陳文，王湘君，陳文婧，陳燕，孫宏元，何鴻源

1. 海南熱帶海洋學(xué)院理學(xué)院（三亞 572022）；2. 海南熱帶海洋學(xué)院水產(chǎn)與生命學(xué)院（三亞 572022）

一點紅，頂端處的粉色花蕊，葉的背部呈暗紅色，又名紅背葉等，是菊科一點紅系一年生或多年生草本，分布于中國海南、云南等南方地區(qū)，在海南多為冬季生長。一點紅主要含有黃酮類、生物堿類、植物甾醇、脂肪酸等化學(xué)成分，具有抗氧化、抗菌等藥理活性[1-2]?？傸S酮即黃酮類化合物，具有多種藥理活性，包括抗炎、抑菌、預(yù)防心血管疾病等功能[3]，對免疫力增強有很好的藥理效果。近幾年，科學(xué)技術(shù)呈現(xiàn)一種高墻式的飛躍，對其研究也在逐步深入。廖莉等[4]通過Fenton反應(yīng)的方法建立起體系模型，探究黃酮提取液的濃度與清除率的關(guān)系；陳光孝等[5]在對一點紅抗菌活性研究中確定細(xì)菌的代謝途徑影響一點紅黃酮類化合物的抗菌效果；劉文佳等[6]采用大孔樹脂純化一點紅水提物黃酮。大部分一點紅植株細(xì)胞壁都由纖維素構(gòu)成，植物有效成分往往被包裹在細(xì)胞壁內(nèi)，要使有效成分的溶出變得簡易，可通過纖維素酶降解細(xì)胞壁的作用[7-11]達(dá)到目的，纖維素酶能使細(xì)胞壁疏松、降解，黃酮類物質(zhì)能輕易溶出且不破壞其生物活性，提取效率高。結(jié)合多方面因素，試驗采用響應(yīng)面法結(jié)合纖維素酶法提取一點紅黃酮，含量由高效液相色譜法測定，以保證方法的準(zhǔn)確性，為研究一點紅提供一種新思路，對后續(xù)研究一點紅中黃酮類物質(zhì)和開發(fā)利用一點紅具有現(xiàn)實意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

一點紅全草植株，購于三亞荔枝溝市場；5種黃酮標(biāo)準(zhǔn)品（AR），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；無水乙醇（AR），西隴科學(xué)股份有限公司；石油醚（AR）、磷酸（AR）、氫氧化鈉（AR）、亞硝酸鈉（AR）、硝酸鋁（AR）、甲醇（色譜級），均購于山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司；纖維素酶，河南圣斯德實業(yè)有限公司。

高效液相色譜儀[島津LC-2010A HT，島津企業(yè)管理（中國）有限公司]；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH，廣州市盛藍(lán)儀器制造有限公司）；數(shù)控超聲波清洗機（KQ-250DE，昆山市超聲儀器有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（RE-52，廣州亞榮生化儀器廠）；電子分析天平（CP-210，上海精科天美科學(xué)儀器有限公司）；真空冷凍干燥機（LGJ-10，北京松源華興科技發(fā)展有限公司）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9245A，廣州市盛藍(lán)儀器制造有限公司）；循環(huán)水式多用真空泵（SHB-Ⅲ，南京長城科工貿(mào)有限公司）；高速臺式離心機（TGL-15B，上海安亭科學(xué)儀器廠）；冰箱（BCD-206TS）青島海爾股份有限公司；多功能粉碎機（800C，東莞市方太電器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 一點紅的預(yù)處理

取一點紅全草植株，除去雜質(zhì)自然晾干，經(jīng)烘箱烘干進(jìn)一步脫去水分，置于中藥粉碎機中粉碎，用0.180 mm孔徑（80目）標(biāo)準(zhǔn)篩過篩取細(xì)粉，密封干燥保存，以備試驗使用。

1.2.2 一點紅黃酮的檢測

1.2.2.1 最大吸收波長的測定

用移液槍吸取一定量蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液（c=1.092 mg/mL）置于25 mL比色管中，吸取1 mL 5% NaNO2溶液加入，搖勻放置5 min；吸取1 mL 10% Al(NO3)3溶液加入，搖勻，放置5 min；吸取10 mL 5% NaOH溶液加入，用60%乙醇溶液稀釋至刻度，搖勻放置15 min；以備試驗使用，測其最大最大吸收波長。

1.2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線測定

用移液槍精密吸取0.00，1.00，2.00，3.00，4.00和5.00 mL蘆丁、槲皮素、木犀草素、山奈酚、芹菜素標(biāo)準(zhǔn)溶液（c=1.092 mg/mL）于6支10 mL試管中，配制成不同濃度葡萄糖溶液，在最大吸收波長下測定其吸光度，以濃度作橫坐標(biāo)，吸光度作縱坐標(biāo)繪制蘆丁等5種標(biāo)準(zhǔn)曲線，將試驗得到蘆丁等5種樣品也按此方法測其吸光度，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線可算得5種樣品濃度。

1.2.3 HPLC測定總黃酮

1.2.3.1 色譜條件的確定

色譜條件：島津LC-2010A HT型高效液相色譜儀，流動相為V甲醇∶V0.2%磷酸=60∶40，總流速0.6 mL/min；檢測波長選擇360 nm；進(jìn)樣量10 μL；柱溫箱最低溫度25.0 ℃，最高溫度65.0 ℃；檢測分析時間60 min。

1.2.3.2 進(jìn)樣前預(yù)處理1.2.3.3 流動相

甲醇：準(zhǔn)備2瓶500 mL色譜甲醇，使用溶劑過濾器經(jīng)0.45 μm微孔膜過濾，得到過濾后的甲醇溶液，裝入流動相瓶中，超聲15 min，備用。

0.2%磷酸：用移液槍精密吸取2.353 mL 85%甲醇溶液置于1 000 mL容量瓶，加入屈臣氏水定容，后使用溶劑過濾器過0.45 μm微孔膜，得到過濾后的0.2%磷酸水溶液，裝入流動相瓶中，超聲15 min，備用。

1.2.3.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

準(zhǔn)確稱取各10 mg蘆丁、槲皮素、山奈酚、木犀草素、芹菜素標(biāo)準(zhǔn)品，用色譜甲醇溶解，分別定容至25 mL容量瓶中，配成0.4 mg/mL溶液，各吸取1 mL混合，制成混合標(biāo)準(zhǔn)樣。放入冰箱避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.5 供試樣品溶液制備

準(zhǔn)確稱取4.00 g經(jīng)過篩的一點紅粉末于250 mL的錐形瓶中，選用經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化的最佳條件對一點紅黃酮進(jìn)行提取，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮并回收溶劑，濃縮后的物料置于真空冷凍干燥機中進(jìn)行干燥，干燥時間為24 h；精密稱取13.2 mg經(jīng)干燥后的一點紅黃酮，用甲醇溶解，并定容置于50 mL容量瓶中，所得總黃酮的質(zhì)量濃度為0.264 mg/mL，進(jìn)樣品前均使用0.45 μm微孔膜過濾。

1.2.4 纖維素酶法提取樣品黃酮條件

試驗選擇對纖維素酶用量（mg）、酶解溫度（℃）、提取時間（min）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（%）、料液比（g/mL）這5個單變量因素進(jìn)行考察，考察各個因素對一點紅黃酮提取工藝的影響，再從中篩選出4個影響比較大的試驗因素，完成初步的響應(yīng)面優(yōu)化工作。使用0.45 μm微孔膜過濾；每組試驗稱取一點紅植株粉末，質(zhì)量均為2.000 0 g，每組試驗都進(jìn)行精密度試驗（同一組試驗做3次平行試驗）考察，SRSD均為0.98%以上，符合效能指標(biāo)。

1.2.4.1 不同纖維素酶用量對黃酮提取率的影響

準(zhǔn)確稱取2.000 0 g經(jīng)過篩的一點紅粉末于250 mL錐形瓶中，設(shè)定提取時間90 min、酶解溫度50 ℃，按料液比1∶20 g/mL加入體積分?jǐn)?shù)60%乙醇，提取時，酶用量分別為6，16，26，36和46 mg，分析其結(jié)果得以確定最佳纖維素酶用量。

1.2.4.2 不同提取時間對黃酮提取率的影響

準(zhǔn)確稱取2.000 0 g經(jīng)過篩的一點紅粉末于250 mL的錐形瓶中，固定稱取16 mg纖維素酶酶用量，設(shè)定酶解溫度50 ℃，按料液比1∶20 g/mL加入體積分?jǐn)?shù)60%乙醇，提取時，提取時間分別為30，60，90，120，150和180 min，分析其結(jié)果得以確定最佳提取時間。

1.2.4.3 不同料液比對黃酮提取率的影響

準(zhǔn)確稱取2.000 0 g經(jīng)過篩的一點紅粉末于250 mL的錐形瓶中，固定稱取16 mg纖維素酶用量，設(shè)定提取時間90 min、酶解溫度50 ℃，加入體積分?jǐn)?shù)60%乙醇，提取時，料液比分別為1∶10，1∶20，1∶30，1∶40和1∶50 g/mL，分析其結(jié)果得以確定最佳料液比。

1.2.4.4 不同酶解溫度對黃酮提取率的影響

準(zhǔn)確稱取2.000 0 g經(jīng)過篩的一點紅粉末于250 mL的錐形瓶中，固定纖維素酶酶用量16 mg，設(shè)定提取時間90 min，按料液比1∶20 g/mL加入體積分?jǐn)?shù)60%乙醇，提取時，酶解溫度分別為40，45，50，55，60和65 ℃，分析其結(jié)果得以確定最佳酶解溫度。

1.2.4.5 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對黃酮提取率的影響

準(zhǔn)確稱取2.000 0 g經(jīng)過篩的一點紅粉末于250 mL錐形瓶中，設(shè)定纖維素酶酶用量16 mg、提取時間90 min、酶解溫度50 ℃，提取時，料液比1∶20 g/mL，乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為30%，40%，50%，60%，70%和80%，分析其結(jié)果得以確定最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)。

1.2.5 樣品黃酮提取率的測定

稱取2.000 0 g一點紅全草植株粉末置于250 mL錐形瓶中，添加適量乙醇、適量纖維素酶，置于水浴鍋內(nèi)升至所需溫度，保持恒溫及一定時間對一點紅黃酮進(jìn)行提取，在90 ℃以上沸水浴上滅酶10 min，趁熱抽濾，棄去濾渣，再經(jīng)過高速離心機進(jìn)一步除去濾渣，離心速度6 000 r/min，離心10 min，取上清液在505 nm波長處測吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算黃酮提取率[12-14]。

式中：C為黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；V為樣品稀釋溶液體積，mL；n為稀釋倍數(shù)；m為一點紅粉末質(zhì)量，g。

1.2.6 Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計

為進(jìn)一步優(yōu)化試驗樣品處理的最佳條件、提高試驗的提取率，根據(jù)單變量因素考察結(jié)果，以一點紅總黃酮提取率為指標(biāo)，選取對黃酮提取量影響最大及穩(wěn)定性較弱的4個單因素，采用Design-Expert. V8.0.6.1分析軟件進(jìn)行試驗設(shè)計，根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計原理[15-16]，建立四因素三水平的Box-Behnken中心組合試驗，以黃酮提取率為響應(yīng)值，選取對試驗結(jié)果影響較大的樣品處理條件，選定對提取率影響較大的酶用量（A）、提取時間（B）、酶解溫度（C）和乙醇體積分?jǐn)?shù)（D）作為試驗考察因素，3個水平則根據(jù)4個單變量因素試驗結(jié)果所確定，各因素的3個水平采用-1，0和1進(jìn)行編碼，每個水平都是由單因素變量考察，以確定最優(yōu)提取工藝條件[17-18]，如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗的因素及水平

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精密吸取1 mL經(jīng)處理的混合標(biāo)準(zhǔn)樣，在最大吸收波長505 nm處，按設(shè)定的色譜條件分別進(jìn)樣4，6，8，10和12 μL，從而得到5種黃酮標(biāo)準(zhǔn)品，即蘆丁、槲皮素、木犀草素、山奈酚、芹菜素的峰面積；以質(zhì)量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，運用Excel軟件作曲線圖并得出曲線方程，分析結(jié)果見表2，回歸直線對測定值的擬合程度好，標(biāo)準(zhǔn)曲線可用。

表2 黃酮5種標(biāo)準(zhǔn)液曲線及相關(guān)系數(shù)

2.2 纖維素酶用量對黃酮提取率的影響

如圖1所示，控制其他條件不變，只改變纖維素酶用量，一點紅黃酮提取率隨著纖維素酶用量增加，開始時曲線呈現(xiàn)升高趨勢，酶用量16 mg時提取率最大，隨后逐漸下降。原因可能是：纖維素酶能使一點紅植物細(xì)胞壁疏松、降解，使黃酮能輕易溶出，提取率增大，但當(dāng)繼續(xù)增加纖維素酶用量時，過多的纖維素酶會包裹在一點紅表面，使黃酮溶出變困難，故提取率降低。因此選擇16 mg為最佳纖維素酶酶用量。

圖1 酶用量對一點紅黃酮提取率的影響

2.3 提取時間對黃酮提取率的影響

如圖2所示，控制其他條件不變，只改變反應(yīng)提取時間，一點紅黃酮提取率隨著提取時間延長，開始時曲線呈現(xiàn)升高趨勢，在達(dá)到90 min后繼續(xù)延長提取時間則呈現(xiàn)緩慢下降。原因可能是：剛開始時提取時間較短，酶的降解作用還沒產(chǎn)生效果，黃酮類物質(zhì)還沒有溶出或溶出較少，測得提取率較低，但隨著時間增加，提取率飆升很快，但繼續(xù)增加提取時間，黃酮類物質(zhì)有部分分解，使一點紅黃酮提取率緩慢降低。因此選擇90 min為最佳提取時間。

圖2 提取時間對一點紅黃酮提取率的影響

2.4 料液比對黃酮提取率的影響

由圖3可知，控制其他條件不變，只改變料液比，一點紅黃酮提取率隨著液體比例增加，開始時曲線呈現(xiàn)升高趨勢，料液比1∶20 g/mL時提取率最大，隨著液體比例繼續(xù)增加，提取率變化不大，有略微降低。原因可能是：在合適的料液比下，溶劑與物料一點紅混合得更加充分均勻，使提取率增大，但液體比例過大時，其他物質(zhì)的溶出影響黃酮類物質(zhì)檢測，從而使一點紅黃酮提取率下降。因此選擇1∶20 g/mL為最佳料液比。

圖3 料液比對一點紅黃酮提取率的影響

2.5 酶解溫度對黃酮提取率的影響

由圖4可知，保持其他條件不變，一點紅黃酮提取率隨著酶解溫度增加，開始時曲線先呈現(xiàn)升高趨勢，在酶解溫度50 ℃時提取率出現(xiàn)頂峰，后隨著溫度的增加提取率反而下降。原因可能是：溫度過低時，纖維素酶的活性不大，不能對細(xì)胞壁起到很好的降解作用，隨著溫度的增加，酶活性被激活，提取率逐漸上升，但繼續(xù)提升溫度，過高溫度會導(dǎo)致酶失活，酶發(fā)揮不出原有的作用，使一點紅黃酮提取率降低。因此選擇50 ℃為最佳酶解溫度。

圖4 酶解溫度對一點紅黃酮提取率的影響

2.6 乙醇體積分?jǐn)?shù)對黃酮提取率的影響

由圖5可知，保持其他條件不變，一點紅黃酮提取率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，開始時曲線呈現(xiàn)上升趨勢，乙醇體積分?jǐn)?shù)50%時提取率最大，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加，提取率不增反降。原因可能是：乙醇體積分?jǐn)?shù)過低時，不能很好地溶出一點紅中黃酮類物質(zhì)，致使提取率不大，增加乙醇體積分?jǐn)?shù)至50%提取率最大，說明一點紅提取黃酮在這個范圍下最佳，繼續(xù)增加乙醇體積分?jǐn)?shù)會導(dǎo)致其他色素或除黃酮類以外的物質(zhì)溶出，從而影響黃酮提取率，導(dǎo)致提取率降低。因此選擇50%為最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)。

圖5 乙醇體積分?jǐn)?shù)對一點紅黃酮提取率的影響

2.7 響應(yīng)面法優(yōu)化一點紅黃酮提取工藝

2.7.1 Box-Behnken試驗設(shè)計及其結(jié)果

2.7.1.1 響應(yīng)面試驗回歸方程擬合

通過單變量因素的考察，試驗確定以纖維素酶用量、酶解溫度、提取時間和乙醇體積分?jǐn)?shù)為自變量，一點紅黃酮提取率為因變量，根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計原理，通過Design-Expert V8.0.6.1軟件設(shè)計四因素三水平組合試驗，進(jìn)行29組提取試驗。設(shè)計結(jié)果如表3所示。

表3 Box-Behnken響應(yīng)面分析試驗設(shè)計及結(jié)果

2.7.1.2 響應(yīng)面試驗優(yōu)化分析

依據(jù)回歸模型的分析，經(jīng)過Design-Expert V8.0.6.1軟件對纖維素酶用量、酶解溫度、提取時間和乙醇體積分?jǐn)?shù)4個因素進(jìn)行分析，得到對應(yīng)的等高線圖及響應(yīng)曲面圖，如圖6～圖11所示，可以直觀反映各因素對一點紅黃酮提取率影響。

圖6 酶用量與提取時間作用對提取率影響的響應(yīng)曲面及等高線

圖11 酶解溫度與乙醇體積分?jǐn)?shù)作用對提取率影響的響應(yīng)曲面及等高線

響應(yīng)曲面表明，提取時間在60～120 min之間，纖維素酶用量在6～26 mg之間，提取率呈現(xiàn)先升后降趨勢，圖形呈凸面狀，從圖形的陡峭程度來看時間后半段的交互影響沒有前半段的影響大，這與單因素的影響結(jié)果一致。等高線圖形趨于圓形，反映提取時間和酶用量交互作用不顯著，提取率由中心向外逐漸減小。

響應(yīng)曲面表明，酶用量在6～26 mg之間，乙醇體積分?jǐn)?shù)在40%～60%之間，提取率呈現(xiàn)先升后降趨勢，圖形呈凸面狀，從圖形陡峭程度來看交互影響的結(jié)果明顯。等高線圖形趨于圓形，反映酶用量與乙醇體積分?jǐn)?shù)交互作用不顯著，提取率由中心向外逐漸減小。

圖7 酶用量與乙醇體積分?jǐn)?shù)作用對提取率影響的響應(yīng)曲面及等高線

響應(yīng)曲面表明，酶用量在6～26 mg之間，酶解溫度在45～55 ℃之間，提取率呈現(xiàn)出先升后降的趨勢，圖形呈凸面狀。從圖形的陡峭程度來看酶用量的影響較乙醇體積分?jǐn)?shù)的大，與方差分析的結(jié)果一致。等高線圖形趨于圓形，反映酶用量和酶解溫度交互作用不顯著，提取率由中心向外逐漸減小。

響應(yīng)曲面表明，提取時間在60～120 min之間，酶解溫度在45～55 ℃之間，提取率呈現(xiàn)先升后降趨勢，與單因素結(jié)果一致，圖形呈凸面狀，從圖形陡峭程度來看交互影響的結(jié)果明顯。等高線圖形趨于圓形，反映提取時間與酶解溫度交互作用不顯著，提取率由中心向外逐漸減小。

圖8 酶用量與酶解溫度作用對提取率影響的響應(yīng)曲面及等高線

圖9 提取時間與酶解溫度作用對提取率影響的響應(yīng)曲面及等高線

響應(yīng)曲面表明，提取時間在60～120 min之間，乙醇體積分?jǐn)?shù)在40%～60%之間，提取率呈現(xiàn)先升后降趨勢，與單因素結(jié)果一致，圖形呈凸面狀，從圖形的陡峭程度來看交互影響的結(jié)果明顯。等高線圖形趨于圓形，反映提取時間與乙醇體積分?jǐn)?shù)交互作用不顯著，提取率由中心向外逐漸減小。

圖10 提取時間與乙醇體積分?jǐn)?shù)作用對提取率影響的響應(yīng)曲面及等高線

響應(yīng)曲面表明，乙醇體積分?jǐn)?shù)在40%～60%之間，酶解溫度在45～55 ℃之間，提取率呈現(xiàn)出先升后降的趨勢，與單因素結(jié)果一致，從圖形陡峭程度來看交互影響結(jié)果明顯。等高線圖形趨于圓形，反映酶解溫度與乙醇體積分?jǐn)?shù)交互作用不顯著，提取率由中心向外逐漸減小，中心提取率最大。

2.7.1.3 方差分析

采用Design-Expert. V8.0.6.1軟件對表3數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合及方差分析，經(jīng)擬合后得到以一點紅黃酮提取率為目標(biāo)的函數(shù)，關(guān)于各因素即酶用量（A）、提取時間（B）、酶解溫度（C）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（D）為編碼值的二次回歸方程為提取率=2.84+0.05A-0.02B-0.044C-0.041D-0.095AB+0.023AC-0.043AD+0.038BC+0.033BD-0.073CD-0.268A2-0.278B2-0.367C2-0.272D2。所得的方差分析如表4所示。

由表4所示，獲得回歸方程模型P=0.000 1（P＜0.01），說明該模型具有極顯著的顯著性，即一點紅黃酮提取率與各因素之間的影響顯著，回歸方程模型在統(tǒng)計學(xué)上具有意義，模型一次項A（P=0.088 5）、B（P=0.952 2）、C（P=0.128 1）、D（P=0.157 1）為差異不顯著項。從顯著性的結(jié)果即P值大小可以表明，4個單變量因素影響順序為纖維素酶用量（A）＞酶解溫度（C）＞乙醇體積分?jǐn)?shù)（D）＞提取時間（B）。交互項中AB（P=0.064 3）、AC（P=0.641 7）、AD（P=0.384 1）、BC（P=0.441 2）、BD（P=0.503 3）、CD（P=0.147 6）為差異不顯著項。在二次項中A2（P=0.000 1）、B2（P=0.000 1）、C2（P=0.000 1）、D2（P=0.000 1）為極顯著項。R2=0.929 6，可以認(rèn)為有92.96%的響應(yīng)值變化，數(shù)據(jù)擬合程度較好。根據(jù)Design-Expert V8.0.6.1軟件分析，得出一點紅黃酮最佳提取條件：纖維素酶用量17.02 mg，提取時間89.14 min，酶解溫度49.7 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)49.21%，得出的預(yù)期試驗提取率為2.85%。按照優(yōu)化的條件進(jìn)行工藝驗證試驗，進(jìn)行6次平行測定，由測定結(jié)果，計算出相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（SRSD）是標(biāo)準(zhǔn)偏差（SSD）與平均值的比值再乘以百分之百，即SRSD=（SSD/平均值）×100%[19-20]，6次平行測定的結(jié)果為2.84%，2.88%，2.86%，2.83%，2.84%和2.88%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.76%，重復(fù)性的結(jié)果可靠，且6次測定的結(jié)果與預(yù)期結(jié)果相差不大，該優(yōu)化工藝可靠，具有真實性。

表4 回歸模型的方差分析及顯著性分析結(jié)果

2.8 HPLC試驗結(jié)果與分析

2.8.1 液相圖譜分析

由圖12分析，蘆丁的保留時間為7.356 0 min，槲皮素的保留時間為14.889 0 min，木犀草素保留時間為17.583 0 min，山萘酚的保留時間為23.487 0 min，芹菜素的保留時間為25.579 0 min。

圖12 5種黃酮混合標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

2.8.2 黃酮含量的分析

將一點紅樣品在高效液相測出來的各黃酮含量所對應(yīng)的峰面積（3次平行測定取平均值）代入所對應(yīng)的黃酮標(biāo)準(zhǔn)液的線性方程之中，結(jié)果顯示，蘆丁、槲皮素、山萘酚含量分別為0.144，0.022和0.146 mg/g。樣品的色譜圖及計算結(jié)果見圖13和表5。

表5 一點紅黃酮含量計算結(jié)果

圖13 一點紅樣品色譜圖

由圖13分析，蘆丁的出峰時間為7.356 0 min，槲皮素的出峰時間為14.889 0 min，山萘酚的出峰時間為23.487 0 min，與標(biāo)準(zhǔn)品圖譜相對應(yīng)。

3 結(jié)論與討論

試驗以三亞荔枝溝市場采購一點紅全草植株為研究對象，經(jīng)單因素考察，再通過響應(yīng)面試驗優(yōu)化設(shè)計提取條件，確定纖維素酶提取一點紅黃酮的最佳試驗條件，采用HPLC法測定一點紅中黃酮含量。對單變量因素考察發(fā)現(xiàn)：纖維素酶用量16 mg、酶解溫度50 ℃、料液比1∶20 g/mL、提取時間90 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%為最佳條件；選取其中4個影響較大的因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗優(yōu)化，一點紅黃酮最佳提取條件為纖維素酶用17.02 mg、提取時間89.14 min、酶解溫度49.7 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)49.21%，預(yù)期試驗提取率為2.85%。高效液相色譜條件為流動相V甲醇∶V0.2%磷酸=60∶40、總流速0.6 mL/min、檢測波長360 nm、進(jìn)樣量10 μL、柱溫箱最低溫度25.0 ℃、最高溫度65.0℃、進(jìn)樣檢測分析時間60 min。采用HPLC測一點紅黃酮含量，對照標(biāo)準(zhǔn)樣的色譜圖和樣品色譜圖，可以看出分離結(jié)果較好，可以明顯觀察到蘆丁、槲皮素、山萘酚峰值出現(xiàn)，樣品中蘆丁、槲皮素、山萘酚的含量分別為0.144，0.022和0.146 mg/g，木犀草素和芹菜素未檢出。方差分析發(fā)現(xiàn)纖維素酶用量是影響黃酮提取率關(guān)鍵因素，優(yōu)化工藝可靠，具有真實性。試驗方案條件溫和，能保全黃酮活性不被破壞，具備對黃酮活性后續(xù)試驗連續(xù)性、可操作性及數(shù)據(jù)有效性。該方法不僅能夠提高提取率，同時減少操作成本，操作簡便，提取結(jié)果令人滿意。