夏秋霞，段騰飛，田元強(qiáng)，柳雅麗

宿州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，安徽宿州,234000

龍葵別名苦葵，水茄，是一年生草本植物[1]，廣泛分布于亞、歐、美洲的溫帶和熱帶地區(qū)。成熟的龍葵果中含有蛋白質(zhì)、有機(jī)酸、生物堿、皂苷、酚類物質(zhì)以及多糖等功能性成分[2-5],具有良好的抑菌、抗腫瘤和抗氧化功效[6-9]。乳酸菌極為廣泛地分布在自然界中，將乳酸菌應(yīng)用于飲料制品具有較高研究價(jià)值[10]。研究結(jié)果表明食品經(jīng)發(fā)酵后抗氧化性增強(qiáng)[11]，主要是因?yàn)槲⑸锏拇x會(huì)使食品中酚類化合物降解[12]，使得抗氧化性物質(zhì)增加。近年來對(duì)龍葵果發(fā)酵方面的研究日趨增加，研究開發(fā)龍葵果果酒、果醋和酸奶等發(fā)酵類產(chǎn)品越來越多[13-14]。實(shí)驗(yàn)以成熟龍葵果為原料，選用嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)發(fā)酵龍葵果汁，先進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，通過測定感官評(píng)定和活菌數(shù)作為評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)其進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，以期得到一種感官評(píng)分高，富含乳酸菌且具有抗氧化性的龍葵果汁，為今后在龍葵果食品中的研究提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

材料：嗜酸乳桿菌CICC20250(中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心)，龍葵果(宿州市大潤發(fā)超市)。MRS肉湯、水楊酸鈉等均為分析純。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

722S型分光光度計(jì)(馳唐精密儀器有限公司)；ZXMP-R1150型恒溫培養(yǎng)箱(廣州番禺旭東坂田電子有限公司)；SW-CJ-1CU型超凈臺(tái)(蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程

龍葵果清洗→榨汁→過濾→調(diào)配→滅菌→接種→發(fā)酵→測定

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

取保存的嗜酸乳桿菌CICC20250于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h。測定活菌數(shù)達(dá)到2×108CFU/mL，置于-4 ℃冰箱下保存?zhèn)溆?。探究接菌量體積分?jǐn)?shù)(0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%)、發(fā)酵時(shí)間(16 h，18 h，20 h，22 h，24 h)、發(fā)酵溫度(33 ℃，35 ℃，37 ℃，39 ℃，41 ℃)和可溶性固形物含量質(zhì)量分?jǐn)?shù)(9%，11%，13%，15%，17%)對(duì)龍葵果汁品質(zhì)的影響。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)指標(biāo)

感官評(píng)分。選擇15位專業(yè)評(píng)定人員組成評(píng)定小組，進(jìn)行感官評(píng)定(表1)。

表1 感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[15-16]

活菌數(shù)測定。采用傾注平板計(jì)數(shù)法[17]，取發(fā)酵果汁稀釋到10-5、10-6、10-7，然后取1 mL稀釋果汁加入培養(yǎng)皿中，并倒入MRS固體培養(yǎng)基混勻，對(duì)每個(gè)梯度稀釋果汁進(jìn)行三組平行實(shí)驗(yàn)，37 ℃培養(yǎng)48 h，進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1.2.4 響應(yīng)面分析

以-1，0，1代表自變量水平，發(fā)酵龍葵果汁活菌數(shù)和感官評(píng)分為響應(yīng)面值進(jìn)行優(yōu)化處理(表2)。

表2 因素水平表

1.2.5 發(fā)酵龍葵果汁理化指標(biāo)

在最優(yōu)發(fā)酵條件下每隔2 h取樣，測定發(fā)酵龍葵果汁中黃酮(硝酸鋁法測定)，總酚(福林酚法)，pH，活菌數(shù)等。

1.2.6 發(fā)酵龍葵果汁抗氧化性研究

(1)發(fā)酵龍葵果汁中羥自由基清除能力的測定

H2O2/Fe體系反應(yīng)法：羥自由基清除能力={[A0-(A1-A2)/A0}×100%

(2)發(fā)酵龍葵果汁中超氧陰離子自由基清除能力的測定

采用鄰苯三酚自氧化法：超氧陰離子自由基清除能力={[A0-(A1-A2)]/A0}×100%

2 結(jié)果分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 接菌量對(duì)發(fā)酵龍葵果汁的影響

嗜酸乳桿菌發(fā)酵龍葵果汁在接菌量從0.5%～2.5%的區(qū)間里變化明顯(見圖1)，接入1.5%嗜酸乳桿菌時(shí)龍葵果汁中活菌數(shù)到達(dá)最大值9.0×107CFU/mL并且感官評(píng)分達(dá)到85分。在接菌量1.0%～1.5%的區(qū)間里，龍葵果汁中的活菌數(shù)增加12.5%，增加明顯。感官評(píng)分從72分增加到85分，增加18.1%，口感酸澀變化明顯，嗜酸乳桿菌發(fā)酵效果明顯，口感優(yōu)良。接菌量大于1.5%時(shí)，龍葵果經(jīng)過發(fā)酵后果汁酸度較高，果汁出現(xiàn)渾濁，部分乳酸菌死亡，活菌數(shù)下降，最終趨于穩(wěn)定，果汁口感變差且無果汁香氣。綜合考慮在接菌量1.5%時(shí)嗜酸乳桿菌發(fā)酵龍葵果汁的效果最好。

圖1 嗜酸乳桿菌接菌量對(duì)龍葵果汁發(fā)酵的影響

2.1.2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵龍葵果汁的影響

從圖2得到，發(fā)酵時(shí)間22 h時(shí)龍葵果汁中嗜酸乳桿菌菌數(shù)和感官評(píng)分達(dá)到最高值分別為1.58×108CFU/mL和88分，果汁口感酸甜清香。在20～22 h內(nèi)龍葵果汁中嗜酸乳桿菌從6.8×107CFU/mL增加到1.58×108CFU/mL提高32.7%，感官評(píng)分從78分增加到88分，增加了12.8%，感官評(píng)分差距顯著。隨著時(shí)間延長，龍葵果汁中嗜酸乳桿菌的活性下降，在24 h時(shí)活菌數(shù)下降，果汁渾濁口感粗糙。綜合考慮選擇發(fā)酵時(shí)間22 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)嗜酸乳桿菌發(fā)酵龍葵果汁的影響

2.1.3 溫度對(duì)發(fā)酵龍葵果汁的影響

從圖3得到，在37 ℃時(shí)龍葵果汁中嗜酸乳桿菌達(dá)到最大值1.58×108CFU/mL，嗜酸乳桿菌活性較佳，感官評(píng)分90分，龍葵果汁口感清香，回味酸甜可口。發(fā)酵龍葵果汁在35 ℃～37 ℃時(shí)，嗜酸乳桿菌從1.18×108CFU/mL增加到1.58×108CFU/mL，增加了33.9%，感官評(píng)分從75分增加到90分。在37 ℃～41 ℃，感官評(píng)分和活菌數(shù)逐漸降低，口感酸澀，顏色渾濁差距較為明顯，可能是在超過最適發(fā)酵溫度后嗜酸乳桿菌活性降低并且少量死亡，口味也逐漸下降，變得苦澀。綜合考慮選擇發(fā)酵溫度37 ℃進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖3 溫度對(duì)乳酸菌發(fā)酵龍葵果汁的影響

2.1.4 可溶性固形物對(duì)發(fā)酵龍葵果汁的影響

從圖4得到，可溶性固形物(Soluble solid content,SSC)為13%時(shí)，發(fā)酵龍葵果汁中嗜酸乳桿菌為1.93×108CFU/mL，感官評(píng)分91分，味感清甜，入口微酸，果香宜人。SSC為9%～11%時(shí)，發(fā)酵龍葵果汁中嗜酸乳桿菌由1.42×108CFU/mL增至1.74×108CFU/mL，增加22.5%。SSC在11%～13%里感官評(píng)分從74分增加到91分，味感變化明顯，果香清透，入口微酸，色澤明顯提高。SSC在13%～17%里龍葵發(fā)酵果汁感官評(píng)分以及嗜酸乳桿菌數(shù)下降，風(fēng)味酸澀，整體口感變化較大。SSC為17%時(shí)果汁口感酸澀有明顯渾濁沉淀，綜合考慮SSC在13%時(shí)嗜酸乳桿菌發(fā)酵龍葵果汁最有優(yōu)勢(shì)。

圖4 可溶性固形物對(duì)乳酸菌發(fā)酵龍葵果汁影響

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 模型建立及其顯著性檢驗(yàn)

自變量選擇接菌量、果汁發(fā)酵時(shí)間、果汁發(fā)酵溫度以及可溶性固形物含量，響應(yīng)值選擇龍葵果汁中活菌數(shù)和感官評(píng)分(見表3)，進(jìn)行龍葵果汁發(fā)酵工藝優(yōu)化。

表3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)表

2.2.2 活菌數(shù)方差分析

依據(jù)分析，活菌數(shù)=190.40-2.17×A+5.92×B-8.92×C-5.00×D+25.50×A×B+5.75×A×C-6.75×A×D+6.00×B×C-5.25×B×D-6.00×C×D-40.41×A2-57.78×B2-53.28×C2-44.91×D2

依據(jù)表4所得，試驗(yàn)?zāi)Ｐ蚉<0.000 1極顯著，失擬項(xiàng)P=0.489 1>0.05，差異不顯著，說明實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ涂煽俊Ｍ瑫r(shí)R2=0.992 3，矯正R2=0.984 7，C.V=4.64%<5.00%，證明實(shí)驗(yàn)誤差較小，實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ途哂锌尚哦?。果汁中活菌?shù)受4個(gè)不同因素干擾強(qiáng)弱程度為C>B>D>A，表明溫度對(duì)果汁中活菌數(shù)影響最為顯著。C、AB、A2、B2、C2、D2對(duì)龍葵果汁活菌數(shù)影響極顯著(P<0.01)，B、D、AC、AD、BC對(duì)龍葵果汁活菌數(shù)影響顯著(P<0.05)。

表4 活菌數(shù)方差分析表

2.2.3 感官評(píng)分方差分析

依據(jù)分析，感官評(píng)分=96.60-0.25×A+3.25×B-4.50×C-3.00×D+11.00×A×B+3.25×A×C-3.00×A×D+5.50×B×C-2.25×B×D-1.75×C×D-16.38×A2-23.13×B2-21.01×C2-17.76×D2

依據(jù)表5得，試驗(yàn)?zāi)Ｐ蜆O顯著(P<0.000 1)，失擬項(xiàng)P=0.178 3>0.05，差異不顯著，說明方程模擬的比較好，模型數(shù)據(jù)具有可靠性。同時(shí)R2=0.987 1，矯正R2=0.974 2，C.V=4.19%<5.00%，證明實(shí)驗(yàn)誤差較小，實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有可信度。果汁感官評(píng)分受四個(gè)不同因素影響程度為C>B>D>A，表明溫度對(duì)果汁中感官評(píng)分影響最為顯著。C、AB、A2、B2、C2、D2對(duì)龍葵果汁感官評(píng)估干擾極顯著(P<0.05)，B、D、AC、AD、BC對(duì)龍葵果汁感官評(píng)估分?jǐn)?shù)干擾顯著(P<0.05)。

表5 感官評(píng)分方差分析表

2.3 發(fā)酵龍葵果汁理化性質(zhì)研究

2.3.1 龍葵果汁pH值變化

從圖5看出，在0～22 h時(shí)，發(fā)酵龍葵果汁pH從4.51減少到3.48，減少22.8%。在0～4 h時(shí)，嗜酸乳桿菌活菌數(shù)較少，發(fā)酵效果不明顯，產(chǎn)生乳酸較少，pH下降不明顯。在6～14 h時(shí)測得龍葵果汁pH下降顯著，這與嗜酸乳桿菌明顯增加產(chǎn)生大量乳酸有關(guān)。在18～24 h時(shí)，活菌數(shù)趨于穩(wěn)定，果汁pH下降不明顯。綜合得到，龍葵果汁發(fā)酵過程中pH值下降，符合果汁理化指標(biāo)，果汁酸甜可口，風(fēng)味改善明顯。

圖5 最優(yōu)發(fā)酵條件下龍葵發(fā)酵果汁pH變化

2.3.2 龍葵果汁總酚含量的變化

從圖6得到，在0～22 h發(fā)酵龍葵果汁中總酚含量從1.03 μg/mL增至1.29 μg/mL，增加了25.2%，上升明顯，22～24 h變化不明顯，趨于穩(wěn)定。這是由于嗜酸乳桿菌在代謝過程中積累的糖基水解酶將黃酮類相應(yīng)的苷元等降解使得發(fā)酵的龍葵果汁中總酚含量上升[10]。最優(yōu)發(fā)酵條件下隨著嗜酸乳桿菌的代謝，果汁的總酚含量上升明顯，發(fā)酵效果良好。

圖6 最優(yōu)發(fā)酵條件下龍葵發(fā)酵果汁總酚變化

2.3.3 龍葵果汁黃酮含量的變化

從圖7得到，在龍葵發(fā)酵果汁發(fā)酵條件0～22 h黃酮從1.20 mg/g增至1.57 mg/g，增加了30.8%，增加效果明顯，24 h時(shí)變化不明顯，與活菌數(shù)增加和生物降解提高，產(chǎn)生酶類使得龍葵果細(xì)胞壁基質(zhì)分解使得黃酮增加有關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明最優(yōu)發(fā)酵條件下龍葵果汁黃酮含量增加明顯，發(fā)酵效果良好。

圖7 最優(yōu)發(fā)酵條件下龍葵發(fā)酵果汁黃酮變化

2.3.4 龍葵果汁中活菌數(shù)的變化

由圖8可知，在最優(yōu)發(fā)酵條件下，龍葵果汁中嗜酸乳桿菌活菌數(shù)在0～22 h，從2.2×107CFU/mL增加到1.91×108CFU/mL，22～24 h時(shí)趨于穩(wěn)定，增加效果明顯。在0～4 h發(fā)酵果汁中活菌數(shù)從2.2×107CFU/mL增加至4.2×107CFU/mL，這與嗜酸乳桿菌開始活性不高、繁殖速度較慢有關(guān)，增加不明顯。在4～22 h發(fā)酵果汁中活菌數(shù)增加十分明顯，這與嗜酸乳桿菌活性增加、繁殖速度加快有關(guān)。

圖8 最優(yōu)發(fā)酵條件下龍葵發(fā)酵果汁活菌數(shù)變化

2.4 龍葵果汁抗氧化性研究

從圖9中得到，未發(fā)酵龍葵果汁與最優(yōu)條件下發(fā)酵龍葵果汁羥自由基清除率分別為21.2%和54.5%，龍葵果發(fā)酵后羥自由基清除率提高33.3%，差異顯著(P<0.05)。未發(fā)酵龍葵果汁與最優(yōu)條件下發(fā)酵龍葵果汁超氧陰離子自由基清除率分別為18.6%和51.65%，差異顯著(P<0.05)，龍葵果發(fā)酵后超氧陰離子自由基清除率提高33.1%，與發(fā)酵龍葵果汁富含嗜酸乳桿菌，代謝增強(qiáng)和具有良好抗氧化性的酚類和黃酮物質(zhì)有關(guān)[16]。

圖9 發(fā)酵龍葵果汁中自由基清除能力

3 結(jié) 論

經(jīng)過龍葵果汁發(fā)酵單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面分析表明最佳發(fā)酵工藝條件為：嗜酸乳桿菌接種量1.5%，發(fā)酵溫度37 ℃，發(fā)酵時(shí)間22 h，可溶性固形物含量13%。發(fā)酵后果汁中嗜酸乳桿菌活菌數(shù)為1.94×108CFU/mL，感官評(píng)分為97分。未發(fā)酵龍葵果汁與最優(yōu)條件下發(fā)酵龍葵果汁羥自由基清除率分別為21.2%和54.5%、超氧陰離子自由基清除率分別為18.6%和51.65%，發(fā)酵后果汁抗氧化性顯著提高，發(fā)酵改善果汁效果良好。此外，發(fā)酵后龍葵果汁總酚含量達(dá)到1.26 μg/mL，黃酮含量達(dá)到1.57 mg/g。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明龍葵果汁接種乳酸菌發(fā)酵后活性成分含量和抗氧化性得到改善。