李青蔓，郭 豐，凌 奕，李慧慧，劉芳芳，劉 輝，溫壯飛，孫薇薇，劉亦恒，張海英

（1.海南醫(yī)學(xué)院熱帶腦科學(xué)研究與轉(zhuǎn)化重點實驗室，海南海口 571199；2.海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，海南?？?570102；3. 福建省南平市第一醫(yī)院檢驗科，福建 南平 353006；4. ?？谑袐D幼保健院兒童康復(fù)科，海南 ?？?570102；5. ?？谑腥嗣襻t(yī)院兒科，海南 ?？?570208；6.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬海口醫(yī)院骨科，海南 海口 570208）

先天性心臟?。╟ongenital heart disease，CHD）是一種心臟結(jié)構(gòu)發(fā)育異常而導(dǎo)致心臟畸形的疾病，CHD 的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，常常由影響心臟發(fā)育的染色體或基因發(fā)生突變所導(dǎo)致，并且對遺傳和環(huán)境干擾很敏感［1，2］。亞洲地區(qū)報告的先天性心臟病發(fā)病率最高，每1 000 名活產(chǎn)嬰兒中有9.3 名患有CHD，歐洲地區(qū)次之（0.82%活產(chǎn)），北美地區(qū)報告的CHD 患兒患病率最低（0.69%活產(chǎn)）［3，4］。研究者認(rèn)為，遺傳因素和環(huán)境因素是CHD 的主要發(fā)病原因［5］。

人NKX2-5和小鼠NKX2-5均屬于NK同源基因家族，共有一個保守的結(jié)構(gòu)域［6］，它在心臟的發(fā)育和分化中起重要作用。NKX2-5是第一個被發(fā)現(xiàn)與CHD 有關(guān)的基因，Schott 等［7］最先在室間隔缺損患者中檢測到NKX2-5基因突變。NKX2-5是心臟發(fā)育的核心調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子，該基因突變會導(dǎo)致心臟結(jié)構(gòu)和功能的異常［8］。GATA4是GATA轉(zhuǎn)錄因子家族中6 個成員之一，GATA4的突變不僅會導(dǎo)致心臟發(fā)育異常［9］，還會導(dǎo)致泌尿生殖系統(tǒng)缺陷、高血壓等疾 病［10，11］。ZIC3基 因 編 碼 一 種 高 度 保 守 的 鋅 指 蛋白，屬于GLI轉(zhuǎn)錄因子超家族［12］。ZIC3在形態(tài)發(fā)育上具有多種功能，ZIC3對BMP 和Wnt 信號通路的調(diào)節(jié)可能對正常心臟發(fā)育至關(guān)重要［13］。

本研究收集210 例非綜合征散發(fā)性CHD 患者，通過高分辨熔解曲線分析技術(shù)（high-resolution melting，HRM）和DNA 測序?qū)@些患者的NKX2-5、GATA4和ZIC3基因序列進(jìn)行了研究，分析了中國海南地區(qū)散發(fā)性單純性CHD 患者的NKX2-5、GATA4和ZIC3基因系列，并探討了基因型和表型之間的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 研究對象

2018 年11 月～2021 年10 月，收 集210 例 散 發(fā) 性CHD 患者納入研究，由3 位經(jīng)驗豐富的兒科心臟病專家通過體格檢查和超聲心動圖確診CHD。本研究排除了患有綜合征CHD 的患者，即綜合征（Charge、DiGeorge、Noonan、Holt-Oram、Marfan、Alagille）和染色體疾病。來自海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院、?？谑袐D幼保健院、?？谑腥嗣襻t(yī)院（中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院）的210 例患者樣本，每例患者抽取2～5 mL 靜脈血，并裝在含乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝劑的試管中。本研究經(jīng)海南醫(yī)學(xué)院（中國?？冢﹤惱砦瘑T會審查，并獲得所有參與者或其監(jiān)護(hù)人的知情同意。

1.2 主要試劑和儀器

梯度PCR 機(jī)（nexus GSX1，Eppendorf AG）；瓊脂糖凝膠電泳儀；NKX2-5、GATA4和ZIC3基因引物（生工，上海）；PCR Mix（Invitrogen，美國）；DNA Marker（TianGen，中國廣州）。

1.3 基因組DNA 的提取

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案（TIANamp Blood DNA Kit，TIANGEN）從血液樣本中提取DNA，要求DNA 質(zhì)量，即A260/A280 控制在1.8～2.0。

1.4 PCR 擴(kuò)增、HRM 分析和DNA 測序

擴(kuò)增目的基因片段（nexus GSX1，Eppendorf AG），通 過HRM 技 術(shù) 篩 選NKX2-5、GATA4和ZIC3的變異，進(jìn)行DNA 雙向測序。通過Exome Variant Server（http：//evs. gs. washington. edu/EVS/）對變異進(jìn)行初步篩選，對符合突變診斷的患者進(jìn)行二次實驗確認(rèn)。

2 結(jié)果

2.1 NKX2-5、GATA4 和ZIC3 突變的臨床表型

本研究采用HRM 技術(shù)對210 例散發(fā)性先天性心臟病患者進(jìn)行NKX2-5、GATA4和ZIC3基因突變篩查，患者室間隔缺損（VSD）、房間隔缺損（ASD）、動脈導(dǎo)管未閉（PDA）、卵圓孔未閉（PFO）、法洛四聯(lián)癥（TOF）、肺動脈高壓（PH）、房室間隔缺損（AVSD）、肺 動 脈 狹 窄（PS）患 病 率 分 別 為26.7%、21.1%、15.6%、12.2%、9.4%、9.4%、4.4%、1.1%。Sanger 測序用于識別潛在的候選致病位點，在排除高頻多態(tài)位點后，發(fā)現(xiàn)了潛在的致病突變序列。散發(fā)性CHD 病例中NKX2-5、GATA4和ZIC3突變的總結(jié)見圖1。檢查結(jié)果顯示，在7 例CHD 患者中共檢出NKX2-5、GATA4和ZIC3的7 個基因突變，檢出率為3%。

圖1 NKX2-5、GATA4、ZIC3 突變對散發(fā)性CHD 及相關(guān)心臟畸形檢出率的總結(jié)Fig 1 Summary of NKX2-5，GATA4，ZIC3 mutations in sporadic CHD and detection rate of related cardiac malformations

2.2 NKX2-5、GATA4 和ZIC3 基因突變

通過Sanger 測序，在1 例VSD 和ASD 的患者中發(fā)現(xiàn)了NKX2-5的雜合無義突變（c.178G＞T，p.Glu60X）（圖2 A），該突變位點可能導(dǎo)致心臟結(jié)構(gòu)異常。通過搜索1 000 Genomes 網(wǎng)站（https：//www.internationalgenome. org/data） 、ClinVar 網(wǎng) 站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/）和gnomAD 數(shù)據(jù)庫（http：//gnomad-sg.org/），確定c.178G＞T 是一個未報道的突變位點。在GATA4基因中發(fā)現(xiàn)了3 個雜合突變，其中c. 1123G＞A p.Gly375Arg 是一個新的突變（圖2 B），它涉及GATA4基因外顯子密碼子1123 處的CCG→CTG 突變，這導(dǎo)致殘基375 處Gly 被Arg 取代。該突變位點位于GATA4基因的高度保守區(qū)域（圖2 C），并改變了與其他轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。在1 例VSD 和ASD 患者中發(fā)現(xiàn)基因突變c.677C＞T p.Pro226Leu（圖2 D），VSD 和PDA 患者中發(fā)現(xiàn)基因突變c.928A＞G p.Met310Val（圖2 F），通過搜索1000G 網(wǎng)站和ClinVar 網(wǎng)站并確定GATA4的p.Pro226Leu 和p.Met310Val 突變都是已知突變，且都位于保守區(qū)（圖2 E 和G）。其中c.677C＞T 導(dǎo)致Pro 變?yōu)長eu，另一個突變位點c.928A＞G 導(dǎo)致Met 變?yōu)閂al。在ZIC3基因中發(fā)現(xiàn)3 個新突變位點，第1 個新突變在VSD和ASD 患者DNA 中發(fā)現(xiàn)，ZIC3基因突變c.19G＞C p.Gly7Arg（圖2 H），它位于一個保守序列中（圖2 I），第2 個 新 突 變 在1 例TOF 患 者 中 檢 測 到，c.1255C＞G p.Leu419Val（圖2 J），該ZIC3基 因1255 位 點處核苷酸C 被G 取代，Leu 突變?yōu)閂al。第3 個新突變是c.1348C＞T p.Pro450Ser（圖2 L），在1 例女性TOF 患者中發(fā)現(xiàn)，ZIC3基因密碼子1348處 的C 被T 取 代。c.1255C＞G p.Leu419Val 和c.1348C＞T p.Pro450Ser 位于高度保守的序列中（圖2K 和M）。

圖2 NKX2-5、GATA4、ZIC3 基因突變位點及保守性Fig 2 Mutation sites and conservation of NKX2-5，GATA4，ZIC3 genes

2.3 NKX2-5、GATA4 和ZIC3 基 因 突 變 致 病 性分析

通過Sanger 測序發(fā)現(xiàn)的點突變，實驗使用了生物信息學(xué)方法（Polyphen2［http：//genetics.bwh.harvard.edu/pph2/］、SIFT［http：//sift.jcvi.org/］和mutationtaster［https：//www.mutationtaster.org/］）來預(yù)測GATA4和ZIC3中新突變位點的致病性（表1）。結(jié)果表明，使用3 種方法來預(yù)測GATA4p.Pro226Leu、p.Met310Val 和p.Gly375Arg 都 顯 示 出可能的致病性。生物信息學(xué)方法對ZIC3的3 個突變的預(yù)測不一致（表1），p.Gly7Arg 在polyphen2 中預(yù)測為可能致病性，SIFT 預(yù)測致病可能性很高。p.Leu419Val 在polyphen2 和SIFT 中 預(yù) 測 致 病 性 很低，而在mutationtaster 中預(yù)測有致病性。 p.Pro450Ser 在polyphen2 中預(yù)測沒有致病性，而SIFT中預(yù)測有很高的致病性。

表1 預(yù)測NKX2-5、GATA4 和ZIC3 基因突變致病性Tab 1 Predicted pathogenicity of NKX2-5，GATA4 and ZIC3 gene mutations

3 討論

與CHD 發(fā)生相關(guān)的基因包括NKX2-5、GATA4、ZIC3、TBX1、TBX5、LEFTY、SOX17，以及包括轉(zhuǎn)化生長因子β（TGFβ）信號通路、Shh 信號通路、Notch 信號通路、Wnt 信號通路和絲裂原活化蛋白激酶信號通路等在內(nèi)的相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［14-24］。在NKX2-5、GATA4、ZIC3中發(fā)現(xiàn)了7 個基因突變，其中有5 個新基因突變NKX2-5（c.178G＞T）、GATA4（c.1123G＞A）、ZIC3（c.19G＞C，c.1255C＞G，c.1348C＞T）。

研究表明，NKX2-5基因在心臟的早期發(fā)育中發(fā)揮著重要作用［25］。有研究表明NKX2-5基因突變與CHD 有 關(guān)［26］。在210 例CHD 患 者 中，檢 測 到NKX2-5基因出現(xiàn)新的突變位點c.178G＞T p.Glu60X，谷氨酸突變?yōu)榻K止密碼子，導(dǎo)致蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄中斷，突變位點后的重要功能區(qū)無法正常轉(zhuǎn)錄，蛋白質(zhì)明顯短于野生型蛋白質(zhì)，出現(xiàn)嚴(yán)重的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能異常，可能導(dǎo)致一些嚴(yán)重的病理表現(xiàn)。通過查閱1000G 和ClinVar 網(wǎng)站，C178G＞T 為新突變位點。在210 例患者中，只有1 例患者攜帶NKX2-5突變位點，發(fā)生率約為0.5%，美國地區(qū)在608 例CHD 患者中檢測到NKX2-5突變頻率為3%［27］，本研究結(jié)果與國外報道的NKX2-5致病率有較大的差別，可能NKX2-5與其他地區(qū)遺傳背景的不同，導(dǎo)致NKX2-5致病率的不同。

GATA4被認(rèn)為是心臟發(fā)育中的重要轉(zhuǎn)錄因子［28］。一些GATA4突變已被證實會導(dǎo)致家族性和散發(fā)性CHD。相同的突變在患者中可能有不同的臨床表現(xiàn)，相同的臨床表現(xiàn)可能由不同的突變引起［29-31］。本研究發(fā)現(xiàn)了3 個不同的GATA4突 變（p.Gly375Arg、p.Pro226Leu、p.Met310Val），p.Gly375Arg 突變是未報道的突變，它是高度保守的氨基酸，可能影響GATA4的DNA 結(jié)合或蛋白質(zhì)-蛋 白 質(zhì) 相 互 作 用。Li 等［32］發(fā) 現(xiàn)p.Pro226Leu 突變位點位于鋅指結(jié)構(gòu)域內(nèi)，突變體會導(dǎo)致GATA4轉(zhuǎn)錄活性降低，同時降低了NKX2-5的協(xié)同激活作用，進(jìn)而影響心臟結(jié)構(gòu)發(fā)育。Chen 等［33］發(fā)現(xiàn)p.Gly310Arg 突變位點位于核定位信號區(qū)，基因突變導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，轉(zhuǎn)錄活性降低，損害導(dǎo)入細(xì)胞核能力，影響轉(zhuǎn)錄激活，最終導(dǎo)致心臟結(jié)構(gòu)異常。GATA4過度表達(dá)會誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大，細(xì)胞表面積增加2 倍以上。目前已發(fā)現(xiàn)許多GATA4的突變，盡管這些突變的意義尚不清楚，但大多認(rèn)為與CHD 相關(guān)［34-36］。

ZIC3在人體發(fā)展的各個方面都發(fā)揮著重要作用，它參與心臟、骨骼、腸道和泌尿系統(tǒng)的發(fā)育和調(diào)節(jié)［37］。ZIC3基 因 突 變 為 顯 性 遺 傳，致 病 率 約 為1%［38］，它的功能異常可導(dǎo)致包括心房異構(gòu)、房室間隔缺損、右心室雙出口、大動脈轉(zhuǎn)位、肺動脈瓣下狹窄等在內(nèi)的心臟發(fā)育不良［39］。本研究發(fā)現(xiàn)了3 個ZIC3新基因突變位點：p.Gly7Arg，p.Leu419Val，p.Pro450Ser。Alessandro 等［40］發(fā) 現(xiàn)p.Gly17Cys 處 發(fā)生雜合突變，該位點突變影響了蛋白質(zhì)核定位功能，p.Gly7Arg 與p.Gly17Cy 位置相近，可能影響了相似的功能。ZIC3編碼的蛋白質(zhì)功能既取決于在細(xì)胞核中的定位，也取決于其隨后激活靶基因的能力，鋅指結(jié)構(gòu)域在這些功能中起重要作用。Zhu 等人［41］發(fā)現(xiàn)ZIC3和GLI3結(jié)合是心臟正常發(fā)育的重要過程，ZIC3p.Lys405Glu 突變會影響ZIC3和CLI3的結(jié)合能力，從而影響蛋白質(zhì)功能，p.Lys405Glu 與p.Leu419Val 位置接近，因此推測ZIC3p.Leu419Val突變也可能導(dǎo)致不能與GLI3正常結(jié)合，導(dǎo)致心臟發(fā)育異常。p.Ala447Gly 位于鋅指結(jié)構(gòu)2+3 和鋅指結(jié)構(gòu)ZF4+5 核定位信號下游，ZIC3p.Ala447Gly 突變改變了亞細(xì)胞運輸，阻止發(fā)育關(guān)鍵基因的下游轉(zhuǎn)錄激活［42］，p.Pro450Ser 位置與p.Leu447Val 相近，推測可能會影響發(fā)育關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄激活。總的來說，這些結(jié)果顯示ZIC3突變可能影響鋅指結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)域、核定位信號區(qū)和細(xì)胞核輸出信號導(dǎo)致CHD發(fā)病。

本實驗210 例CHD 患者中發(fā)現(xiàn)NKX2-5、GATA4和ZIC3基因的7 個突變可能與中國海南省先天性散發(fā)性CHD 有關(guān)。檢測到5 個新突變位點NKX2-5（c. 178G＞T）、GATA4（c. 1123G＞A）、ZIC3（c. 19G＞C，c. 1255C＞G，c. 1348C＞T），NKX2-5基因僅發(fā)現(xiàn)1 個突變位點，在CHD 患者中突變率為0.5%，與西方國家有明顯差異。這一結(jié)果表明NKX2-5基因的突變可能是海南地區(qū)散發(fā)性CHD 患者的危險因素，NKX2-5具有進(jìn)一步研究的價值。總之，本研究結(jié)果表明NKX2-5（p.Glu60X）、GATA4（p. Gly375Arg）、ZIC3（p. Gly7Arg、p.Leu419Val、p.Pro450Ser）新基因突變可能在心臟功能中起重要作用，基因突變導(dǎo)致CHD。希望通過動物實驗進(jìn)一步驗證，探索CHD 遺傳機(jī)制。

作者貢獻(xiàn)度說明：

劉芳芳、劉亦恒、凌奕、溫壯飛、孫薇薇：參與患者數(shù)據(jù)的采集和解釋；郭豐、李慧慧：參與數(shù)據(jù)的獲?。焕钋嗦浩鸩菰?；張海英、劉輝：進(jìn)行文章修改。所有作者都對稿件的編輯做出了貢獻(xiàn)，并就最終內(nèi)容達(dá)成了一致。所有作者閱讀并認(rèn)可終稿。