朱彩玉，周正新，顧一帆，韓士鼎，徐 寰，王壯壯，朱 磊

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，安徽 合肥 230031；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230031）

股骨頭壞死是一種臨床常見的以骨缺血壞死和塌陷為特征的難治性骨病。盡管發(fā)病機(jī)制尚不明確，但有研究表明激素、酒精和外傷是其常見誘因［1，2］。近 年 來(lái) 隨 著 糖 皮 質(zhì) 激 素（glucocorticoids，GCs）在抗炎和免疫調(diào)節(jié)等方面的廣泛應(yīng)用，使得激素誘導(dǎo)股骨頭缺血性壞死（steroid-induced avascular necrosis of the femoral head，SANFH）的發(fā)病率逐年上升［3］。

大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為在SANFH 的病理過(guò)程中存在過(guò)度的骨細(xì)胞凋亡，而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的病理基礎(chǔ)是血管內(nèi)凝血造成的血供中斷［4-6］。因此，改善股骨頭血液供應(yīng)，抑制細(xì)胞凋亡，可能是治療股骨頭壞死的有效靶點(diǎn)之一。中藥骨痹通消顆粒，是課題組常用的治療股骨頭壞死的有效驗(yàn)方，配合手術(shù)能顯著改善保髖預(yù)后［7，8］。為進(jìn)一步證明骨痹通消顆粒的保護(hù)作用，本實(shí)驗(yàn)從血管化方面入手，研究SANFH兔模型股骨頭壞死過(guò)程中血管形成與細(xì)胞凋亡的關(guān)系，探討骨痹通消顆粒治療SANFH 的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用30 只清潔級(jí)雄性新西蘭兔，體質(zhì)量3.5～4.0 kg，購(gòu)自安徽省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心（許可證號(hào)SYXK（皖）2020-001），動(dòng)物合格證號(hào)：NO.202213656。該實(shí)驗(yàn)方案獲得安徽中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理編號(hào)：AHUCM-rabbits-2022021）。

1.1.2實(shí)驗(yàn)藥物 骨痹通消顆粒（丹參15 g，赤芍12 g，川芎、當(dāng)歸、續(xù)斷片和制淫羊藿各10 g，土鱉蟲和甘草各6 g，肉桂4 g）和注射用甲潑尼龍琥珀酸鈉（40 mg/支，Pfizer Manufacturing Belgium NV 制藥，批號(hào)：DH6371）均由安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥房提供。

1.1.3實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 脂多糖（Biosharp 生物，批號(hào)：21333172）；TUNEL 凋亡檢測(cè)試劑盒（百賽生物，批號(hào)：210419L1-1）；組織裂解液（上海碧云天生物，批號(hào)：042121210708）；SDS-PAGE 凝膠快速配制試劑盒（索萊寶生物公司，批號(hào)：CR2110087）；CD34、CYR61 和VEGF 抗體（沈陽(yáng)萬(wàn)類生物，批號(hào)：NO3073380、NO3011435、NO3070962）；β -actin、Bax 和 Bcl-2 抗 體 購(gòu) 自 Bioss 公 司（ 批 號(hào)：AH11286487、BJ10163878、BJ11026965）；細(xì) 胞RNA 快提試劑盒（廣州美基生物，批號(hào)：RJH19-01）；逆轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒（上海新貝生物，批號(hào)：F2987、F3528）；組織脫水機(jī)、包埋機(jī)、石蠟切片機(jī)（德國(guó)Microm 公司，型號(hào)：STP120、AP280-2、HM355S）；倒置熒光顯微鏡（日本奧林巴斯生物公司，型號(hào)：CX53）；WB 凝膠成像分析系統(tǒng)（美國(guó)Bio-rad 公司，型號(hào)：ChemiDoc）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（美國(guó)ABI 公司，型號(hào)：QuantStudio 5）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1動(dòng)物模型復(fù)制與干預(yù) 將30 只新西蘭兔隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組及實(shí)驗(yàn)組，每組10 只。其中模型組及實(shí)驗(yàn)組以10 μg/kg 臀肌注射內(nèi)毒素，24 h 后以20 mg/kg 甲潑尼龍琥珀酸鈉左右臀肌交替注射3次，注射間隔時(shí)間為24 h。造模成功后，實(shí)驗(yàn)組按照人與動(dòng)物等效劑量折算換算給藥量［兔等效劑量=（人藥物劑量）/60 kg × 3.3］，按4.5 g/kg 的骨痹通消顆粒進(jìn)行灌胃，模型組和對(duì)照組則給予等量生理鹽水。1 次/d，8 周后處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取出雙側(cè)股骨頭，所得樣本分開置于4%多聚甲醛及-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2HE 染色觀察組織病理學(xué)變化 將置于多聚甲醛中固定的股骨頭樣本取出使用10%甲酸溶液進(jìn)行脫鈣處理。脫鈣完成后，進(jìn)行石蠟包埋、切片、烤片，結(jié)束后對(duì)切片進(jìn)行脫蠟水化，隨后依次進(jìn)行蘇木素、伊紅染色，使用不同濃度乙醇逐級(jí)脫水，二甲苯充分浸潤(rùn)后使用中性樹膠封片，最后將切片置于光鏡下觀察并拍照，計(jì)算空骨陷窩率。

1.2.3 免疫組化檢測(cè)成血管相關(guān)蛋白表達(dá) 選取部分切片行CD34、CYR61 和VEGF 免疫組化染色定位，二甲苯脫蠟水化后進(jìn)行熱修復(fù)，3%過(guò)氧化氫去離子水處理5 min，4 ℃過(guò)夜孵育一抗，PBS 清洗后使用通用型兩步法室溫孵育二抗，20 min 后再次使用PBS 沖洗，DAB 顯色后將切片置于鏡下觀察，以目標(biāo)蛋白著棕黃色，背景不顯色時(shí)終止反應(yīng)，隨后使用蘇木素進(jìn)行復(fù)染，快速分化、水洗、PBS 藍(lán)化，脫水透明后封片，將切片置于鏡下觀察并拍攝圖像。

1.2.4 TUNEL 法檢測(cè)股骨頭區(qū)細(xì)胞凋亡情況 將股骨頭樣本制作成石蠟組織切片，室溫脫蠟后，使用20 μg/mL 蛋 白 酶K 溶 液 通 透 組 織，PBS 充 分 漂洗后加入TUNEL 反應(yīng)混合液。用蓋玻片使反應(yīng)液均勻覆蓋樣本并平放于濕盒內(nèi)，37 ℃恒溫箱孵育2 h 后去掉反應(yīng)液，PBS 浸泡潤(rùn)洗2 次。使用0.1%Triton X-100 緩沖液（含5 mg/mL BSA）清洗切片以降低背景，隨后在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況。

1.2.5 Western blot 檢 測(cè)Bax 和Bcl-2 蛋 白 表 達(dá) 情況 將置于-80 ℃冰箱的股骨頭樣本置于組織研磨儀中研磨后，提取骨組織總蛋白，BCA 法測(cè)定蛋白濃度后，按每孔上樣10 μL、marker 5 μL 進(jìn)行凝膠電泳，半濕法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜上并使用5%脫脂牛奶封閉2 h，4 ℃孵育一抗并配搖床過(guò)夜。隔天室溫配搖床孵育二抗2 h，后使用TBST 溶液充分洗膜以降低背景，將PVDF 膜浸潤(rùn)顯影液并置于蛋白質(zhì)印跡系統(tǒng)中檢測(cè)圖像，采用Image J 軟件對(duì)條帶進(jìn)行分析并計(jì)算目標(biāo)蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.6 RT-qPCR 檢 測(cè)VEGF、eNOs、Bax及Bcl-2 mRNA 表達(dá)情況 將股骨頭組織樣本經(jīng)低溫研磨后使用雙柱離心法快速提取細(xì)胞總RNA 并測(cè)其純度。根據(jù)目的基因在GeneBank 中的己知序列（表1），按照逆轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒說(shuō)明，以β-actin 為內(nèi)參，設(shè)置反應(yīng)程序，將總RNA 放入q-PCR 儀中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增及定量檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用2-ΔΔCt法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

表1 各基因引物序列Tab 1 Primer sequences of each gene

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理。計(jì)量資料使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）進(jìn)行描述，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組兔股骨頭組織病理學(xué)結(jié)果

SANFH 模型復(fù)制8 周后模型組兔骨小梁面積明顯減少且存在嚴(yán)重狹窄或斷裂情況，髓腔內(nèi)細(xì)胞種類減少，空骨陷窩數(shù)較對(duì)照組明顯增多（P＜0.01）。經(jīng)骨痹通消顆粒干預(yù)治療后，實(shí)驗(yàn)組兔髓腔內(nèi)細(xì)胞種類多且豐富，骨小梁結(jié)構(gòu)較模型組完整且空骨陷窩率明顯低于模型組（P＜0.01）。見圖1、表2。

表2 各組兔股骨頭組織空骨陷窩率比較（n=3，±s）Tab 2 Comparison of hollow bone lacunae rate of rabbit femoral head tissues in each group（n=3，±s）

表2 各組兔股骨頭組織空骨陷窩率比較（n=3，±s）Tab 2 Comparison of hollow bone lacunae rate of rabbit femoral head tissues in each group（n=3，±s）

注：與對(duì)照組相比，**P＜0.01；與模型組對(duì)比，##P＜0.01。

空骨陷窩率（%）5.401±0.226 19.263±0.960**9.414±0.424##397.398 P＜0.01組別對(duì)照組模型組實(shí)驗(yàn)組FP

圖1 各組兔股骨頭組織病理學(xué)觀察（HE×200）Fig 1 Histopathological observation of femoral head in each group（HE×200）

2.2 免疫組化染色結(jié)果

各組股骨頭組織病理切片均可觀察到CD34、CYR61、和VEGF 蛋白產(chǎn)生不同程度的棕黃色陽(yáng)性表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CD34、CYR61 和VEGF 蛋白水平在骨股骨頭組織中均表現(xiàn)為模型組顯著低于對(duì)照組；與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組免疫組化定位染色的結(jié)果得到有效改善，股骨頭組織中成血管相關(guān)因子的表達(dá)增多，但與正常組相比仍有一定差距（圖2）。

圖2 各組兔股骨頭組織免疫組化染色觀察（×400）Fig 2 Immunohistochemical staining of rabbit femoral head tissues in each group（×400）

2.3 各組兔股骨頭區(qū)細(xì)胞凋亡情況

TUNEL 染色下凋亡細(xì)胞核被染成棕黃色呈單個(gè)細(xì)胞或散在存在，多位于病變組織與正常組織交界處。與對(duì)照組相比，模型組中凋亡細(xì)胞數(shù)增多且細(xì)胞核著色較深，而經(jīng)骨痹通消顆粒治療后實(shí)驗(yàn)組股骨頭細(xì)胞凋亡情況明顯好轉(zhuǎn)（P＜0.01）（圖3、表3）。

圖3 各組兔股骨頭組織細(xì)胞凋亡染色情況（TUNEL×400）Fig 3 Apoptosis of rabbit femoral head tissues in each group（TUNEL×400）

表3 各組兔股骨頭區(qū)細(xì)胞凋亡情況比較（n=3，±s）Tab 3 Comparison of cell apoptosis in femoral head area among all groups（n=3，±s）

表3 各組兔股骨頭區(qū)細(xì)胞凋亡情況比較（n=3，±s）Tab 3 Comparison of cell apoptosis in femoral head area among all groups（n=3，±s）

注：與對(duì)照組相比，**P＜0.01；與模型組對(duì)比，##P＜0.01。

凋亡率（%）3.703±0.183 20.113±0.679**8.970±0.349##1 025.568 P＜0.01組別對(duì)照組模型組實(shí)驗(yàn)組FP

2.4 股骨頭組織中Bax 和Bcl-2 蛋白表達(dá)情況

由Westernblot 結(jié)果可知，模型組中促凋亡蛋白Bax 表達(dá)顯著增加而抗凋亡蛋白Bcl-2 表達(dá)則受到抑制（P＜0.01），骨痹通消顆粒干預(yù)治療后，實(shí)驗(yàn)組Bax 和Bcl-2 蛋白表達(dá)水平得到與模型組相反的實(shí)驗(yàn)結(jié)果（P＜0.01）（圖4、5，表4）。

圖4 各組兔股骨頭組織蛋白Bax、Bcl-2 及β-actin 的免疫印跡分析Fig 4 Western blotting analysis of Bax，Bcl-2 and β-actin in each group

圖5 使用內(nèi)參蛋白校正后各組蛋白的相對(duì)表達(dá)量Fig 5 Relative expression levels of each group of proteins after correction with internal reference proteins

表4 各組股骨頭組織目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平（n=3，±s）Tab 4 The expression level of target protein in femoral head tissue of each group（n=3，±s）

表4 各組股骨頭組織目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平（n=3，±s）Tab 4 The expression level of target protein in femoral head tissue of each group（n=3，±s）

組別對(duì)照組模型組實(shí)驗(yàn)組F P Bax 0.523±0.016 2.018±0.029 1.073±0.035 2235.454＜0.01 Bcl-2 1.285±0.020 0.627±0.023 0.988±0.035 445.162＜0.01

2.5 股骨頭組織中VEGF、eNOs、Bcl-2 及Bax 等mRNA 表達(dá)情況

與對(duì)照組相比，模型組股骨頭組織中血管生成相關(guān)因子VEGF 和eNOs、抗凋亡基因Bcl-2 的表達(dá)水平顯著降低，相反的促凋亡基因Bax 表達(dá)升高（P＜0.01）。骨痹通消顆粒干預(yù)后，實(shí)驗(yàn)組Bax mRNA表 達(dá) 受 到 抑 制，VEGF、eNOs 及Bcl-2 mRNA 表 達(dá)水平較模型組明顯升高（P＜0.01）（圖6、表5）。

表5 各組兔股骨頭組織mRNA 的表達(dá)水平（±s，n=3）Tab 5 mRNA expression level in femoral head tissue of each group（±s，n=3）

表5 各組兔股骨頭組織mRNA 的表達(dá)水平（±s，n=3）Tab 5 mRNA expression level in femoral head tissue of each group（±s，n=3）

組別對(duì)照組模型組實(shí)驗(yàn)組F P VEGF 0.957±0.087 0.456±0.070 0.786±0.038 42.001＜0.01 eNOs 1.271±0.065 0.697±0.119 0.954±0.044 36.620＜0.01 Bcl-2 1.002±0.021 0.585±0.064 0.924±0.020 89.188＜0.01 Bax 1.008±0.065 1.549±0.107 1.194±0.061 35.056＜0.01

圖6 各組兔股骨頭組織VEGF、eNOs、Bcl-2 及Bax mRNA表達(dá)水平Fig 6 mRNA expression of VEGF，eNOs，Bcl-2 and Bax in each group

3 討論

目前關(guān)于股骨頭壞死的幾種發(fā)病機(jī)制中，GCs誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致股骨頭骨量減少甚至塌陷依舊受到廣泛關(guān)注［9，10］。臨床上針對(duì)SANFH 的治療方案包括非手術(shù)治療、保髖手術(shù)及髖關(guān)節(jié)置換術(shù)等，其中全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)也被認(rèn)為是SANFH 患者的最后手段［11］。有文獻(xiàn)表明，GCs 誘導(dǎo)的股骨頭缺血壞死的發(fā)病率逐漸升高且發(fā)病年齡趨于年輕化，這意味著大多數(shù)中青年患者需要考慮術(shù)后人工髖關(guān)節(jié)假體的耐用性及翻修的可行性［5，12］。因此任何能推遲或避免行髖關(guān)節(jié)置換術(shù)的方法都是有意義的。

盡管股骨頭壞死的病因病機(jī)眾多，但其共同特征都是股骨頭局部血供中斷導(dǎo)致骨細(xì)胞缺血、壞死或凋亡以及隨之出現(xiàn)的機(jī)體修復(fù)反應(yīng)，進(jìn)而出現(xiàn)骨量減少甚至股骨頭塌陷的病理過(guò)程［2，13］。有研究表明，長(zhǎng)期或大劑量使用GCs 會(huì)損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，引起血管內(nèi)高凝狀態(tài)，造成股骨頭血供中斷；此外，在GCs 的刺激誘導(dǎo)下，細(xì)胞內(nèi)的凋亡途徑被激活，最 終 引 起 骨 細(xì) 胞 大 面 積 凋 亡［14，15］。Li 等［16］認(rèn) 為 缺血、壞死及塌陷是股骨頭壞死病程中的不同病理階段，缺血是最先發(fā)生并且是可逆的過(guò)程，而后兩者均不可逆。CD34 和CYR61 作為血管形成的重要標(biāo)志物和調(diào)節(jié)劑，不僅能夠加速微血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附、遷移、聚集形成血管，并且能夠調(diào)控造血相關(guān)干細(xì) 胞，促 進(jìn) 細(xì) 胞 增 殖 和 分 化，實(shí) 現(xiàn) 血 管 再 生［17，18］。VEGF 是一種高度特異性的促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，具有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖和血管形成等作用［19］。研究發(fā)現(xiàn)VEGF 及eNOs 通過(guò)血管形成參與骨的發(fā)育，通過(guò)血管的增生加速骨的血管化，對(duì)臨床抗骨質(zhì)疏松具有重要意義［20］。

當(dāng)代醫(yī)家劉柏齡認(rèn)為股骨頭壞死的發(fā)生以肝腎虧虛為主要病因，氣滯血瘀為關(guān)鍵因素，正虛邪侵為重要病因［21］。因此中醫(yī)治療中，大多強(qiáng)調(diào)補(bǔ)腎陽(yáng)、強(qiáng)筋骨、活血化瘀等治療方法。研究表明，補(bǔ)腎活血類中藥用于治療股骨頭壞死，不僅具有鮮明的特色，而且療效確切。鮑嘉敏等［22］研究發(fā)現(xiàn)，三七總皂苷能夠上調(diào)SANFH 模型兔的VEGF 及受體蛋白的表達(dá)，促進(jìn)血管新生，對(duì)GCs 誘導(dǎo)的股骨頭壞死發(fā)揮積極的保護(hù)作用。Chen 等［23］實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)桃紅四物湯通過(guò)調(diào)節(jié)動(dòng)物模型VEGF 的表達(dá)，以及顯著抑制細(xì)胞凋亡，能夠有效延緩SANFH 的進(jìn)程。徐輝輝等［24］通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)富血小板血漿聯(lián)合桃紅四物湯能夠上調(diào)SANFH 模型大鼠股骨頭組織中VEGF 表達(dá)，改善股骨頭局部血運(yùn)，促進(jìn)壞死骨修復(fù)。在本實(shí)驗(yàn)中，SANFH 兔模型復(fù)制成功后，HE染色可見模型組股骨頭內(nèi)骨小梁出現(xiàn)明顯的狹窄或斷裂，髓腔內(nèi)脂肪細(xì)胞增多且有融合的跡象。經(jīng)骨痹通消顆粒灌喂治療后，骨小梁面積增多，空骨陷窩率明顯下降。CD34、CYR61、VEGF 和eNOs表達(dá)水平較模型組明顯提高。

研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)線粒體途徑調(diào)節(jié)促凋亡蛋白Bax 與抗凋亡蛋白Bcl-2 可能是促進(jìn)細(xì)胞存活的潛在機(jī)制［25，26］。在線粒體途徑中，Bcl-2 家族蛋白調(diào)控線粒體相關(guān)凋亡因子的釋放過(guò)程，其中Bax/Bcl-2的比值決定細(xì)胞的存活狀態(tài)［27］。當(dāng)細(xì)胞接收到由激素誘導(dǎo)的凋亡信號(hào)時(shí)，胞質(zhì)中Bax 表達(dá)上調(diào)并易位到線粒體外膜，促使線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔過(guò)度開放并釋其他放凋亡蛋白，進(jìn)而凋亡體形成，誘導(dǎo)成骨細(xì)胞大面積凋亡［28］。而Bcl-2 正常情況下定位于線粒體外膜，能不斷的將易位的Bax 重新移回胞質(zhì)中，從而促進(jìn)細(xì)胞存活。但GCs 暴露下Bcl-2 表達(dá)減少，其穩(wěn)定線粒體膜功能的能力下降，細(xì)胞凋亡增加，最終導(dǎo)致骨丟失甚至骨壞死［29］。在本實(shí)驗(yàn)中，脂多糖及GCs 聯(lián)合誘導(dǎo)促使SANFH 兔模型股骨頭區(qū)細(xì)胞凋亡增多，股骨頭出現(xiàn)不同程度壞死及塌陷。Western blot 結(jié)果表明，GCs 可誘導(dǎo)骨組織中促凋亡蛋白Bax 高表達(dá)和抗凋亡蛋白Bcl-2 低表達(dá)，造成骨細(xì)胞凋亡增加。實(shí)驗(yàn)組使用骨痹通消顆粒干預(yù)治療后，股骨頭組織中骨細(xì)胞大面積凋亡情況得到改善，Bax 及Bcl-2 mRNA 的異常表達(dá)也被骨痹通消顆粒所逆轉(zhuǎn)。

綜上所述，GCs 誘導(dǎo)的股骨頭壞死病理過(guò)程中存在著股骨頭局部血供異常及骨細(xì)胞的過(guò)度凋亡。骨痹通消顆粒對(duì)GCs 環(huán)境中骨細(xì)胞缺血凋亡具有明顯的保護(hù)作用，能夠上調(diào)CD34、CYR61 和VEGF表達(dá)，促進(jìn)血管新生，有利于壞死骨修復(fù)；同時(shí)骨痹通消顆粒通過(guò)調(diào)控Bax/Bcl-2 復(fù)合體，能夠穩(wěn)定線粒體膜的功能，減輕由GCs 誘導(dǎo)的骨細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮治療SANFH 的作用。

作者貢獻(xiàn)度說(shuō)明：

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為朱磊，實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)為周正新、韓世鼎，實(shí)驗(yàn)實(shí)施為朱彩玉、顧一帆、王壯壯，資料收集為徐寰，朱彩玉成文，朱磊審校。

文章內(nèi)容不涉及相關(guān)利益沖突。