劉磊

1. 神威藥業(yè)集團有限公司（石家莊 051430）；2. 京津冀聯(lián)創(chuàng)藥物研究（北京）有限公司（北京 100025）

骨質(zhì)疏松癥是一種明顯的骨骼疾病，其特征是低骨密度和骨骼微結(jié)構(gòu)惡化，導致骨骼脆性升高，從而增加骨折風險。隨著全球人口老齡化的加劇，骨質(zhì)疏松癥成為新型公共衛(wèi)生問題。骨質(zhì)疏松癥引發(fā)的骨折具有相當高的發(fā)病率和死亡率[1-2]。中國骨質(zhì)疏松癥患病人數(shù)逐漸增多，已超過9 000萬，占全國總?cè)丝诘?%[3]。我國65歲以上人群骨質(zhì)疏松癥患病率達到32.0%。同時我國還有大批低骨密度人群，屬于骨質(zhì)疏松的高危人群[4]。近年來，隨著社會居民健康意識的提高，人們越來越重視預防骨質(zhì)疏松，增加骨密度類保健食品受到廣泛的研究與關注[5-6]。

氨基葡萄糖是人體結(jié)締組織和軟骨組織的主要成分，可以修補受損的軟骨，還可以通過抑制體內(nèi)超氧自由基、膠原酶及磷脂酶活性，減輕其對軟骨組織的損害，緩解關節(jié)病痛，改善肢體活動狀態(tài)[7]。硫酸軟骨素是存在于人和動物軟骨組織中的一種天然成分，具有潤滑支撐功能，可以增強關節(jié)的活動能力并減緩軟骨流失，阻止關鍵軟骨組織的損傷[8]。鈣是骨骼中的重要組成成分，骨中的鈣鹽可以維持骨骼結(jié)構(gòu)的完整性和硬度，足量鈣營養(yǎng)對維持骨骼健康十分重要[9]。膠原蛋白作為結(jié)締組織中的主要成分，不僅可以促鈣吸收，還可與氨基葡萄糖、硫酸軟骨素協(xié)同作用誘導軟骨再生，防止關節(jié)損傷，有效緩解骨關節(jié)炎[7,10-12]。酪蛋白磷酸肽是牛奶酪蛋白的水解產(chǎn)物，具有極高安全性，可以有效促進鈣的吸收和利用[13]。

試驗以D-氨基葡萄糖鹽酸鹽、硫酸軟骨素鈉、碳酸鈣、魚膠原蛋白及酪蛋白磷酸肽為主要原料制備得到的氨糖軟骨素片為研究對象，按照《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范》中增加骨密度功能的評價方法及判定標準，探究氨糖軟骨素片對大鼠骨密度的影響，為增加骨密度類保健食品的開發(fā)和利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品

氨糖軟骨素片，樣品規(guī)格為每片0.7 g，編號SWBJ180109，神威藥業(yè)集團有限公司生產(chǎn)。每100 g含D-氨基葡萄糖鹽酸鹽24 g，硫酸軟骨素鈉24 g，碳酸鈣24 g，魚膠原蛋白14 g，酪蛋白磷酸肽5 g。

1.2 試驗動物及飼養(yǎng)環(huán)境

SPF級雄性Wistar大鼠70只，體重為71～99 g，北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，合格證號為SCXK（京）2012-0001。試驗環(huán)境為SPF級實驗動物房，溫度20～25 ℃，相對濕度（Hr）40%～70%，使用許可證號SYXK（京）2014-0002。

1.3 試驗儀器

PE AA700型原子吸收光譜儀（美國珀金埃爾默公司）；LUNAR IDXA型雙能X線骨密度儀（美國通用電氣公司）；IP67型精密卡尺（瑞士TESA公司）；HZQ型動物解剖器械（河南恒之奇實業(yè)有限公司）；UW型動物天平（日本島津公司）；DHG-9145A型烘箱（上海合恒儀器設備有限公司）；SKD-18S2型消化爐（上海沛歐分析儀器有限公司）。

1.4 試驗方法

1.4.1 劑量設置及樣品給予方式

試驗設置為7組，即低鈣基礎飼料組，低、中、高劑量氨糖軟骨素片樣品組，低、中、高碳酸鈣模型組。

低鈣基礎飼料組，按照人體每日推薦攝入量4.2 g/（60 kg·BW），相當于人體每天0.07 g/（kg·BW）。氨糖軟骨素片樣品低、中、高劑量組分別為0.35，0.70和1.40 g/（kg·BW），相當于成人每千克體重推薦量的5，10和20倍。依據(jù)氨糖軟骨素片樣品組飼料含鈣量設置低、中、高碳酸鈣模型組（其含鈣量分別與低、中、高劑量樣品組含鈣量相同）。每組10只動物，單籠喂養(yǎng)，所有組別自由進食，飲去離子水，每周稱體重，記錄進食量。試驗周期為13周。

1.4.2 飼料配制

低鈣基礎飼料（g/kg）：酪蛋白100 g/kg，黃豆粉150 g/kg，小麥面粉540 g/kg，花生油40 g/kg，纖維素20 g/kg，淀粉110 g/kg，混合維生素10 g/kg，混合無機鹽26 g/kg，DL-蛋氨酸2 g/kg，氯化膽堿2 g/kg，調(diào)整飼料的含鈣量為1 500 mg/kg左右，飼料中維生素D的含量為1 000 IU/kg。在此低鈣基礎飼料的基礎上配制低、中、高劑量樣品組飼料及低、中、高碳酸鈣模型組飼料。

1.4.3 指標檢測1.4.3.1 體重

大鼠經(jīng)適應期后，分籠飼養(yǎng)13周，每組10只。每周稱1次體重。

1.4.3.2 股骨長度、股骨質(zhì)量測定

大鼠喂養(yǎng)13周后處死，剝離出一側(cè)股骨，在105℃烘箱中烘烤至恒重，冷卻至室溫，測定股骨長度及股骨質(zhì)量。

1.4.3.3 股骨密度測量

用雙能X線骨密度儀測量股骨中心點及股骨遠心端的骨密度。

1.4.3.4 骨鈣含量測定

大鼠一側(cè)股骨烤至恒重后整體采用濕法消化，用原子吸收分光光度法測定骨鈣含量。

1.5 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 11.5 for Windows軟件對各試驗原始數(shù)據(jù)進行方差齊性檢驗，滿足“方差齊”要求的數(shù)據(jù)資料用單因素方差分析方法及多個試驗組和一個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進行統(tǒng)計處理；對非正態(tài)分布或方差不齊的數(shù)據(jù)資料進行適當?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足“正態(tài)方差齊”要求后，用轉(zhuǎn)換所得的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 氨糖軟骨素片對大鼠體重的影響

試驗前各組大鼠體重差異均無顯著性差異（P＞0.05）。在大鼠喂養(yǎng)過程中，各組在第4周，第8周及試驗結(jié)束后體重與低鈣飼料組相比均無顯著性差異（P＞0.05）。試驗結(jié)果表明氨糖軟骨素片對大鼠體重無影響。見表1。

表1 氨糖軟骨素片對大鼠體重的影響（±s，n=10）

表1 氨糖軟骨素片對大鼠體重的影響（±s，n=10）

組別 劑量/(g·kg-1·BW-1) 初始體重/g 第4周體重/g 第8周體重/g 試驗結(jié)束體重/g 增重/g低鈣基礎飼料組 0．07 89．2±6．1 330．9±30．7 450．8±37．8 521．3±49．4 432．1±49．7低劑量碳酸鈣組 0．35 88．0±4．2 342．4±25．9 453．2±42．9 531．3±64．5 443．3±62．6中劑量碳酸鈣組 0．70 87．1±8．2 343．8±25．5 474．4±47．7 566．6±60．3 479．5±56．7高劑量碳酸鈣組 1．40 87．9±5．3 344．3±17．8 462．8±30．2 542．5±41．8 454．6±41．8低劑量樣品組 0．35 87．3±8．8 349．8±29．9 486．1±43．6 566．6±47．2 479．3±46．4中劑量樣品組 0．70 87．1±6．5 343．6±17．7 476．3±33．1 559．5±46．9 472．4±45．3高劑量樣品組 1．40 87．7±6．4 345．2±29．4 469．4±49．5 552．8±60．7 465．1±60．2

2.2 氨糖軟骨素片對大鼠股骨長度、股骨質(zhì)量及骨鈣含量的影響

試驗結(jié)果顯示，各劑量氨糖軟骨素片樣品組及各劑量碳酸鈣模型組的股骨長度及股骨質(zhì)量與低鈣基礎飼料組相比，均無顯著性差異（P＞0.05）。各劑量氨糖軟骨素片樣品組及中、高劑量碳酸鈣模型組股骨鈣含量均高于低鈣基礎飼料組，且具有顯著性差異（P＜0.05）。在飼料鈣含量相似情況下，各劑量樣品組股骨鈣含量不低于相應劑量碳酸鈣模型組，且無顯著性差異（P＞0.05）。見表2。

表2 氨糖軟骨素片對大鼠股骨長度、股骨質(zhì)量及骨鈣含量的影響（±s，n=10）

表2 氨糖軟骨素片對大鼠股骨長度、股骨質(zhì)量及骨鈣含量的影響（±s，n=10）

組別 股骨長度/cm 股骨質(zhì)量/g 骨鈣含量/(mg·g-1)低鈣基礎飼料組4．114±0．052 0．920±0．067 229．6±17．8低劑量碳酸鈣組4．149±0．111 0．931±0．075 242．2±20．3中劑量碳酸鈣組4．151±0．126 0．926±0．062 261．4±26．1*高劑量碳酸鈣組4．117±0．099 0．915±0．062 276．0±21．5*低劑量試驗組 4．105±0．063 0．911±0．104 265．5±19．5*中劑量試驗組 4．150±0．065 0．923±0．065 270．4±30．8*高劑量試驗組 4．147±0．350 0．928±0．078 297．0±25．7*注: *與低鈣基礎飼料組相比, 差異具有顯著性 (P＜0．05)。

2.3 氨糖軟骨素片對股骨密度的影響

中、高劑量氨糖軟骨素片樣品組及中、高劑量碳酸鈣模型組的大鼠股骨遠心端骨密度均高于低鈣基礎飼料組，且具有顯著性差異（P＜0.05）。在飼料鈣含量相似的情況下，各劑量樣品組的大鼠股骨遠心端骨密度與相應劑量碳酸鈣模型組比較，無顯著性差異（P＞0.05）。各劑量氨糖軟骨素片樣品組及各劑量碳酸鈣模型組的大鼠股骨中心骨密度與低鈣基礎飼料組相比，無顯著性差異（P＞0.05）。見表3。

表3 氨糖軟骨素片對大鼠股骨密度的影響（±s，n=10）

表3 氨糖軟骨素片對大鼠股骨密度的影響（±s，n=10）

組別 股骨遠心端骨密度/(g·cm-2)股骨中心點骨密度/(g·cm-2)低鈣基礎飼料組 0．200±0．029 0．176±0．040低劑量碳酸鈣組 0．222±0．023 0．178±0．028中劑量碳酸鈣組 0．232±0．036* 0．167±0．023高劑量碳酸鈣組 0．232±0．036* 0．186±0．013低劑量試驗組 0．205±0．022 0．173±0．024中劑量試驗組 0．234±0．025* 0．166±0．039高劑量試驗組 0．246±0．024* 0．183±0．019注: *與低鈣基礎飼料組相比, 差異具有顯著性 (P＜0．05)。

3 結(jié)論與討論

我國骨質(zhì)疏松癥患病人口多，發(fā)病率高。近年來，為預防、緩解中老年人骨質(zhì)疏松問題，關于增加骨密度類保健食品的研究也越來越多。通過不同劑量氨糖軟骨素片的大鼠飼喂試驗，測定大鼠體重、股骨長度、股骨質(zhì)量、骨鈣含量及骨密度指標，評價氨糖軟骨素片增加骨密度功能。

骨鈣既是人體的支架，又是體內(nèi)鈣的存儲庫，骨鈣缺失會直接影響骨骼的發(fā)育，長期缺乏會導致機體更早出現(xiàn)骨質(zhì)疏松[14]。90 d喂養(yǎng)試驗結(jié)束后，與低鈣基礎飼料對照組相比，各劑量氨糖軟骨素片的大鼠股骨鈣含量均有顯著性升高（P＜0.05），且各劑量樣品組骨鈣含量均不低于相應劑量的碳酸鈣模型組。

骨密度是反映骨骼健康最重要且常用的指標之一，也是骨質(zhì)疏松的一個判定指標，低骨密度會引發(fā)骨質(zhì)疏松性骨折，嚴重影響人的身心及生活質(zhì)量[5,15]。與低鈣基礎飼料對照組比較，中、高劑量氨糖軟骨素片可顯著提高大鼠遠心端骨密度（P＜0.05），且各劑量樣品組骨密度與相應劑量的碳酸鈣模型組比較無顯著性差異（P＞0.05）。

試驗探究以D-氨基葡萄糖鹽酸鹽、硫酸軟骨素鈉、碳酸鈣、魚膠原蛋白及酪蛋白磷酸肽為標志活性成分的氨糖軟骨素片對大鼠骨密度的影響。試驗結(jié)果顯示，氨糖軟骨素片可以顯著提高大鼠股骨鈣含量及骨密度（P＜0.05）。依據(jù)《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范》中增加骨密度功能“試驗組骨鈣含量或骨密度顯著高于低鈣對照組，且不低于相應劑量的碳酸鈣對照組”的判定標準，表明氨糖軟骨素片具備增加骨密度功能。