柴加麗，姚 拓，王振龍，韓江茹，張 蔚，劉曉婷，李 茜

（1. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院 / 草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心, 甘肅 蘭州 730070；2. 中國科學(xué)院西北高原生物研究所 / 青海省寒區(qū)恢復(fù)生態(tài)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 青海 西寧 810008）

高寒地區(qū)是我國重要的生態(tài)保護(hù)區(qū)，該地區(qū)海拔高、常年低溫、氣候條件惡劣，加上不合理放牧等一系列人類活動(dòng)，使高寒地區(qū)草地生態(tài)系統(tǒng)受到破壞。研究發(fā)現(xiàn)，目前約有90%的可利用天然草地都存在不同程度退化[1]，這不僅改變了植物群落結(jié)構(gòu)，還影響土壤固碳、水土保持等生態(tài)服務(wù)功能[2-3]。草地作為發(fā)展畜牧業(yè)的基礎(chǔ)和重要的生態(tài)屏障，受多重影響退化嚴(yán)重，因此，加強(qiáng)高寒地區(qū)草地生態(tài)的保護(hù)，探尋促進(jìn)草地生物生長和恢復(fù)的有效措施勢在必行[4]。目前，我國研究學(xué)者和相關(guān)部門已經(jīng)采取了一些措施，使用較多的就是圍欄封育和施肥，這些方法的實(shí)施有力地緩解了高寒地區(qū)草地退化問題[5]，但均有一定的弊端，圍欄封禁一般年限較長，造成草地資源浪費(fèi)[6]；另外天然草地施用化肥，雖然可以顯著提高地上生物量，但調(diào)查顯示，我國化肥利用率只有40%左右，大部分化肥施入后以滲透方式進(jìn)入土壤[7]，間接造成土壤微生物活性下降、養(yǎng)分比例失調(diào)、性狀惡化，導(dǎo)致草地穩(wěn)定性和可持續(xù)性差[8]。因此，研制新型肥料對(duì)實(shí)現(xiàn)高寒草地可持續(xù)發(fā)展和保護(hù)生態(tài)環(huán)境十分必要[9]。

植 物 根 際 促 生 菌 (plant growth promoting rhizobacteria, PGPR)是一類有益菌，能在植物根際定殖，并通過固氮、溶磷、分泌激素等功能來促進(jìn)植物生長，利用PGPR 研制微生物菌肥或菌劑，能夠修復(fù)土壤結(jié)構(gòu)，改善土壤養(yǎng)分供應(yīng)狀況，持續(xù)效果好且對(duì)環(huán)境無污染[10-11]。崔曉雙等[12]研究發(fā)現(xiàn)PGPR對(duì)番茄(Solanum lycopersium)、黃瓜(Cucumis sativus)株高都有顯著促進(jìn)作用；任卓然等[13]以兩株促生菌為基礎(chǔ)材料，發(fā)現(xiàn)微生物菌肥在退化草地修復(fù)中具有改善土壤理化性質(zhì)的潛力；Piromyou 等[14]篩選飼用玉米(Zea mays)中PGPR，發(fā)現(xiàn)其有利于田間植物生長發(fā)育。因此，篩選優(yōu)良PGPR 制作微生物菌肥或菌劑的技術(shù)為高寒地區(qū)植被恢復(fù)提供了新思路。鑒于此，本研究從高寒地區(qū)優(yōu)良牧草中華羊茅(Festuca sinensis)、草地早熟禾(Poa pretensis)、紫穗鵝觀草(Roegneria purpurascens)根際篩選低溫適應(yīng)型PGPR，并將其運(yùn)用于后續(xù)高寒地區(qū)微生物菌劑研制，對(duì)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

樣品于2020 年8 月采自青海省門源縣皇城鄉(xiāng)，該采樣地位于海北藏族自治州東部，海拔3 200 -3 250 m，地理位置37°39′51″ N，101°10′44″ E，氣候類型屬于高原大陸性氣候，年平均氣溫0.8 ℃，年平均降水量500～600 mm。植被類型為高寒草甸，優(yōu)勢種包括嵩草(Kobresia myosuroides)、草地早熟禾(Poa pretensis)，伴生種主要以禾本科異針茅(Stipa aliena)、中華羊茅(Festuca sinensis)為主[15-16]。采集中華羊茅、草地早熟禾、紫穗鵝觀草完整植株，標(biāo)注植物名稱和采集日期，貯存于無菌自封袋后放入冰盒中，帶回實(shí)驗(yàn)室立即進(jìn)行PGPR 菌株的分離。

1.2 培養(yǎng)基

固體溶磷培養(yǎng)基[17]：葡萄糖10 g，硫酸銨[(NH4)2SO4] 0.1 g，氯化鉀(KCl) 0.3 g，七水合硫酸鎂(MgSO4·7H2O) 0.25 g，六 水 合 氯 化 鎂(MgCl2·6H2O)5.0 g，有機(jī)磷植酸鈣5.0 g /無機(jī)磷[Ca3(PO4)] 5.0 g，蒸餾水1 000 mL，瓊脂20 g，pH 7.0。

無氮培養(yǎng)基[9](nitrogen free medium，NFM)：二水合氯化鈣(CaCl2·2H2O) 0.02 g，七水合硫酸鎂(MgSO4·7H2O) 0.2 g，磷酸氫二鉀(K2HPO4) 0.5 g，二水合鉬酸 鈉(NaMoO4·2H2O) 0.002 g，氯 化 鈉(NaCl) 0.1 g，蘋果酸5.0 g，0.5%溴百里酚藍(lán)5 mL，瓊脂20 g (固體培養(yǎng)基)或2 g (半固體培養(yǎng)基)，總體積1 000 mL，pH 7.0。

King’B 培養(yǎng)基(KB)：蛋白胨20 g，磷酸氫二鉀(K2HPO4) 1.15 g，七水合硫酸鎂(MgSO4·7H2O) 1.5 g，丙三醇15 mL。

LB 培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 5 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0～7.5。

1.3 方法

1.3.1牧草根際菌株分離純化

為獲得牧草根際所有菌株及分布狀況，參考蔣永梅[9]的方法，通常將根際分為3 個(gè)區(qū)域，即根表土壤(soil adhering to roots, RS)、根系表面(rhizoplan or surface of roots, RP)和 根 內(nèi) 組 織(histoplan or interior of roots, HP)。分離方法：在超凈工作臺(tái)中抖落牧草根系的土壤后稱取1 g 植物根系，放入含有9 mL 生理鹽水(0.85%，已滅菌)的試管中，充分混勻，得到RS 區(qū)域10-1稀釋液；將根系取出并放入另一個(gè)含有無菌玻璃珠的9 mL 生理鹽水(0.85%，已滅菌)的試管中，充分混勻得到RP 區(qū)域的10-1稀釋液；再將根系取出用石蠟將根系兩端密封，先用75%酒精滅菌3 min，然后用無菌水沖洗2～3 次，剪去石蠟兩端并研磨后全部轉(zhuǎn)入含有9 mL 生理鹽水(0.85%，已滅菌)的試管中，充分混勻，得到HP 區(qū)域的10-1稀釋液；吸取各區(qū)域的10-1稀釋液1 mL，加入含有9 mL 生理鹽水(0.85%，已滅菌)的試管中充分混勻，得到10-2稀釋液，按照梯度稀釋法再依次制備濃度為10-3、10-4、10-5稀釋液備用。利用平板涂布法分別將10-3、10-4、10-5稀釋液均勻涂布到NFM 培養(yǎng)基和固體溶磷培養(yǎng)基上，每個(gè)區(qū)域的每個(gè)梯度稀釋液在培養(yǎng)基上各重復(fù)3 次，15 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 ～ 10 d，用接種環(huán)挑取能在NFM 培養(yǎng)基上生長的不同菌落進(jìn)行純化，即為固氮菌株；挑取固體溶磷培養(yǎng)基上有溶磷圈的不同菌落進(jìn)行純化，即為溶磷菌株，將純化后的菌株保存于4 ℃?zhèn)溆肹18]。

1.3.2菌株促生特性測定

菌株固氮特性測定[19]：乙炔還原法。用接種環(huán)將菌株接種于LB 液體培養(yǎng)基中，在15 ℃、180 r·min-1條件下培養(yǎng)2～3 d，并用無菌LB 液體調(diào)節(jié)OD600一致[11]，吸取100 μL 菌液接種于盛有3 mL 半固體NFM 培養(yǎng)基的12 mL 血清瓶中，每株菌3 次重復(fù)，以不接菌培養(yǎng)基為對(duì)照，15 ℃培養(yǎng)48 h 后將棉花塞換成橡膠塞，用無菌注射器抽出1 mL 氣體并注入1 mL 乙炔，15 ℃培養(yǎng)48 h。用微量進(jìn)樣器抽取混合氣體50 μL 注入氣象色譜儀(Agilent 7890A，美國)氣體進(jìn)樣柱內(nèi)，記錄并觀察C2H4出峰時(shí)間及峰面積百分比，計(jì)算固氮酶活性。

菌株溶磷特性測定[20]：鉬藍(lán)比色法。將固體溶磷培養(yǎng)基上有溶磷圈的菌株接種于裝有20 mL 液體培養(yǎng)基(已滅菌)中于15 ℃、180 r·min-1條件下培養(yǎng)10～14 d。取培養(yǎng)液8 mL 于4 ℃、12 000 r·min-1條件下離心15 min，取上清液1 mL 于100 mL 三角瓶中，同時(shí)加入NaHCO3溶液19 mL，置于搖床(180 r·min-1)搖動(dòng)30 min 后，準(zhǔn)確吸取濾液5 mL，再加入5 mL鉬銻抗顯色液于50 mL 容量瓶中，定容后顯色30 min。用紫外可見光分光光度計(jì)測定OD700，并計(jì)算溶磷量。

菌株分泌激素特性測定[21]，定性判斷：將PGPR菌株接種于盛有已滅菌的三角瓶中，在15 ℃、180 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)10～12 d。吸取各菌液50 μL于白瓷板上，加50 μL Spot 比色液，其中對(duì)照加50 μL濃度為0.01‰的3-IAA，將白瓷板放置于室溫黑暗條件下，20 min 內(nèi)觀察并記錄顏色變化。如變深粉色即菌株分泌生長素(Indole-3-acetic acid，IAA)能力較強(qiáng)，用++表示；變淺粉色即菌株能分泌IAA 但能力較弱，用+表示。定量測定：采用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography, HPLC)[22]測定植物激素(IAA、GA3、t-Z)含量。HPLC 色譜條件 為：固 定 相 為Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 column (4.6 mm × 250 mm, 5-Micron)，流動(dòng)相為甲醇 ∶水 ∶ 冰乙酸溶液 = 45 ∶ 54 ∶ 1，檢測波長為254 nm，柱溫為30 ℃，流速為0.8 mL·min-1，進(jìn)樣量為10 μL。將篩選出的菌株接種于150 mL KB 液體培養(yǎng)基中，15 ℃、180 r·min-1搖床中培養(yǎng)5 d。發(fā)酵液在4 ℃離心10 min (5 000 r·min-1)收集上清液，用乙酸乙酯萃取后用濃縮儀濃縮至近干，甲醇定容至2 mL，HPLC進(jìn)行分析。

1.3.3優(yōu)良菌株鑒定

將上述分離篩選到的優(yōu)良PGPR 菌株在LB 平板上進(jìn)行活化，采用熱裂解法提取細(xì)菌DNA，利用通用引物27F 和1492R 進(jìn)行16 S r DNA 序列的PCR 擴(kuò)增[23]，反應(yīng)體系為2 × Taq PCR MasterMix 25 μL、DNA模板3 μL、正反向引物各1 μL、dd H2O 20 μL、16 S r DNA序列測定由蘭州天啟生物科技有限公司完成。將測序結(jié)果在EzbioCloud 的16S-based ID 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源序列比較，采用Mega5.0 軟件以鄰接法構(gòu)建所測菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹再次確認(rèn)[24]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 25.0 軟件分析數(shù)據(jù)，采用Duncan 法對(duì)不同菌株促生特性(溶磷、固氮、分泌激素)進(jìn)行差異分析，采用Excel 2010 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 高寒地區(qū)牧草根際促生菌數(shù)量分布

通過3 種培養(yǎng)基篩選，共獲得181 株菌株(圖1)，分離自中華羊茅根際59 株，其中根表土(RS)、根表面(RP)和根內(nèi)(HP)菌株分別占總數(shù)的33.90%、38.98%和27.12%；草地早熟禾根際64 株，其中32.81%分離自RS，39.06%分離自RP，28.13%分離自HP；紫穗鵝觀草根際58 株，不同區(qū)域(RS、RP、HP) PGPR 占總數(shù)的32.76%、39.66%和27.58%?？傮w來看，3 種牧草根際促生菌分布均表現(xiàn)出RP ＞ RS ＞ HP 的分布趨勢。通過選擇培養(yǎng)基共分離到溶解有機(jī)磷52株，溶解無機(jī)磷55 株，固氮74 株。

圖1 細(xì)菌菌株牧草根際的數(shù)量及分布情況Figure 1 Number and distribution of bacterial strains in the rhizosphere of forage species

2.2 菌株促生特性測定

2.2.1菌株溶磷特性測定

對(duì)溶磷菌株溶磷量測定，結(jié)果表明，供試的52株溶有機(jī)磷菌株中有14 株具有良好的溶解以植酸鈣為有機(jī)磷磷源的能力，占供試菌株的26.92%；供試的55 株溶無機(jī)磷菌株中有16 株具有良好的溶解以磷酸三鈣為無機(jī)磷磷源的能力，占供試菌株的29.09%。14 株溶有機(jī)磷菌株溶磷量為6.51～141.49 μg·mL-1(表1)，其中ZMBJ2 溶磷量顯著(P＜ 0.05)高于其他菌 株，達(dá)141.49 μg·mL-1，GMDB1 溶 磷 量 最 低，為6.51 μg·mL-1，溶磷量在100 μg·mL-1以上的菌株有兩株，分別是ZMBJ2 和ZMBN4，均分離自中華羊茅根際。菌株溶有機(jī)磷培養(yǎng)液均呈酸性，pH 2.97～3.79。16 株溶無機(jī)磷菌株溶磷量為371.29～538.59 μg·mL-1(表2)，其中菌株GPDB3 溶磷量最大，達(dá)538.59 μg·mL-1，其 次 是ZPBN1，為533.93 μg·mL-1；菌 株GPDJ1 溶磷量最小，為371.29 μg·mL-1，菌株溶無機(jī)磷培養(yǎng)液pH 為3.98～4.79，呈酸性。

表1 PGPR 菌株溶解有機(jī)磷能力Table 1 Ability of PGPR to dissolve organic phosphorus

表2 PGPR 菌株溶解無機(jī)磷能力Table 2 Ability of PGPR to dissolve inorganic phosphorus

2.2.2固氮菌株特性測定

對(duì)固氮菌株固氮酶活性測定(表3)發(fā)現(xiàn)，不同菌株固氮能力不同，根據(jù)固氮能力共篩選出22 株優(yōu)良固氮菌，固氮酶活性在91.71～160.20 nmol·(h·mL)-1(C2H4)，其中固氮酶活性在150 nmol·(h·mL)-1(C2H4)以上的菌株有兩株，分別是GNDJ1 和ZNBJ1，GNDN2固氮酶活性最小，為91.71 nmol·(h·mL)-1(C2H4)。從中華羊茅和紫穗鵝觀草根際分離的優(yōu)良固氮菌數(shù)量較多，而草地早熟禾根際最少。

表3 PGPR 菌株固氮能力Table 3 Nitrogen fixing capacity of PGPR strains

2.2.3分泌激素菌株特性測定

對(duì)上述溶磷、固氮PGPR 分泌IAA 能力定性判斷(表4)，發(fā)現(xiàn)14 株菌株具有分泌IAA 能力，其中ZNBJ1、ZMBN4、ZPBN1、SNCJ3、SPCJ2、SPCB4 在顯色反應(yīng)中呈現(xiàn)深粉色，其余菌株為淺粉色。利用高效液相色譜法對(duì)14 株P(guān)GPR 分泌激素含量測定發(fā)現(xiàn)，菌株分泌赤霉素、IAA、玉米素的含量分別為0.52～139.22、0.10～0.92 和0.12～0.99 μg·mL-1；其中，菌株ZMBN4 分泌赤霉素能力最強(qiáng)，顯著高于其他菌株(P＜ 0.05)，菌株SPCB4 分泌IAA 和玉米素能力均最強(qiáng)，相比其他菌株差異顯著(P＜ 0.05)。

表4 PGPR 菌株分泌植物激素能力Table 4 Ability of PGPR strains to secrete plant hormones

2.3 菌株綜合促生特性評(píng)價(jià)

對(duì)前期篩選的53 株菌株綜合特性測定，共篩選出12 株優(yōu)良PGPR(表5)，其中菌株ZMBJ3、ZMBN4、SPCJ2、SPCB4 同時(shí)具有固氮、溶有機(jī)磷、溶無機(jī)磷、分泌3 種激素的能力，ZMBJ2 溶有機(jī)磷能力較強(qiáng)；ZPBN1、GPDB3 溶無機(jī)磷能力較強(qiáng)；ZNBJ1、ZNBJ3、GNDJ1、GNDJ4、GNDN1 固氮能力較強(qiáng)，綜合測定發(fā)現(xiàn)上述12 株P(guān)GPR 促生特性較全面，可為后期微生物復(fù)合菌劑研制提供菌種資源。

表5 優(yōu)良PGPR 菌株綜合特性Table 5 Comprehensive characteristics of excellent PGPR strains

2.4 優(yōu)良PGPR 菌株的鑒定

通過對(duì)12 株優(yōu)良PGPR 測序，使用Ezbiocloud進(jìn)行同源序列比對(duì)，MEGA 7.0 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹后，發(fā)現(xiàn)本研究測定的12 株菌株16S r DNA 基因序列與所選參比序列的相似度均高于98% (表6)。鑒定結(jié)果表明，菌株SPCB4 為華西腸桿菌(Enterobacter huaxiensis)，其余11 株菌株均為假單胞菌屬，其中ZNBJ3、ZNBJ1、SPCJ2、GPDB3、GNDN1、GNDJ1 為Pseudomonas piscium；ZPBN1、ZMBJ3 為Pseudomonas neuropathica；ZMBJ2 為Pseudomonas pisciculturae；ZMBN4 為Pseudomonas bubulae；GNDJ4 為Pseudomonas mucoides。

表6 優(yōu)良PGPR 菌株鑒定Table 6 Identification of superior PGPR strains

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)菌株溶磷量與菌液pH 沒有相關(guān)關(guān)系，這與趙小蓉等[25]、Narsian 和Patel[26]研究結(jié)果一致，而張亮等[27]對(duì)5 株自生固氮菌溶磷機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基pH 與磷含量呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系；康貽軍等[28]也發(fā)現(xiàn)溶磷菌的溶磷量與培養(yǎng)介質(zhì)pH 之間存在良好的相關(guān)性。對(duì)于溶磷菌的溶磷量與菌液pH 相關(guān)性的研究，出現(xiàn)不同的研究結(jié)果，究其原因可能與菌株在不同時(shí)期的代謝活動(dòng)有關(guān)，溶磷過程較復(fù)雜，菌株在溶磷時(shí)會(huì)產(chǎn)生有機(jī)酸，如草酸、乳酸、蘋果酸、檸檬酸等，在有機(jī)酸的作用下，導(dǎo)致菌液呈酸性。不同菌株在不同生長時(shí)期產(chǎn)生有機(jī)酸種類及含量不同，導(dǎo)致研究結(jié)果不同[29-30]。因此，研究菌株培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的有機(jī)酸及含量，了解溶磷量與培養(yǎng)液pH 的動(dòng)態(tài)變化，才能明確分析其相關(guān)關(guān)系。

根際固氮菌是定殖于植物根際的固氮細(xì)菌，這類細(xì)菌不僅為植物生長提供氮素營養(yǎng)，還能活化土壤微生物，從而促進(jìn)植物生長[31]。楊婉秋等[20]從天祝高寒草甸5 種牧草根際分離20 株固氮菌，固氮酶活性為5.23～64.87 nmol·(h·mL)-1(C2H4)；而本研究從海北高寒草甸3 種牧草根際分離到22 株固氮能力優(yōu)良的菌株，固氮酶活性為91.71～160.20 nmol·(h·mL)-1(C2H4)。固氮酶活性不同主要指微生物體內(nèi)鉬鐵固氮酶活性不同，鉬鐵固氮酶由鐵蛋白和鉬鐵蛋白組成[32]，主要受樣地生境條件和寄主植物種類影響，本研究采集樣地海拔低于天祝高寒草甸，且采集牧草均為多年生禾本科牧草，生長季較長，使本研究固氮酶活性相對(duì)較高。

植物激素(plant hormones, PHs)是植物體內(nèi)可自身合成的微量有機(jī)物，在低濃度下參與并調(diào)控植物生長發(fā)育[33]。除植物外，微生物也能分泌生長素(indole-3-a cetic acid, IAA)、赤 霉 素(gibberellic acid,GA3)、玉米素(trans zeatin, t-Z)等植物激素，這些微生物分泌的植物激素釋放到土壤中，共同參與調(diào)控植物生長發(fā)育[34]。高亞敏等[22]從天祝高山草原優(yōu)良牧草嵩草(Kobresia myosuroides)、珠芽蓼(Polygonum viviparum)根際分離的菌株在28 ℃培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，菌株分泌IAA、GA3和t-Z 含量分別為0.24～69.98、0.34～68.87 和0.11～47.59 μg·mL-1，劉婷等[35]在同一樣地采用相同方法分離無脈苔草(Carex enervis)根際PGPR，發(fā)現(xiàn)IAA 分泌量為8.20～86.36 μg·mL-1，GA3分泌量為26.36～135.90 μg·mL-1，t-Z 分泌量為9.55～141.68 μg·mL-1；本研究測定了3 種牧草根際促生菌分泌激素的能力，發(fā)現(xiàn)不同菌株分泌激素種類和含量存在差異，其中從中華羊茅根際分離的菌株分泌GA3能力最強(qiáng)，而早熟禾與紫穗鵝觀草分泌3 種激素的能力差異不明顯。從3 種牧草根際分離的菌株分泌激素(IAA、GA3和t-Z)含量分別為0.10～0.92、 0.52～139.22、0.10～0.99 μg·mL-1，其中GA3分泌量與前人研究基本相同，而IAA 與t-Z 分泌量較低。造成這種結(jié)果的原因是采樣地、植物種類與培養(yǎng)溫度的不同[36]。本研究培養(yǎng)溫度為15 ℃，說明低溫不利于菌株分泌IAA 與t-Z，而對(duì)GA3分泌沒有影響。

鑒定的12 株優(yōu)良PGPR 中，有11 株假單胞菌屬和1 株腸桿菌屬。假單胞菌屬細(xì)菌生態(tài)適應(yīng)性廣，主要分布于土壤、水和其他基質(zhì)上，是世界上最復(fù)雜的細(xì)菌屬之一，也是種類最多的，并且物種數(shù)目在逐年增加[37]。據(jù)報(bào)道，大多數(shù)假單胞菌屬不僅可以促進(jìn)植物生長，還能防治植物病害，生防機(jī)理包括競爭營養(yǎng)物質(zhì)、誘導(dǎo)植物抗性、產(chǎn)生抑菌物質(zhì)等[38-39]，生防作用有待進(jìn)一步研究。目前發(fā)現(xiàn)華西腸桿菌對(duì)部分臨床常用抗菌藥物耐藥，其研制微生物菌劑的安全性尚不明確，若作為微生物接種劑，需要對(duì)其致病性和安全性檢測[40]。本研究鑒定的優(yōu)良PGPR 主要是假單胞菌屬，并未發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌屬，可能與牧草本身及生存的生境條件有關(guān)，此外芽孢桿菌耐受溫度范圍較廣，大多為20～50 ℃，本研究篩選溫度會(huì)使一些低溫適應(yīng)性菌株優(yōu)先生長，不適宜大多數(shù)芽孢桿菌生長繁殖。目前，國內(nèi)對(duì)PGPR的研究及相關(guān)菌劑產(chǎn)品研發(fā)較多，但存在不同菌劑對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性不同的問題。因此，可以借鑒國外的經(jīng)驗(yàn)，從特定氣候、生境中篩選PGPR 菌株，以生產(chǎn)出適合特定氣候、生境的微生物菌劑[41]，另外，國內(nèi)外對(duì)于PGPR 的研究主要集中在對(duì)作物生長促進(jìn)方面[42]，而針對(duì)草地與牧草的微生物菌劑研制較少。本研究篩選的菌株對(duì)低溫有良好適應(yīng)性，利用其研制微生物菌劑對(duì)后期高寒地區(qū)天然草地植被恢復(fù)具有重要意義。

4 結(jié)論

共分離到181 株菌株，分離自中華羊茅根際59株、草地早熟禾根際64 株、紫穗鵝觀草根際58 株，菌株在3 種牧草根際均表現(xiàn)出RP ＞ RS ＞ HP 的分布規(guī)律。通過促生特性綜合測定，共篩選12 株綜合促生特性較強(qiáng)，有進(jìn)一步研究利用價(jià)值的菌株，其中有1 株腸桿菌屬(Enterobacter)，11 株假單胞菌屬(Pseudomonas)，可用于微生物菌劑的研制。