劉 洋，劉婕婷，王迎斌

（1.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院麻醉科，甘肅 蘭州 730030；2.蘭州大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730030）

腸缺血再灌注（ischemia-reperfusion，I/R）是一種致命疾病，死亡率高達(dá)60%～80%。腸道I/R 損傷可導(dǎo)致腸黏膜屏障受損，誘發(fā)嚴(yán)重的全身炎癥反應(yīng)及隨之而來(lái)的遠(yuǎn)端器官損傷。肺是腸I/R 的高敏感受累器官，其結(jié)構(gòu)和功能易受影響，引起急性肺損傷（acute lung injury，ALI）［1］。

富馬酸氯馬斯?。╟lemastine fumarate，CLE），是第二代的組胺1 受體（histamine 1 receptor，H1R）拮抗劑，在過(guò)敏性疾病的治療中應(yīng)用廣泛。研究發(fā)現(xiàn)在肺損傷的形成過(guò)程中H1R 介導(dǎo)的炎性反應(yīng)發(fā)揮重要作用，并且在肺缺血再灌注模型中CLE 發(fā)揮了抗炎作用并減輕了肺損傷［2］。臨床研究中，胃腸急危重癥開(kāi)腹手術(shù)前使用CLE 被證實(shí)具有肺保護(hù)作用［3］。但目前沒(méi)有確切的證據(jù)表明CLE 在腸I/R所致ALI 中發(fā)揮保護(hù)作用。因此本實(shí)驗(yàn)采用小鼠腸I/R 模型，以探討CLE 對(duì)該模型建立后肺組織的影響及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年SPF 級(jí)雄性Balb/c 小鼠24只，購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體質(zhì)量18～25 g。飼養(yǎng)于蘭州大學(xué)第二醫(yī)院萃英實(shí)驗(yàn)平臺(tái)動(dòng)物房，室溫24～26 ℃，晝夜12 h 交替，可自由進(jìn)食、進(jìn)水。適應(yīng)1 周后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)流程。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已獲得蘭州大學(xué)第二醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批號(hào)：D2022-130）。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑 富馬酸氯馬斯汀（批號(hào)：S1847-04，上海藍(lán)木化工有限公司）；MDA ELISA 試劑盒（批號(hào)：16203A，上海優(yōu)選生物科技有限公司）；SOD ELISA 試劑盒（批號(hào)：13963A，上海優(yōu)選生物科技有限公司）；GSH-px ELISA 試劑盒（批號(hào)：20963A，上海優(yōu)選生物科技有限公司）；NF-κB ELISA 試劑盒（批號(hào)：15171B，上海優(yōu)選生物科技有限公司）；TNF-α ELISA 試劑盒（批號(hào)：29312B，上海優(yōu)選生物科技有限公司）；TLR4 抗體（批號(hào)：66350-1-Ig，Proteintech）；二甲基亞砜（批號(hào)：302A0327，Solarbio）；蘇木素-伊紅染液（Solarbio）；多聚甲醛（天津光復(fù)）。

1.2 方法

1.2.1分組與模型復(fù)制 將24 只Balb/c 小鼠隨機(jī)分為3 組（n=8）：假手術(shù)組（Sham 組）、缺血再灌注組（I/R 組）和富馬酸氯馬斯汀預(yù)處理組（I/R+C組）。術(shù)前各組小鼠12 h 禁食，可自由攝水。術(shù)前1 h，I/R+C 組 腹 腔 注 射CLE 5 mg/kg，Sham 組 及I/R 組腹腔注射2% 二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）10 mL/kg。I/R 組及I/R+C 組參考文獻(xiàn)制備小鼠腸I/R 模型［4］，缺血40 min，再灌注2 h；Sham 組行相同手術(shù)不做夾閉處理。過(guò)量麻醉致死，胸部用剪刀開(kāi)放“T”形切口，取雙側(cè)肺組織。

1.2.2肺組織病理學(xué)檢測(cè) 取4%甲醛浸泡左肺下葉肺組織，經(jīng)過(guò)脫水、石蠟包埋、切片（5 μm）、蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，光鏡下觀察肺組織的病理變化。根據(jù)肺間質(zhì)水腫程度、肺泡內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及肺泡內(nèi)滲出進(jìn)行肺損傷評(píng)分。標(biāo)準(zhǔn)如下［5］：0 分：正常，肺泡腔面積＞85%；1 分：肺泡腔面積75%～85%；2 分：肺泡腔面積50%～75%；3分：肺泡腔面積25%～50%；4 分：肺泡腔面積0%～25%。

1.2.3肺濕干重比 取小鼠左肺上葉，稱重，記錄濕重（W）；然后在恒溫80 ℃烤箱中干燥24 h 脫水，稱重，記錄干重（D）。計(jì)算濕重與干重（W/D）之比。

1.2.4肺組織標(biāo)本處理及ELISA 法檢測(cè) 取冷凍肺組織，充分破碎肺組織，低溫離心，收集上清。根據(jù)ELISA 試劑盒說(shuō)明檢測(cè)上清液中MDA、SOD、GSH-px、NF-κB 及TNF-α 水平。

1.2.5肺組織TLR4 蛋白Western blot 檢測(cè) 取冷凍肺組織，充分破碎肺組織，冰浴裂解，低溫離心，取上清液采用BCA 法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。蛋白樣品經(jīng)煮沸變性，SDS-PAGE 電泳，蛋白轉(zhuǎn)印，5% 脫脂奶粉封閉，PVDF 膜一抗孵育過(guò)夜（TLR4，1∶1 000；β-actin，1∶4 000），二抗孵育1 h，TBST 浸洗。PVDF 膜滴加ECL 顯色液，曝光顯影。應(yīng)用Image J 軟件進(jìn)行蛋白條帶灰度值分析處理。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用Graphpad prism 9.1.1 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），方差齊使用Ordinary ANOVA test，方差不齊使用Brown-Forsythe and Welch ANOVA test，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺組織病理變化結(jié)果及W/D 比值結(jié)果

Sham 組肺組織完整，肺泡、肺間質(zhì)結(jié)構(gòu)清晰，未見(jiàn)明顯異常。與Sham 組比較，I/R 組肺損傷評(píng)分及W/D 比值明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），可見(jiàn)肺泡內(nèi)出現(xiàn)滲出，肺泡存在破裂融合，肺間質(zhì)顯著增厚，伴有大量炎性細(xì)胞聚集浸潤(rùn)。與I/R 組比較，I/R+C 組肺損傷評(píng)分及W/D 比值降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），可見(jiàn)肺泡結(jié)構(gòu)基本存在，肺間質(zhì)水腫，伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。見(jiàn)圖1及表1。

圖1 各組小鼠肺組織HE 染色（× 200，Bar= 50 μm）Fig 1 Microscopy of lung tissues of mice in various groups by HE（×200）

表1 各組肺損傷評(píng)分及肺濕重/干重比值（n=8，±s）Tab 1 The lung morphology and wet/dry ratio of mice in each group（n=8，±s）

表1 各組肺損傷評(píng)分及肺濕重/干重比值（n=8，±s）Tab 1 The lung morphology and wet/dry ratio of mice in each group（n=8，±s）

注：與Sham 組比較，*P＜0.05；與I/R 組比較，#P＜0.05。

組別Sham 組I/R 組I/R+C 組W/D 3.58±0.38 4.39±0.17*3.92±0.16*#16.85＜0.0001 F P肺損傷評(píng)分0.25±0.45 3.33±0.49*1.50±0.67*#69.81＜0.000 1

2.2 小鼠肺組織MDA、SOD 及GSH-px 的表達(dá)

與Sham 組相比，I/R 組、I/R+C 組小鼠肺組織MDA 表達(dá)量明顯升高，SOD、GSH-px 表達(dá)量降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與I/R 組相比，I/R+C 組肺組織MDA 表達(dá)量降低，SOD、GSH-px 表達(dá)量升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠肺組織MDA、SOD 及GSH-px 的表達(dá)（n=8，±s）Tab 2 Expression levels of MDA，SOD and GSH-px in lung tissue of mice in each group（n=8，±s）

表2 各組小鼠肺組織MDA、SOD 及GSH-px 的表達(dá)（n=8，±s）Tab 2 Expression levels of MDA，SOD and GSH-px in lung tissue of mice in each group（n=8，±s）

注：與Sham 組比較，*P＜0.05；與I/R 組比較，#P＜0.05。

組別MDA (nmol/mL)SOD (ng/mL)GSH-px (pg/mL)Sham 組I/R 組I/R+C 組563.70±35.70 299.10±15.49*354.80±30.29*#234.3＜0.000 1 F P 5.37±0.43 11.37±0.74*7.40±0.65*#253.9＜0.000 1 28.82±1.11 13.49±1.48*23.75±1.62*#235.8＜0.000 1

2.3 小鼠肺組織NF-κB、TNF-α 的表達(dá)

與Sham 組 相 比，I/R 組、I/R+C 組 小 鼠 肺 內(nèi)NF-κB、TNF-α 含量明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與I/R 組相比，I/R+C 組小鼠肺內(nèi)NF-κB、TNF-α 含量降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 各組小鼠肺組織NF-κB、TNF-α 含量（pg/mL，n=8，±s）Tab 3 Expression levels of NF-κB、TNF-α in lung tissue of mice in each group（pg/mL，n=8，±s）

表3 各組小鼠肺組織NF-κB、TNF-α 含量（pg/mL，n=8，±s）Tab 3 Expression levels of NF-κB、TNF-α in lung tissue of mice in each group（pg/mL，n=8，±s）

注：與Sham 組比較，*P＜0.05；與I/R 組比較，#P＜0.05。

組別Sham 組I/R 組I/R+C 組TNF-α 496.60±46.59 836.10±31.67*556.10±61.23*#188.6＜0.000 1 F P NF-κB 592.50±43.33 1 204.00±47.79*725.60±87.76*#311.1＜0.000 1

2.4 小鼠肺組織TLR4 蛋白表達(dá)水平

與Sham 組相比，I/R 組小鼠肺組織TLR4 蛋白表達(dá)量明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與I/R 組相比，I/R+C 組肺組織TLR4 蛋白表達(dá)顯著減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表4及圖2。

表4 各組小鼠肺組織TLR4 蛋白的水平（n=4，±s）Tab 4 Expression levels of TLR4 in lung tissues of mice（n=4，±s）

表4 各組小鼠肺組織TLR4 蛋白的水平（n=4，±s）Tab 4 Expression levels of TLR4 in lung tissues of mice（n=4，±s）

注：與Sham 組比較，*P＜0.05；與I/R 組比較，#P＜0.05。

TLR4/β-actin 0.427±0.043 0.618±0.062*0.477±0.048#14.98 0.001 8組別Sham 組I/R 組I/R+C 組FP

圖2 各組小鼠肺組織TLR4 的表達(dá)Fig 2 Expression levels of TLR4 in lung tissues of mice

3 討論

腸I/R 損傷是手術(shù)期間最常見(jiàn)的組織和器官損傷之一，如腹主動(dòng)脈瘤手術(shù)、心肺搭橋手術(shù)和腸移植手術(shù)［6］。腸I/R 損傷可產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS）、細(xì)胞因子和趨化因子，進(jìn)而激活免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致遠(yuǎn)端器官功能障礙，特別是在肺部，引發(fā)ALI［7］。

肺損傷中抗氧化系統(tǒng)和過(guò)量自由基產(chǎn)生之間的不平衡，是導(dǎo)致生物膜脂質(zhì)過(guò)氧化和嚴(yán)重細(xì)胞損傷的重要原因［8］。MDA 作為ROS 引起的脂質(zhì)過(guò)氧化的主要終產(chǎn)物之一，其水平升高提示機(jī)體的氧化應(yīng)激增強(qiáng)；SOD 及GSH-px 是機(jī)體抗氧化酶系統(tǒng)重要組成，活性升高表示機(jī)體抗氧化能力的提升；兩者之間的平衡關(guān)系可以間接反映機(jī)體氧化應(yīng)激的程度［9］。研究發(fā)現(xiàn)，肺組織中MDA、SOD 等因子參與了ALI 的發(fā)生及發(fā)展［10］。過(guò)度氧化應(yīng)激反應(yīng)是腸I/R 后的主要病理過(guò)程之一，腸I/R 局部氧自由基過(guò)度增加，隨血液循環(huán)播散至全身，激發(fā)鏈?zhǔn)街|(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，作用于Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞，最終導(dǎo)致ALI［5］。研究發(fā)現(xiàn)，小鼠腸I/R 模型中，肺水腫程度增加，肺損傷加重，肺內(nèi)MDA 增加，GSH 減少［5］。本實(shí)驗(yàn)建立小鼠腸I/R 模型發(fā)現(xiàn)，小鼠肺組織結(jié)構(gòu)明顯破壞，W/D 比值升高，肺泡內(nèi)滲出增加，肺間質(zhì)增厚，并伴有大量炎性細(xì)胞聚集，肺內(nèi)MDA 表達(dá)明顯增加，SOD 及GSH-px 明顯降低，提示小鼠腸I/R后發(fā)生ALI 以及氧化應(yīng)激反應(yīng)。

CLE 為H1R 拮 抗 劑，H1R 拮 抗 劑 可 減 輕 氧 化 應(yīng)激反應(yīng)，抑制線粒體ROS 的產(chǎn)生［11］。據(jù)報(bào)道，肥大細(xì)胞（mast cell ，MC）的激活加劇了腸I/R 誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和ALI，MC 激活可促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基產(chǎn)生，促使SOD 活性降低，MDA 水平增高［12］。而在器官缺血再灌注模型中CLE 可通過(guò)下調(diào)H1R抑制MC 活化脫顆粒作用得到了證實(shí)［13］。本研究發(fā)現(xiàn)CLE 干預(yù)后，肺組織病理?yè)p傷減輕，W/D 比值降低，抑制了小鼠腸I/R 后肺組織MDA 的表達(dá)，并增加了SOD、GSH-px 的表達(dá)，提示CLE 可能通過(guò)抑制氧化應(yīng)激減輕ALI。

炎癥反應(yīng)是腸I/R 導(dǎo)致ALI 的另一重要原因。Toll 樣受體（toll-like receptors，TLRs）是模式識(shí)別受體，主要參與機(jī)體先天免疫過(guò)程。TLR4 是TLRs家族的成員，可以識(shí)別各種配體，并激活多種信號(hào)通路，包括MAPK 和NF-κB 通路蛋白，在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用［14］。研究表明TLR4/NF-κB/TNF-α 信號(hào)傳導(dǎo)是調(diào)控腸I/R 誘導(dǎo)ALI 的關(guān)鍵途徑［15］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，腸I/R 后肺組織TLR4 蛋白表達(dá)明顯升高，肺內(nèi)NF-κB、TNF-α 含量上調(diào)，提示TLR4/NF-κB/TNF-α 炎性通路在ALI 中發(fā)揮重要作用。據(jù)報(bào)道，TLR4 基因敲除小鼠腸I/R 處理后，可減少肺內(nèi)炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)，從而減輕肺損傷，并且下調(diào)肺內(nèi)NF-κB 及血清TNF-α 水平［16］。最新研究表明，CLE 通過(guò)抑制TLR4 蛋白的表達(dá)，減輕肺［17］、心?。?8］缺血再灌注后的炎癥反應(yīng)，減輕組織損傷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)CLE 抑制了腸I/R 后肺組織TLR4 蛋白的表達(dá)并下調(diào)肺內(nèi)NF-κB 及TNF-α 水平，提示CLE 可能通過(guò)抑制TLR4/NF-κB/TNF-α通路，減輕小鼠腸I/R 致ALI的炎癥反應(yīng)。

本研究仍存在局限性，首先CLE 為H1R 拮抗劑，在本研究中未涉及H1R 在ALI中的作用研究，在后續(xù)研究中可選擇組胺受體基因沉默或敲除技術(shù)進(jìn)行鑒別研究。其次，本研究探討了氧化應(yīng)激及TLR4/NF-κB/TNF-α 信 號(hào) 通 路 在 腸I/R 后 致ALI作用，但其上游信號(hào)仍需進(jìn)一步研究。 綜上所述，CLE 可減輕小鼠腸I/R 后ALI，其機(jī)制可能與抑制肺組織氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)有關(guān)。

作者貢獻(xiàn)度說(shuō)明：

劉洋：全程參與動(dòng)物飼養(yǎng)、實(shí)驗(yàn)操作并撰寫(xiě)論文；劉婕婷：指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)操作及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析；王迎斌：指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及論文修改。

所有作者聲明不存在利益沖突。