車明哲，王晨曦，侯柄竹，王紅波，漆小泉

（1.中國(guó)科學(xué)院植物研究所，北京 100093；2.江漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430056）

艾（Artemisia argyi）為我國(guó)傳統(tǒng)的中草藥，具有良好的散寒、溫經(jīng)止血、抗炎、抗菌、抗氧化和降血糖等生理功效[1-5]，其主要化學(xué)成分為揮發(fā)油類、黃酮類、酚酸類和糖類。研究顯示，艾中揮發(fā)油類成分提供其主要的抑菌作用，包括5-苯基-1，3-丙二烯、茵陳素、樟腦、沉香醇、石竹烯氧化物、1，8-桉樹(shù)酚、α-萜品醇-8和冰片等[6-11]。湖北蘄春生產(chǎn)的艾品質(zhì)優(yōu)良，特稱為“蘄艾（Artemisia argyi var.argyi cv.Qiai）”。目前對(duì)蘄艾主要抑菌活性成分的研究還相對(duì)較少。

艾草精油的提取主要有傳統(tǒng)的水蒸氣蒸餾法（煎煮法）、超聲波輔助提取法、冷壓法、亞臨界萃取法和超臨界萃取法等[10]。水蒸氣蒸餾法提取得到的有效成分主要是揮發(fā)油，因其操作簡(jiǎn)單、儀器簡(jiǎn)單等特點(diǎn)在實(shí)際生產(chǎn)中被廣泛應(yīng)用。有研究分別以50%乙醇、50%甲醇、50%石油醚、50%丙酮有機(jī)溶劑及蒸餾水作為溶劑對(duì)艾草進(jìn)行精油提取，發(fā)現(xiàn)用水作為提取劑時(shí)艾草提取物對(duì)供試菌的抑菌圈直徑最大，抑菌效果較好[12]。本研究采用水蒸氣蒸餾法對(duì)2017年—2020年4年采集的蘄艾進(jìn)行精油提取，通過(guò)單因素試驗(yàn)，對(duì)出油率影響較大的浸泡時(shí)間、料液比和提取時(shí)間3個(gè)因素進(jìn)行考察，并在此基礎(chǔ)上通過(guò)正交試驗(yàn)，獲得蘄艾精油的最優(yōu)提取工藝。此外，還利用GC-MS結(jié)合質(zhì)譜檢索標(biāo)準(zhǔn)庫(kù)分析鑒定蘄艾精油的主要成分，并利用大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌對(duì)蘄艾精油的抑菌效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。本研究為高效提取蘄艾精油提供了參考，為進(jìn)一步研究蘄艾精油的有效抑菌成分及利用抑菌成分進(jìn)行相關(guān)抑菌產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 試驗(yàn)材料

1.1 蘄艾材料

本研究所有蘄艾材料均由湖北蘄艾堂科技有限公司采集及提供，具體包括2017年艾葉，2018年艾葉，2019年艾葉，2020年蘄艾粉和2020年艾絨。

1.2 供試菌種

ATCC25922大腸埃希氏菌（CGMCC 1.2385）；ATCC6538金黃色葡萄球菌（CGMCC 1.2465）；ATCC10231白色念珠菌（CGMCC 2.2086）。以上菌種均購(gòu)于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC）。

1.3 試驗(yàn)儀器

GC-MS儀由本實(shí)驗(yàn)室提供（Gas Chromatograph，7890B，Agilent Technologies；Mass Spectrometer，5977A，Agilent Technologies），檢測(cè)結(jié)果通過(guò)Agilent分析軟件Qualitative Analysis of MassHunter Acquisition Data進(jìn)行化合物分析。

2 試驗(yàn)方法

2.1 蘄艾精油提取與水相提取方法

采用2010版《中國(guó)藥典》一部附錄XD甲法進(jìn)行水蒸氣蒸餾法浸提，提取裝置和測(cè)量裝置均為本實(shí)驗(yàn)室按照《中國(guó)藥典》一部附錄XD甲法采購(gòu)并組建，裝置由上至下依次為球形冷凝管、揮發(fā)油提取器、圓底燒瓶和電子加熱器[13]。將物料粉碎后，準(zhǔn)確稱取質(zhì)量，置于500 mL圓底燒瓶中，加入一定量蒸餾水，混合均勻后，浸泡，連接揮發(fā)油提取器與球形冷凝管。向揮發(fā)油提取器中加入蒸餾水使充滿其刻度部分，直至從彎口溢出到圓底燒瓶。在電子恒溫加熱器中緩慢加熱至沸騰，保持沸騰狀態(tài)直至精油量不再增加。停止加熱后根據(jù)精油量讀取刻度，計(jì)算精油含量。待精油提取完成后，將圓底燒瓶?jī)?nèi)的料液過(guò)濾，得到蘄艾水相提取液。

2.2 蘄艾精油提取工藝優(yōu)化

2.2.1 不同年份不同處理方式下蘄艾精油含量比較

采用上述方法對(duì)蘄艾粉、艾絨、不同年份的艾葉等材料進(jìn)行精油提取測(cè)定，初步設(shè)定料液比1∶14，浸泡12 h，提取6 h，比較不同年份不同處理方式下艾葉精油含量。

2.2.2 單因素試驗(yàn)

精油提取率主要與浸泡時(shí)間、料液比、提取時(shí)間等3個(gè)因素有關(guān)。

（1）浸泡時(shí)間的考察。準(zhǔn)確稱取出油率最高年份的樣品30 g，按照料液比1∶12的比例向圓底燒瓶中加入蒸餾水，分別浸泡0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h后，加熱煮沸4 h，記錄精油獲得量并計(jì)算其出油率，每個(gè)條件重復(fù)3次。

（2）料液比的考察。準(zhǔn)確稱取出油率最高年份的樣品30 g，按照料液比1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16的比例向圓底燒瓶中加入蒸餾水，浸泡12 h后，加熱煮沸4 h，記錄精油獲得量并計(jì)算其出油率，每個(gè)條件重復(fù)3次。

（3）提取時(shí)間的考察。準(zhǔn)確稱取出油率最高年份的樣品30 g，按照料液比1∶12的比例向圓底燒瓶中加入蒸餾水，浸泡12 h后，加熱煮沸1 h、2 h、4 h、6 h、8 h，記錄精油獲得量并計(jì)算其出油率，每個(gè)條件重復(fù)3次。

2.2.3 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以節(jié)約原料和成本為前提，結(jié)合蘄艾精油得率，選擇對(duì)精油得率影響較大的3個(gè)因素為正交因素，分別設(shè)定3個(gè)水平，建立L9（34）實(shí)驗(yàn)表安排試驗(yàn)[12]，以出油率為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)價(jià)，各因素各水平重復(fù)3次。

2.3 蘄艾精油主要成分鑒定

將提取的艾葉精油以1∶36的比例溶于乙酸乙酯，氣相色譜條件為：載氣為氦氣（99.99%），流速為1 mL/min，進(jìn)樣量1μL，進(jìn)樣口溫度為240℃，分流比10∶1。程序升溫：40℃保持2 min，以2℃/min升溫至80℃，再以4℃/min升溫至160℃，最后以5℃/min升溫至240℃，保持2 min。質(zhì)譜條件：電離方式為EI源，源溫230℃，四級(jí)桿溫度150℃，傳輸線溫度280℃，電離電壓70 eV，質(zhì)量范圍50～600 m/z全程掃描。質(zhì)譜檢索標(biāo)準(zhǔn)庫(kù)為NIST庫(kù)。GC-MS檢測(cè)試驗(yàn)中每個(gè)樣品均進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)，每年樣品均進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。

2.4 抑菌試驗(yàn)

2.4.1 培養(yǎng)基制備

LB培養(yǎng)基（細(xì)菌）：胰蛋白胨10 g，酵母5 g，NaCl 10 g，蒸餾水1 000 mL，調(diào)pH值至7.4；固體LB培養(yǎng)基則需再加入15 g瓊脂粉，或稱取LB營(yíng)養(yǎng)瓊脂40 g，溶解于1 000 mL蒸餾水中。121℃高壓滅菌15 min，分裝或冷卻至50℃左右時(shí)傾入無(wú)菌平皿備用。

沙氏葡萄糖培養(yǎng)基（真菌）：蛋白胨10 g、葡萄糖40 g、蒸餾水1 000 mL，調(diào)pH值至5.6；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基則需再加入瓊脂15 g，或稱取沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基65 g，加熱攪拌溶解于1 000 mL蒸餾水中。121℃高壓滅菌15 min，分裝或冷卻至50℃左右時(shí)傾入無(wú)菌平皿備用。

2.4.2 菌種活化

將所有供試菌種接入斜面培養(yǎng)基，細(xì)菌（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌）置于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，真菌（白色念珠菌）置于28℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h，連續(xù)轉(zhuǎn)接3次培養(yǎng)后，置于4℃冰箱保存，備用。

2.4.3 菌液制備

將經(jīng)平皿活化的待測(cè)菌株在無(wú)菌條件下用接種環(huán)挑取1環(huán)菌落，接入盛有液體培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，于37℃、130 r/min振蕩過(guò)夜，8 000 r/min離心10 min后加入無(wú)菌水，離心，重復(fù)洗滌2～3次，再加入適量無(wú)菌水配制成菌懸液，調(diào)節(jié)菌液濃度至106～107 cfu/mL，置4℃冰箱保存，備用。

2.4.4 抑菌試驗(yàn)

抑菌試驗(yàn)采用牛津杯法。將已滅菌的培養(yǎng)基加熱到完全融化后，傾入無(wú)菌培養(yǎng)皿里，每平皿約加18 mL，冷凝，標(biāo)記菌種、藥物及其濃度，然后每皿均勻涂布菌液350～500μL，在培養(yǎng)基表面垂直擺放牛津杯，輕輕加壓，使其與培養(yǎng)基接觸無(wú)空隙。每皿5孔（其中3孔為3種對(duì)照），牛津杯中定量加入藥液20μL。合皿并貼封口膜。細(xì)菌（大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌）37℃培養(yǎng)24 h，真菌（白色念珠菌）28℃培養(yǎng)48 h，平板對(duì)光觀察抑菌圈，每菌重復(fù)3次。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 不同年份不同處理方式下蘄艾精油含量比較

初步設(shè)定料液比1∶14，浸泡12 h，提取6 h，采用水蒸氣蒸餾法對(duì)蘄艾粉、艾絨、不同年份的艾葉等材料進(jìn)行精油提取測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。3種材料處理方式中，艾葉出油率最高。同時(shí)，在2017年—2019年3年的艾葉中，2017年艾葉出油率最好，出油率約為1.2%。上述結(jié)果說(shuō)明在提取條件相同的情況下，年份越久的陳年艾葉中保留的難揮發(fā)精油成分越高。本研究后續(xù)相關(guān)試驗(yàn)均使用2017年蘄艾艾葉。

表1 不同年份不同處理方式下蘄艾精油量Tab.1 The amount of essential oil of Artemisia argyi under different treatment methods in different years

3.2 蘄艾精油提取單因素試驗(yàn)

3.2.1 不同浸泡時(shí)間對(duì)蘄艾精油得率的影響

浸泡時(shí)水分進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)，有助于將藥材中組織膨脹，影響有效成分的流出。圖1反映出蘄艾精油得率隨著浸泡時(shí)間的增加而逐漸增加，在4 h時(shí)達(dá)到最大，隨后提取量基本保持不變。在實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)中按照節(jié)約時(shí)間及能源的原則，可認(rèn)為艾葉在侵泡4 h時(shí)已達(dá)到完全浸透，可作為最佳浸泡時(shí)間。

圖1 浸泡時(shí)間對(duì)蘄艾精油提取得率的影響Fig.1 The effect of soaking time on the extraction yield of Artemisia argyi essential oil

3.2.2 不同料液比對(duì)蘄艾精油得率的影響

料液比增大，能加快液固相的相對(duì)運(yùn)動(dòng)速度，也能促使有效成分流出。圖2反映出隨著不同料液比的增大，對(duì)蘄艾精油得率呈現(xiàn)出逐漸增大的趨勢(shì)，直到料液比為1∶14時(shí)，平均精油得率基本穩(wěn)定，因此可認(rèn)為1∶14是最佳料液比，有利于蘄艾精油的提取。

圖2 料液比對(duì)蘄艾精油提取得率的影響Fig.2 The effect of material liquid ratio on the extraction yield of Artemisia argyi essential oil

3.2.3 不同提取時(shí)間對(duì)蘄艾精油得率的影響

提取時(shí)間是影響精油得量的重要參數(shù)。圖3反映出隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，蘄艾精油得量逐漸增大，在提取時(shí)間為4 h時(shí)達(dá)到最大，且8 h時(shí)有微弱減小的趨勢(shì)。加熱時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致提取裝置的熱傳遞，使得揮發(fā)油提取器溫度過(guò)高，部分精油隨水分的蒸發(fā)會(huì)造成損失。

圖3 提取時(shí)間對(duì)蘄艾精油提取得率的影響Fig.3 The effect of extraction time on the extraction yield of Artemisia argyi essential oil

3.3 正交試驗(yàn)

3.3.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，每個(gè)因素選取3個(gè)水平按照表2進(jìn)行正交試驗(yàn)。

表2 正交試驗(yàn)因素水平Tab.2 The composition analysis of Agkistrodon argyi Essential Oil in different years

3.3.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

按照表2相關(guān)內(nèi)容在各條件下進(jìn)行蘄艾艾葉精油提取試驗(yàn)，得到各試驗(yàn)條件下蘄艾精油提取結(jié)果，如表3所示。

表3 正交試驗(yàn)及相應(yīng)結(jié)果Tab.3 The orthogonal test and corresponding results

根據(jù)表3中的結(jié)果，比較極差R，極差越大，影響越大，得出正交因素的影響順序?yàn)樘崛r(shí)間＞浸泡時(shí)間＞料液比，蘄艾精油提取工藝以A3B3C2為最佳，即浸泡6 h，提取6 h，料液比為1∶14的條件下，蘄艾艾葉精油出油率最大。

3.4 不同年份蘄艾艾葉精油成分比較

圖4為不同年份蘄艾精油的GC-MS總離子圖，通過(guò)質(zhì)譜庫(kù)搜索及查閱相關(guān)資料獲得分析結(jié)果如表6所示（相對(duì)含量小于1.5%的均已舍去）。2017年蘄艾艾葉精油鑒定出30種成分，2018年艾葉精油鑒定出13種成分，2019年艾葉精油鑒定出25種成分。不同年份蘄艾精油中鑒定到9種相同的成分，且含量占比較高，如桉油精、樟腦、龍腦、石竹烯和石竹素、刺柏腦等。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，桉油精[14，15]、樟腦[16]、龍腦[17]等均為具有抑菌作用，可作為未來(lái)蘄艾抑菌產(chǎn)品研發(fā)重點(diǎn)關(guān)注的抑菌活性成分，這3種成分在GC-MS中的保留時(shí)間分別為15.68 min、22.98 min、24.80 min。

表6 不同年份蘄艾精油成分分析表Tab.6 Composition analysis table of Artemisia Argyi Essential Oil in different years

圖4 2017年—2019年蘄艾精油的GC-MS總離子圖Fig.4 The GC-MS total ion diagram of Artemisia argyi Essential oil from 2017 to 2019

3.5 抑菌試驗(yàn)

牛津杯法抑菌試驗(yàn)結(jié)果顯示，蘄艾精油和對(duì)應(yīng)陽(yáng)性對(duì)照對(duì)3種供試菌種均表現(xiàn)出較明顯的抑菌效果，出現(xiàn)一定程度的抑菌圈；但水相（蘄艾黃酮、蘄艾酸、蘄艾多糖）的抑菌效果則不明顯，沒(méi)有抑菌圈出現(xiàn)（圖5）。

圖5 蘄艾精油、蘄艾水相（蘄艾黃酮、蘄艾酸、蘄艾多糖）及陽(yáng)性/陰性對(duì)照對(duì)3種供試菌種的抑菌效果Fig.5 The Agkistrodon argyi Essential oil and water phase(Agkistrodon argyi flavone,Agkistrodon argyi acid,Agkistrodon argyi polysaccharide)and positive/negative control on the bacteriostatic effect of the three tested strains

4 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)水蒸氣蒸餾法提取蘄艾精油過(guò)程中3個(gè)影響因素的研究及對(duì)提取工藝流程進(jìn)行優(yōu)化，得出在蘄艾精油提取工藝中影響出油率的3個(gè)主要因素的關(guān)系為提取時(shí)間＞浸泡時(shí)間＞料液比，提取工藝以A3B3C2為最佳，即在浸泡6 h，提取6 h，料液比為1∶14的條件下，蘄艾精油提取量最大。GC-MS法檢測(cè)到不同年份蘄艾精油的主要成分略有不同，2017年艾葉精油鑒定出30種成分，2018年艾葉精油鑒定出13種成分，2019年艾葉精油鑒定出25種成分。不同年份艾葉精油中占比較高的主要成分基本相同，本實(shí)驗(yàn)中2017年、2018年、2019年艾葉精油之間有9種相同的主要成分，分別是桉油精（Eucalyptol）、檜腦（Juniper camphor）、石竹烯（Caryophyllene）、石竹素（Caryophyllene oxide）、4-萜烯醇（Terpinen-4-ol）、α-松油醇（α-Terpineol）、崖柏酮（Thujone）、香芹醇（Carveol）、芹子烯（Selinene）。推測(cè)艾葉存放時(shí)間不同，精油中的易揮發(fā)成分略有不同，難揮發(fā)成分基本相同。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道顯示，艾葉精油主要成分中的桉油精、樟腦、石竹烯和石竹素等均具有抑菌效果。本研究中的抑菌試驗(yàn)結(jié)果顯示蘄艾精油對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌三種供試菌種均有不同程度的抑菌效果，但蘄艾精油中的有效抑菌成分及抑菌最小濃度還需進(jìn)一步研究。