、2、1 g/(kg·d)，給藥量為3 mL/d，空白組和模型組給予等容積的溶媒灌胃。每日1次，共灌胃14 d。末次給藥后，除空白組外，其余各組大鼠禁食24 h，予腹腔注射4%水合氯醛(1 mL/100 g)麻醉，用束縛繩將大鼠四肢束縛于木板上，待大鼠清醒后，將其垂直浸于23 ℃的恒溫水槽中，液面保持在大鼠胸骨劍突水平，持續(xù)時(shí)間為6 h。后期通過(guò)觀察胃黏膜組織潰瘍病變?cè)u(píng)價(jià)模型是否成功。

1.5 觀察指標(biāo)及方法

1.5.1 一般情況觀察 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中觀察各組大鼠形態(tài)變化，包括皮毛色澤、神態(tài)、活動(dòng)度、糞便、飲食等情況；測(cè)量大鼠體質(zhì)量：分別于灌胃前后采用電子天平測(cè)量大鼠體質(zhì)量。

1.5.2 胃黏膜血流量(GMBF)測(cè)定 大鼠建模結(jié)束后麻醉，打開(kāi)腹腔，暴露出胃組織，在胃幽門前壁切開(kāi)1個(gè)0.5 cm小切口，待血流速度穩(wěn)定后，用激光多普勒血流儀探頭分別測(cè)定胃體大彎、小彎、胃竇處的胃黏膜血流量，取均值表示GMBF。本研究用多普勒信號(hào)電壓值(mV)表示GMBF的相對(duì)值，電壓值越大，表明GMBF值越大，血流越快。

1.5.3 大鼠血清SOD、GSH-Px、CAT活性及MDA含量 GMBF測(cè)定后，腹主動(dòng)脈采血5 mL，10 000 r/min離心10 min分離血清，-80 ℃保存?zhèn)溆?。采用酶?lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)SOD、GSH-Px、CAT活性及MDA含量。具體步驟嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)的操作進(jìn)行。

1.5.4 潰瘍指數(shù)(UI)測(cè)定 脫頸處死大鼠，打開(kāi)大鼠腹腔，取出胃組織，沿胃大彎剪開(kāi)胃腔，用4 ℃預(yù)冷的0.9%氯化鈉注射液沖洗胃部殘留物，將胃部展平，根據(jù)Guth標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行測(cè)定，標(biāo)準(zhǔn)如下：正常胃黏膜記0分；點(diǎn)狀出血記1分；線狀出血長(zhǎng)度<1 mm記2分；線狀出血長(zhǎng)度1～2 mm記3分；線狀出血長(zhǎng)度2～4 mm記4分；線狀出血長(zhǎng)度>4 mm記5分，當(dāng)寬度>1 mm時(shí)分值×2。每只大鼠的累積總分即為其UI。

1.5.5 胃組織病理學(xué)檢查 UI測(cè)定后取1.0 cm×1.0 cm胃黏膜組織塊2份，其中一份置于4%甲醛溶液中固定1周后石蠟包埋，用切片機(jī)制作6 μm厚石蠟切片，切片脫蠟至水，進(jìn)行HE染色，中性樹(shù)膠封片，晾干后在200倍光學(xué)顯微鏡下觀察胃組織病變情況。

1.5.6 大鼠胃黏膜組織SOD、GSH-Px、CAT活性及MDA含量 取另一份大鼠胃黏膜組織勻漿液采用ELISA檢測(cè)SOD、GSH-Px、CAT活性及MDA含量。具體步驟嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)的操作進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠灌胃前后一般觀察和體質(zhì)量比較 在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，各組大鼠狀態(tài)都正常，毛色光滑，飲食、飲水、活動(dòng)正常。灌胃前，各組大鼠體質(zhì)量組間兩兩比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。灌胃后各組大鼠體質(zhì)量組間兩兩比較差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠灌胃前后體質(zhì)量比較

2.2 各組大鼠GMBF、UI值比較 與空白組比較，模型組、奧美拉唑組和胃血止糊劑高、中、低劑量組GMBF均降低(P<0.05)，UI均升高(P<0.05)；與模型組比較，奧美拉唑組和胃血止糊劑高、中、低劑量組GMBF均升高(P<0.05)，奧美拉唑組和胃血止糊劑高、中劑量組UI均降低(P<0.05)；與奧美拉唑組、胃血止糊劑高劑量組比較，胃血止糊劑中、低劑量組GMBF均降低(P<0.05)，與奧美拉唑組比較，胃血止糊劑中、低劑量組UI均升高(P<0.05)，胃血止糊劑高劑量組GMBF、UI與奧美拉唑組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與胃血止糊劑中劑量組比較，胃血止糊劑低劑量組GMBF顯著降低(P<0.05)，UI無(wú)差異(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠GMBF、UI比較

2.3 各組大鼠胃黏膜組織病理學(xué)比較 空白組大鼠胃黏膜組織未見(jiàn)損傷性的變化，胃黏膜結(jié)構(gòu)完整，腺體排列整齊；模型組大鼠胃黏膜損傷明顯，上皮細(xì)胞廣泛壞死脫落，腺體結(jié)構(gòu)遭到破壞，形成多個(gè)大小、深淺不等的糜爛面。奧美拉唑組和胃血止糊劑各劑量組胃黏膜損傷較模型組明顯減輕。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠胃黏膜組織病理學(xué)圖片(×200，HE)

2.4 各組大鼠血清SOD、GSH-Px、CAT活性及MDA含量比較 與空白組比較，模型組、奧美拉唑組及胃血止糊劑高、中、低劑量組大鼠血清SOD、GSH-Px、CAT活性均降低(P<0.05)，MDA含量均升高(P<0.05)；與模型組比較，胃血止糊劑高、中、低劑量組大鼠血清SOD、GSH-Px活性均增加(P<0.05)，MDA含量均降低(P<0.05)，胃血止糊劑高、中劑量組大鼠血清CAT活性均增加(P<0.05)，奧美拉唑組各指標(biāo)無(wú)變化(P>0.05)；與奧美拉唑組比較，胃血止糊劑高、中、低劑量組大鼠血清SOD活性均增加(P<0.05)，MDA含量均降低(P<0.05)，胃血止糊劑高劑量組大鼠血清CAT活性增加(P<0.05)；與胃血止糊劑高劑量組比較，胃血止糊劑中、低劑量組大鼠血清SOD活性均降低(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠血清SOD、GSH-Px、CAT活性及MDA含量比較

2.5 各組大鼠胃黏膜組織SOD、GSH-Px、CAT活性及MDA含量比較 與空白組比較，模型組、奧美拉唑組及胃血止糊劑高、中、低劑量組大鼠胃黏膜組織SOD、GSP-Px、CAT活性均降低(P<0.05)，MDA含量均升高(P<0.05)；與模型組比較，胃血止糊劑高、中、低劑量組大鼠胃黏膜組織SOD、GPS-Px活性均增加(P<0.05)，MDA含量均降低(P<0.05)，胃血止糊劑高、中劑量組大鼠胃黏膜組織CAT活性均增加(P<0.05)；與奧美拉唑組比較，胃血止糊劑高、中、低劑量組大鼠胃黏膜組織SOD、GSP-Px活性均增加(P<0.05)，MDA含量均降低(P<0.05)，胃血止糊劑高、中劑量組大鼠胃黏膜組織CAT活性均增加(P<0.05)；與胃血止糊劑高劑量組比較，胃血止糊劑中、低劑量組大鼠胃黏膜組織SOD、GSH-Px活性均降低(P<0.05)，胃血止糊劑低劑量組大鼠胃黏膜組織MDA含量升高(P<0.05)；與胃血止糊劑中劑量組比較，胃血止糊劑低劑量組大鼠胃黏膜組織SOD、CAT活性均降低(P<0.05)，MDA含量升高(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠胃黏膜組織SOD、GSH-Px、CAT活性及MDA含量比較

3 討論

SU是臨床上急診ICU患者各種危重疾病常見(jiàn)并發(fā)癥，其發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈逐年上升趨勢(shì)，為目前胃腸疾病最具挑戰(zhàn)性的研究熱點(diǎn)。SU的發(fā)生和發(fā)展涉及到多基因、多環(huán)節(jié)、多途徑、多因素，但具體的發(fā)病機(jī)制尚不明確。大多認(rèn)為SU的發(fā)生是胃黏膜防御因素與侵襲因素間失衡的結(jié)果[11]。目前西醫(yī)對(duì)SU的治療主要以對(duì)癥支持治療為主，包括抑酸、保護(hù)胃黏膜、止血、循環(huán)支持等。奧美拉唑腸溶膠囊可抑酸保護(hù)胃黏膜，但具有副作用大、易反復(fù)等缺點(diǎn)。中醫(yī)可改善患者癥狀，減少?gòu)?fù)發(fā)率，且醫(yī)療費(fèi)用少，故應(yīng)充分發(fā)揮中醫(yī)藥的優(yōu)勢(shì)。

SU屬中醫(yī)學(xué)“胃院痛”“嘔血”“黑便”“便血”等范疇。《景岳全書(shū)》云“蓋動(dòng)者多由于火，火盛則逼血妄行；損者多由于氣，氣傷則血無(wú)以存”，認(rèn)為失血為“火盛”及“氣虛”導(dǎo)致。本病的病位在胃，與肝、脾密切相關(guān)。后世醫(yī)家多把SU病機(jī)分為胃熱壅盛、氣不攝血、陰虛火旺、肝火犯胃、氣虛胃熱夾瘀，治療均以止血為當(dāng)務(wù)之急。SU是患者在各種病理因素的作用下，如外傷、休克、感染、危重病、衰竭等情況下發(fā)生神經(jīng)—內(nèi)分泌功能紊亂，使體內(nèi)應(yīng)激類激素大量分泌釋放而出現(xiàn)的一種人體自損效應(yīng)，故課題組提出SU是應(yīng)激狀態(tài)下氣血逆亂，熱灼胃絡(luò)，血溢脈外所致。脾胃虛弱雖是SU最主要的病機(jī)基礎(chǔ)，但在應(yīng)激狀態(tài)下氣機(jī)逆亂，胃熱壅盛，胃失和降，不通則痛是其關(guān)鍵病機(jī)，急則治其標(biāo)，故對(duì)SU的防治提出清胃瀉火，疏肝理氣，和胃止痛，涼血止血的治療原則。胃血止糊劑方中大黃清熱瀉火，涼血止血，能使上炎之火下瀉；白及收斂止血，消腫生肌；海螵蛸收斂止血，制酸止痛，收濕斂瘡；浙貝母清熱，制酸，散結(jié)解毒，常與海螵蛸組成烏貝散，共起制酸止痛、收斂止血之功；蒼術(shù)為陽(yáng)明經(jīng)引經(jīng)藥，能強(qiáng)胃健脾；柴胡疏肝解郁，透邪外出；枳實(shí)理氣解郁，泄熱破結(jié)，同時(shí)厚樸、烏藥、枳實(shí)、柴胡助大黃通腑，保持腑氣通暢；白芍養(yǎng)血柔肝，緩中止痛；甘草補(bǔ)脾益氣，緩急止痛，瀉火解毒，調(diào)和諸藥；白芍、甘草合用，可酸甘化陰，柔肝止痛，柴胡、枳實(shí)、白芍、甘草組成四逆散可透邪解郁，疏肝理氣；藕粉益胃健脾，清熱涼血，補(bǔ)血生肌，止血散瘀。諸藥合用，共奏清胃瀉火、疏肝理氣、和胃止痛、涼血止血之功。

氧化應(yīng)激是SU形成和發(fā)展的重要因素，清除氧自由基，改善胃黏膜微循環(huán)是保護(hù)胃黏膜的關(guān)鍵。SOD、GSH-Px、CAT是機(jī)體內(nèi)3種重要的抗氧化酶，當(dāng)機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)，這3種酶會(huì)參與到抗氧化應(yīng)激反應(yīng)中，此時(shí)其催化活力會(huì)相應(yīng)的被消耗(如表3和表4中)。SOD是體內(nèi)天然存在的氧自由基清除劑，是自由基的清除防御系統(tǒng)最重要的標(biāo)志酶之一，也是胃黏膜保護(hù)因子之一，SOD特異性地清除自由基，保護(hù)細(xì)胞免受損傷[12]。SOD含量和活性的減少和降低，將導(dǎo)致自由基的堆積[13]。其活力的高低直接反映了機(jī)體清除自由基的能力，故可作為機(jī)體清除氧自由基能力的指標(biāo)。GSH-Px是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要的過(guò)氧化物分解酶[14]，具有清除自由基，防止過(guò)氧化物生成和保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整性的雙重作用。GSH-Px含量的多少是衡量機(jī)體抗氧化能力大小的重要因素。CAT是催化過(guò)氧化氫(H2O2)分解成氧和水的酶，存在于細(xì)胞的過(guò)氧化物內(nèi)。H2O2是一種代謝過(guò)程中產(chǎn)生的廢物，能夠?qū)C(jī)體造成損害，CAT就是被細(xì)胞用來(lái)催化H2O2轉(zhuǎn)化分解為其他無(wú)害或毒性較小的物質(zhì)。這3種生物酶在保持機(jī)體氧化和抗氧化之間動(dòng)態(tài)平衡方面具有重要作用，是衡量機(jī)體抗氧化能力的重要指標(biāo)。MDA是體內(nèi)的脂質(zhì)過(guò)氧化代謝的主要中間產(chǎn)物，具有很強(qiáng)的毒性作用，可嚴(yán)重破壞細(xì)胞成分、結(jié)構(gòu)和功能，其含量可作為自由基含量多少的指示物，也可反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化的程度，其含量的高低可以作為機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊程度的指標(biāo)，間接反映細(xì)胞的受損程度[15-17]。MDA含量能直接或間接反映胃黏膜組織過(guò)氧化損傷的程度。

本研究結(jié)果顯示，灌胃后，各組大鼠體質(zhì)量組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明在實(shí)驗(yàn)劑量范圍內(nèi)，胃血止糊劑對(duì)大鼠無(wú)明顯的毒副作用。造模后GMBF和UI的檢測(cè)結(jié)果表明，本研究所采用的水浸束縛法能有效地誘導(dǎo)大鼠SU的發(fā)生，實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒⒊晒?。本研究結(jié)果顯示，胃血止糊劑能通過(guò)提高GMBF，增加胃黏膜血流量，緩解潰瘍損傷，降低UI，但是與陽(yáng)性藥奧美拉唑相比較，胃血止糊劑對(duì)GMBF和UI的改善情況相對(duì)要弱。造模后模型組大鼠血清和胃黏膜組織中SOD、GSH-Px、CAT活性均明顯降低(P<0.05)，MDA含量均升高(P<0.05)，表明機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)。經(jīng)胃血止糊劑治療后各劑量組大鼠血清和胃黏膜組織中MDA含量均明顯降低(P<0.05)，SOD、GSH-Px活性均增加(P<0.05)，高、中劑量組CAT活性也增加(P<0.05)，證實(shí)胃血止糊劑具有明顯的抗氧化作用，且其抗氧化作用可能是主要通過(guò)增加SOD和GSH-Px的活性來(lái)實(shí)現(xiàn)的，對(duì)CAT活性的調(diào)節(jié)可能也是其發(fā)揮抗氧化作用的原因之一。

綜上所述，胃血止糊劑對(duì)SU模型大鼠具有清除機(jī)體自由基，增強(qiáng)抗氧化能力的作用，可以調(diào)節(jié)和改善自由基代謝平衡，保護(hù)胃黏膜。目前研究提示SU的發(fā)生是胃黏膜防御因素與侵襲因素間失衡的結(jié)果，故下一步課題組將進(jìn)一步研究胃血止糊劑與胃黏膜防御因素與侵襲因素之間的關(guān)聯(lián)機(jī)制。