楊 晨，劉雙雙，洪曉黎，畢 超，邱淑兵

（1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院·浙江大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院·浙江省口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心·浙江省口腔生物醫(yī)學(xué)研究重點實驗室·浙江大學(xué)癌癥研究院，浙江 杭州 310000；2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院公共技術(shù)平臺，浙江 杭州 310058）

目前高內(nèi)涵篩選技術(shù)作為一種成熟的自動顯微成像技術(shù)，將高通量自動成像和分析結(jié)合起來，來獲得單細(xì)胞水平的多參數(shù)定量化數(shù)據(jù)，涉及腫瘤治療[1]、藥物篩選[2]、毒理學(xué)[3]、細(xì)胞表型研究[4]、細(xì)胞信號通路研究[5]、活細(xì)胞生物學(xué)功能研究[6]等。隨著單細(xì)胞水平研究的不斷深入，高內(nèi)涵成像以其自身具備的高通量自動成像、數(shù)據(jù)信息量大、智能化的定量化分析等優(yōu)勢，越來越受到各位研究人員的認(rèn)可。DPC 可對無熒光染色的活細(xì)胞樣品成像，在保證細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的完整性同時，通過單次試驗就可以獲得大量的細(xì)胞學(xué)數(shù)據(jù)。本文將就高內(nèi)涵成像的DPC 模塊展開介紹與成像方法詳細(xì)分享，主要包括實驗前樣本的準(zhǔn)備、成像參數(shù)的設(shè)置與成像過程中的注意事項以及實驗數(shù)據(jù)的定量化分析等方面，旨在為從事細(xì)胞增殖和遷移等研究的學(xué)者們提供一種高效的實驗方法與技術(shù)手段。

1 DPC 成像前的準(zhǔn)備

1.1 細(xì)胞準(zhǔn)備要求

細(xì)胞不需要進(jìn)行任何的熒光染色，單層的貼壁細(xì)胞且狀態(tài)好，細(xì)胞匯合率在60%～80%左右比較合適。懸浮細(xì)胞樣品，可將微孔板進(jìn)行包被，或采用低速離心的辦法制備樣品。本文分享的案例[7]是人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116 和LoVo，分為control 和miR-30b-5p 兩組，按照2×104個細(xì)胞/孔的密度接種到96 孔板，匯合度在80%，滿足高內(nèi)涵DPC 成像的條件。

1.2 微孔板選擇

實驗選擇的是PS（聚苯乙烯）材質(zhì)的96 微孔板（Corning 3599），可以滿足DPC 成像的需要。另外，也可以選擇Perkin Elmer 開發(fā)的專用96 微孔板（CellCarrier Ultra microplates）或者Special Optics 96孔板（貨號Corning 3603，美國）等。該板的底部比PS孔板的底部薄，透明的底部能降低背景熒光，成像效果會更好。

1.3 成像模式的選擇

成像模式選擇的是寬場模式，長時間高強度曝光會對細(xì)胞造成光毒性，所以活細(xì)胞成像也更適合使用寬場成像模式，而且應(yīng)該選擇盡量低的激發(fā)能量和較短的曝光時間。

1.4 物鏡選擇

普通多孔板適合于20 X 物鏡及以下鏡頭，不需要觀察共聚焦亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)或紋理分布，一般選擇10 X 物鏡拍攝，視野大，拍攝時間相對短。

1.5 儀器要求

高內(nèi)涵細(xì)胞成像與分析系統(tǒng)需要配備溫度和CO2控制模塊（Temperature and CO2，TCO），能夠提供活細(xì)胞長時間培養(yǎng)所需的溫度和二氧化碳，本文使用儀器型號為Operetta（Perkin Elmer，美國）。細(xì)胞對環(huán)境要求高，需要至少提前半小時開啟TCO。

1.6 數(shù)據(jù)分析

使用儀器自帶的Harmony 4.1 軟件，可以自行創(chuàng)建分析算法，也可以使用儀器的自學(xué)習(xí)功能，訓(xùn)練軟件自動識別特定細(xì)胞，對細(xì)胞進(jìn)行分組，并進(jìn)行運動軌跡、位移、方向、速度等多種參數(shù)分析，實現(xiàn)分析結(jié)果的可視化。

2 DPC 成像技術(shù)的建立

利用Operetta 的TCO 模塊提供細(xì)胞長時間培養(yǎng)所需的溫度和二氧化碳，將96 孔板放置在活細(xì)胞工作站，在10 X 物鏡下使用DPC 成像功能進(jìn)行拍攝觀察細(xì)胞的遷移情況。分享案例中成像使用的是Time series 即時間序列，拍攝條件設(shè)置如下：Emission：50%，Time：12 ms，Height：-2 μm，Mode：High contrast，Interval：25 min，38 個時間點，總共拍攝時長近16 h。

3 實驗結(jié)果與數(shù)據(jù)分析

3.1 成像結(jié)果

圖1 是利用DPC 成像技術(shù)得到的人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116 和LoVo，control 和miR-30b-5p 兩組共四組細(xì)胞的成像數(shù)據(jù)（圖片為任意選取，僅作結(jié)果展示），可以獲取到所有選定孔內(nèi)選定視野內(nèi)每個細(xì)胞在T0-T37 共38 個時間點，近16 h 拍攝時長的實驗數(shù)據(jù)，獲得的成像圖像信噪比高，有利于下一步正確識別細(xì)胞進(jìn)行圖像分割。

圖1 四組細(xì)胞DPC 成像示例圖

3.2 整個實驗的流程圖建立

對整個實驗前期準(zhǔn)備、實驗開展以及數(shù)據(jù)分析做了流程的梳理，見圖2。在樣品準(zhǔn)備階段，細(xì)胞狀態(tài)良好且貼壁，匯合度在80%左右。在樣品成像階段，一般在10 X 物鏡下，選取寬場模式，設(shè)置好低曝光成像條件，拍攝時間序列，獲得高質(zhì)量的圖像數(shù)據(jù)。在數(shù)據(jù)分析階段，可以正確識別細(xì)胞，做好圖像分割，最終實現(xiàn)實驗數(shù)據(jù)的可視化。

圖2 高內(nèi)涵活細(xì)胞追蹤成像和分析的流程圖

3.3 分析算法的建立

拍攝結(jié)束后，利用高內(nèi)涵強大的Image Analysis即數(shù)據(jù)分析功能，追蹤到每個細(xì)胞，并建立數(shù)據(jù)分析的流程圖，見圖3。

圖3 Image Analysis 的流程圖

可以清晰地看出，依次經(jīng)過Find cells、Track objects、Calculate Intesity Properites、Calculate Morphology Properites、Calculate Kinetic Properites 和 Calculate Track Properites 共六步的分析，可以獲得細(xì)胞的各類參數(shù)，包括移動速度（Current Speed）、移動步徑（Current Step）、在X 軸 上 的 移 動 距 離（Current Displacement X（μm））、在Y 軸上的移動距離（Current Displacement Y（μm））等。

3.4 批量數(shù)據(jù)的結(jié)果分析

分析算法建好之后，進(jìn)一步利用Evaluation 模塊，對整板數(shù)據(jù)進(jìn)行批量運算，得到所有拍攝孔的數(shù)據(jù)。其中，如圖4 分享的案例數(shù)據(jù)，其中橫軸為Current Displacement X（μm），縱軸為Current Displacement Y（μm），表明細(xì)胞分別在X 和Y 軸上的移動距離。也可以根據(jù)實驗分組和處理不同，進(jìn)一步繪制柱狀圖，進(jìn)行組間差異的比較，更為直觀。

圖4 四組細(xì)胞的移動距離示例圖[7]

4 結(jié)論

本文分享的案例研究[7]采用96 孔板接種細(xì)胞，不需要做任何的熒光標(biāo)記，以無標(biāo)記貼壁活細(xì)胞為成像對象，統(tǒng)計視野內(nèi)每個活細(xì)胞的遷移情況。研究中采用的數(shù)據(jù)分析方法，用時可以控制在2 h 以內(nèi)，與傳統(tǒng)的MTT 和CCK-8 方法相比較，實驗時間明顯減少、實驗效率顯著提高、通量高、可追蹤、數(shù)據(jù)代表性好，分析得到的定量化數(shù)據(jù)更有說服力。MTT 和CCK-8的檢測方法一般通過酶標(biāo)儀測定樣本的吸光度，沒辦法直接觀察到細(xì)胞的生長情況，也不能做到定量化分析[8，9]。

圖像分割是數(shù)據(jù)分析的重要步驟，如果分析軟件不能很好地分割識別出每一個細(xì)胞或者要分析的個體，得到的分析結(jié)果也是不夠準(zhǔn)確的[10]。這就對成像的樣品提出了一定的要求，細(xì)胞需要為單層的貼壁細(xì)胞且狀態(tài)好，細(xì)胞匯合率在80%左右比較合適。細(xì)胞生長過快或者過密，可適當(dāng)降低接種密度，可在50%～80%范圍之間摸索。如果遇到確實特殊的細(xì)胞樣品，細(xì)胞本身就很容易結(jié)團，能做的只有盡量優(yōu)化成像條件，找到適合視野內(nèi)所有細(xì)胞分割的條件。所以，樣品制備的質(zhì)量，關(guān)系著數(shù)據(jù)分析的結(jié)果好壞，至關(guān)重要。

選擇合適的微孔板是高內(nèi)涵實驗成功的重要因素。常規(guī)微孔板底材質(zhì)為玻璃、聚丙乙烯（PE）、烯烴（CO），對于絕大部分實驗來說，建議使用TC-Treated PS 或CO板，TC-Treated PS 板以及CO 板都能夠粘附蛋白，從而促進(jìn)細(xì)胞的貼壁。玻璃底板的透光度更好，但是不適合細(xì)胞培養(yǎng)，如果需要使用一般可以通過包被不同的生物分子來提高細(xì)胞的貼壁以及改善細(xì)胞的生長特性。微孔板的厚度是影響透光性以及成像質(zhì)量的重要因素。板底厚度在250 μm 以上的，需要長工作距離鏡頭，并且需要調(diào)整矯正環(huán)，不推薦板底厚度大于1 mm 的微孔板。如需要觀察共聚焦亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)或紋理分布，必須用推薦薄底板。

DPC 成像，對細(xì)胞無干預(yù)，能最大限度保證細(xì)胞狀態(tài)，利用近紅外波長檢測，最大限度地降低了光毒性和光損傷，所以特別適合長時間動態(tài)觀察。DPC 成像具有通量高、樣本制備方便、數(shù)據(jù)分析簡便等明顯優(yōu)勢，相信能夠為開展活細(xì)胞相關(guān)研究的科研工作者們提供技術(shù)借鑒。