胡瑞云，楊柳，王智能，楊婷，尚試雄，沈石妍

云南省農(nóng)業(yè)科學院甘蔗研究所，云南省甘蔗遺傳改良重點實驗室（開遠 661699）

我國是一個人口大國，食糖需求較大，2017—2018年榨季全國共生產(chǎn)食糖1 031.0萬 t，其中，產(chǎn)甘蔗糖916.07萬 t，產(chǎn)甜菜糖114.97萬 t[1]。2021年1—11月份我國成品糖產(chǎn)量為1 165.7萬 t，較上年同期增長3%（該統(tǒng)計口徑為我國已有甜菜制糖及甘蔗制糖、國產(chǎn)糖以及進口加工糖數(shù)據(jù)）[2]。2019年1—11月份中國累計進口糖527萬 t，意味著2021年我國進口糖數(shù)量再創(chuàng)歷史新高[3]。近年來果葡糖漿替代蔗糖應用于食品中的優(yōu)勢已逐步顯露出來，由于果糖的代謝過程不依賴胰島素，易被人體吸收利用，更適用于糖尿病和肝病患者的能量和體液的供應；果糖具有促進微量元素吸收、保護肝細胞、輔助治療酒精中毒、預防齲齒和強化耐力等保健功能[4-5]；結(jié)晶果糖由于純度高、性質(zhì)穩(wěn)定的特點逐漸在食品、醫(yī)藥等行業(yè)得到廣泛應用，市場需求量不斷擴大[6-7]。隨著原料玉米市場化以后，原料成本的降低使淀粉糖在多領域的替代上有增加的趨勢，2017和2018年淀粉糖產(chǎn)量分別為1 450.8萬t和1 632.7萬 t，保持15%和12.5%的增長速度，2019年和2020年增速有所放緩，平均在6%左右的年增速[8]。隨著市場需求增加，在國家農(nóng)業(yè)政策導向及生產(chǎn)補貼等多項利好因素刺激下，淀粉及深加工行業(yè)整體水平都有所提升，2020年中國淀粉深加工產(chǎn)品總產(chǎn)量增加到1 874.2萬 t，同比增長7.9%，其中：2020年中國液體淀粉糖產(chǎn)量增加到1 025.4萬 t，同比增長4.1%；固體淀粉糖（結(jié)晶葡萄糖）產(chǎn)量增加到536.2萬 t[8]，以淀粉糖（葡萄糖粉）為原料生產(chǎn)結(jié)晶果糖可滿足逐步擴大的果糖需求市場。

果糖的生產(chǎn)方法通常可用淀粉液化后經(jīng)糖化酶轉(zhuǎn)化為葡萄糖，經(jīng)葡萄糖異構(gòu)酶異構(gòu)得到果葡糖漿，果葡糖漿分離結(jié)晶得到果糖；也可直接選用葡萄糖產(chǎn)品異構(gòu)生成果葡糖漿，果葡糖漿分離結(jié)晶得到果糖；或者選用蔗糖水解生成果葡糖漿，果葡糖漿分離結(jié)晶得到果糖[9]。試驗針對葡萄糖的異構(gòu)工藝進行正交試驗，并對異構(gòu)過程進行實驗室的模擬擴大試驗，整個連續(xù)異構(gòu)過程共異構(gòu)20 kg葡萄糖液，同時該試驗的設計過程可與蔗糖生產(chǎn)結(jié)晶果糖的試驗[10]作為實驗室小型生產(chǎn)果糖的生產(chǎn)工藝，構(gòu)建一個完整的果糖生產(chǎn)架構(gòu)體系。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

無水葡萄糖、D-果糖、蔗糖（標準品，上海源葉生物科技有限公司）；乙腈（色譜純，默克股份公司）；無水乙醇（色譜純，天津市致遠化學試劑有限公司）；葡萄糖異構(gòu)酶（諾維信有限公司）。

1.2 主要儀器與設備

Φ40×400 mm夾套保溫玻璃砂芯層析柱（康玻實驗設備有限公司）；WYA-2 S數(shù)字阿貝折射儀（上海儀電物理光學儀器有限公司）；DDSJ-308 A電導儀（上海儀電物理光學儀器有限公司）；e 2960液相色譜（美國Waters）；BSA 224 S電子分析天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]；UV-5800 PC紫外分光光度計（上海元析儀器有限公司）；ZD-3 A自動電位測定儀（上海本昌科學儀器有限公司）；BT 100 SV 2-CE蠕動泵（保定雷弗流體科技有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 固定化葡萄糖異構(gòu)酶活力的測定

酶活力的定義：在pH 7.5，溫度70 ℃條件下，1 g異構(gòu)酶1 h所生成1 mg的果糖定義為1個酶活力單位（U/g）。測定方法[11]：稱取0.2 g固定化酶，加入1.5 mL pH 7.5磷酸緩沖液、0.5 mL 61 g/L硫酸鎂溶液和1.6 mL 70 g/L葡萄糖溶液，用純水定容至5 mL，于70 ℃反應1 h，加入5 mL 210 mL/L高氯酸溶液終止反應，測定其中的果糖含量，計算酶活力。

1.3.2 比對pH、Mg2+、Go2+對葡萄糖異構(gòu)酶的影響

分別稱取55.0 g無水葡萄糖，用純水定容至100 g配制成4組50 °Bx的葡萄糖液，按表1調(diào)節(jié)4組樣品糖液，異構(gòu)前各加入10 g葡萄糖異構(gòu)酶，控制糖液異構(gòu)溫度65 ℃，并時常攪拌，每30 min取樣測定異構(gòu)糖液中的果糖含量，考察pH、Mg2+、Go2+對葡萄糖異構(gòu)酶的影響。

表1 葡萄糖糖液樣品表

1.3.3 葡萄糖異構(gòu)正交試驗

分別配制100 g葡萄糖液，調(diào)節(jié)糖液pH在7.4～8.0以內(nèi)，MgSO4·7H2O添加量0.01%，加入10 g葡萄糖異構(gòu)酶，按照試驗設定的異構(gòu)溫度、濃度、時間于水浴鍋中進行三因素四水平正交試驗（見表2），以異構(gòu)生成的果糖得率為判別依據(jù)，確定葡萄糖異構(gòu)的最優(yōu)條件。

表2 葡萄糖異構(gòu)正交試驗設計表

1.3.4 葡萄糖的連續(xù)異構(gòu)擴大試驗

將固定化葡萄糖異構(gòu)酶分為每組100 g，用純水浸濕后分裝入串聯(lián)的5組φ40×400 mm夾套玻璃層析柱中備用。配制適量50%（w/w）葡萄糖液，添加0.01%的MgSO4·7H2O，調(diào)節(jié)糖液pH 7.4～8.0，備用。啟動蠕動泵將65 ℃的熱水依次通過5組異構(gòu)柱預熱柱內(nèi)異構(gòu)酶，保持異構(gòu)柱夾套水溫65 ℃，將預熱至65 ℃的葡萄糖液依次流經(jīng)各異構(gòu)柱，待末組有糖液流出時，每500 mL收集樣液1組，測定果糖異構(gòu)得率、pH、電導率、色值等指標，比對不同流速3 BV/h（25 mL/min）和4.2 BV/h（35 mL/min）的葡萄糖異構(gòu)率。

糖液連續(xù)異構(gòu)速度的定義：以1 g異構(gòu)酶1 h所生成異構(gòu)糖液的體積為1個BV單位，即BV/h。

1.3.5 糖液固形物含量、電導率、色值的測定

方法參照制糖分析相關(guān)方法檢測[12]，果糖、葡萄糖、蔗糖含量的檢測方法采用高效液相色譜法檢測[13]，各指標按式（1）和（2）計算。

式中：E為試樣在420 nm的吸光度；b為比色皿厚度，cm；c為樣液濃度（由改正至20 ℃的折光錘度查表求得），g/mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖異構(gòu)酶活力測定結(jié)果

酶活力測定結(jié)果為483 U/g。按實測酶活指標計算，設定在異構(gòu)酶10 g、pH 7.5、溫度50～65 ℃條件下，異構(gòu)100 g 50%（w/w）葡萄糖液至少需5.18 h。

2.2 pH、Mg2+、Go2+對葡萄糖異構(gòu)酶的影響

2.2.1 pH對葡萄糖異構(gòu)酶的影響

從圖1和表3數(shù)據(jù)看出，在未調(diào)節(jié)pH和調(diào)節(jié)pH的葡萄糖液中，果糖異構(gòu)得率在0.5 h分別上升至13.78%和10.94%，在4.5 h上升至48.26%和47.11%，5.5 h后異構(gòu)趨于最大值。整個異構(gòu)過程顯示在未調(diào)節(jié)pH和調(diào)節(jié)pH的葡萄糖液中異構(gòu)酶均有酶活力，未調(diào)節(jié)pH的糖液酶活力略高于微堿性條件下的酶活力。

圖1 pH對葡萄糖異構(gòu)酶的影響

表3 葡萄糖靜態(tài)異構(gòu)結(jié)果

2.2.2 Mg2+、Go2+對葡萄糖異構(gòu)酶的影響

從圖2和表3數(shù)據(jù)看出，在Mg2+、Go2+的激活作用下，果糖異構(gòu)得率在0.5 h分別上升至17.35%和16.20%，在5.0 h上升至48.27%和48.30%，5.5 h后異構(gòu)趨于最大值。整個異構(gòu)過程顯示Mg2+、Go2+對葡萄糖異構(gòu)酶的影響無明顯差異，對酶的激活效率基本重合。與圖1數(shù)據(jù)同比，在Mg2+、Go2+的激活作用下0.5～2.5 h內(nèi)果糖異構(gòu)得率明顯高于未調(diào)節(jié)pH和微堿性條件下的測定數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)顯示Mg2+、Go2+對異構(gòu)酶均有一定的激活作用，以添加Mg2+和未調(diào)節(jié)pH糖液為例，在0.5 h內(nèi)添加Mg2+可提高果糖得率25.94%。

圖2 Mg2+、Go2+對葡萄糖異構(gòu)酶的影響

2.3 正交試驗結(jié)果

由表4可知，A、B、C三因素的顯著水平值分別為0，0.064和0.010，A、C二因素均小于0.05，即溫度、時間對葡萄糖異構(gòu)結(jié)果有顯著影響，影響力為溫度＞時間＞濃度。表5同樣顯示，三因素影響葡萄糖異構(gòu)的主次順序為A＞C＞B，即葡萄糖異構(gòu)影響力為溫度＞時間＞濃度，異構(gòu)溫度影響力最大。各因素的最好水平是A4B4C4，即各因素的最好水平為溫度65℃、濃度50%（w/w）、時間5.5 h。綜合正交試驗結(jié)果確定異構(gòu)條件：溫度65 ℃、濃度50%（w/w）、時間5.5 h。在該條件下試驗結(jié)果顯示果糖得率為49.11%，接近50%的葡萄糖異構(gòu)的極限值。

表4 葡萄糖異構(gòu)正交設計方差分析表

表5 葡萄糖異構(gòu)正交試驗結(jié)果

2.4 葡萄糖連續(xù)異構(gòu)試驗

2.4.1 糖液流速對異構(gòu)效率的影響

從圖3和表6數(shù)據(jù)看出，流速4.2 BV/h（35 mL/min）時，共收集35組樣品，第5組樣品開始果糖得率升至44.10%，此后在44.10%～46.58%波動，果糖平均得率為45.11%。糖液流速3 BV/h（25 mL/min）時，共收集35個樣品，第5組樣品開始果糖得率升至48.04%，此后在47.32%～49.47%之間波動，果糖平均得率為47.99%，最高可達49.47%，趨于葡萄糖異構(gòu)的最高效率，數(shù)據(jù)顯示，連續(xù)異構(gòu)過程中保持相對較慢的流速，糖液與異構(gòu)酶體有充分的接觸時間，從而可獲得較高的異構(gòu)效率。

圖3 葡萄糖連續(xù)異構(gòu)圖

表6 葡萄糖連續(xù)異構(gòu)結(jié)果

2.4.2 糖液電導率隨時間變化情況

電導率指標代表糖液中含有的離子型非糖液物中的陽離子及二氧化硅等指標[12]，由此數(shù)據(jù)可計算糖液中電導灰分，合理反映糖液的質(zhì)量。從圖4和表6數(shù)據(jù)看出，糖液流速3 BV/h（25 mL/min）時，開始的1～3個樣品電導率較高，至第5組樣品電導率從開始的265.0 μS/cm迅速下降至103.5 μS/cm，此后逐步降低至56.9 μS/cm，樣品平均電導率為87.7 μS/cm。若繼續(xù)保持糖液異構(gòu)，后續(xù)樣品的電導率逐步下降可趨于異構(gòu)前44 μS/cm的糖液電導率。初期電導率較高的主要原因是受異構(gòu)酶本體帶有的紅色色素和顆粒狀的粉末的影響，可適當延長純水過柱時間至電導率降低后開始流加糖液，則可排除異構(gòu)初期電導率和色值較高部分的影響。因異構(gòu)酶采用柱裝形式，酶體顆粒堆積密實，在異構(gòu)過程中酶體呈靜止狀態(tài)，不攪拌酶體顆?？蓽p少粉末導致的污染，加之試驗設置的5組恒溫連續(xù)異構(gòu)裝置中采用的是φ40×400 mm夾套保溫玻璃砂芯層析柱，其中砂芯隔板起到過濾雜質(zhì)的作用，因而糖液的電導率呈現(xiàn)逐步下降趨勢。

2.4.3 糖液pH隨時間變化情況

從圖4和表6數(shù)據(jù)看出，糖液流速3 BV/h（25 mL/min）時，從第1組樣品開始pH從7.79逐步降低，至第11組樣品降至pH 6.92，此后緩慢降低至6.48。連續(xù)異構(gòu)過程中糖液異構(gòu)pH呈現(xiàn)逐步下降趨勢，后期逐漸穩(wěn)定在pH 6.5，說明異構(gòu)酶在pH 6.5仍能保持較好酶活性，這與靜態(tài)試驗中未調(diào)pH狀態(tài)下異構(gòu)酶仍能保持活性的結(jié)論一致。

圖4 糖液異構(gòu)pH、電導率變化圖

2.4.4 靜態(tài)異構(gòu)與連續(xù)異構(gòu)效率的比較

從表7看出，糖液流速3 BV/h（25 mL/min）時，共收集35個樣品，第5組樣品開始果糖得率達到48.04%，耗時僅用1.67 h，較靜態(tài)試驗Mg2+影響的4.5h縮短2.83 h，異構(gòu)效率明顯提高。這是因為連續(xù)異構(gòu)過程中酶的總用量相對于一個時間段的糖液的量顯著增大，且在連續(xù)異構(gòu)過程中糖液的相對運動可與酶體有充分接觸，明顯提高酶的異構(gòu)效率，而靜態(tài)異構(gòu)方式酶的用量僅為糖液量的10%，且酶用量不可能無限加大。

表7 葡萄糖液異構(gòu)前后結(jié)果

2.4.5 靜態(tài)異構(gòu)與連續(xù)異構(gòu)糖液指標的比較

在靜態(tài)異構(gòu)過程中需對糖液攪拌，才能讓顆粒酶體與糖液有充分的接觸，但是攪拌易導致顆粒酶體破碎，影響糖液的色值和電導率指標，而連續(xù)異構(gòu)顆粒酶體為固定方式，連續(xù)異構(gòu)20 kg糖液也能保持顆粒酶體的完整性。從表7數(shù)據(jù)看出：未調(diào)pH的靜態(tài)異構(gòu)電導率從14.7 μS/cm升至350.0 μS/cm，電導率上升2 281%，色值從178 IU升至892 IU，色值上升401%；連續(xù)異構(gòu)電導率從44.0 μS/cm升至73.3 μS/cm，電導率上升67%，色值從200 IU升至225 IU，色值上升13%，電導率指標和色值指標均顯示連續(xù)異構(gòu)的方式優(yōu)于靜態(tài)異構(gòu)。從表6數(shù)據(jù)看出，連續(xù)異構(gòu)20 kg糖液后，糖液的電導率指標降至56.9 μS/cm，若繼續(xù)保持連續(xù)異構(gòu)，電導率可趨于異構(gòu)前的電導率。

3 結(jié)論與討論

前期預備試驗中購買市場上不同品牌的5種粉劑葡萄糖異構(gòu)酶進行試驗，試驗中比對不同溫度、濃度、時間、pH、異構(gòu)酶添加量及Mg2+、Go2+對異構(gòu)酶的影響，試驗均顯示果糖異構(gòu)得率很低，視為異構(gòu)無效。后期采購顆粒狀的固定化葡萄糖異構(gòu)酶，試驗顯示果糖異構(gòu)有效。試驗認為，葡萄糖異構(gòu)的關(guān)鍵因素在于異構(gòu)酶的活性，在酶活性較高的條件下，不需要調(diào)整糖液pH，也不需要加入Mg2+、Go2+激活酶體，糖液在自然狀態(tài)下均可產(chǎn)生果糖的異構(gòu)，這樣可減少異構(gòu)過程中加入過多的試劑導致糖液電導率和色值的升高，可減輕后期糖液脫色脫鹽的負荷。而在酶活性較差的狀態(tài)下，無論采用何種方式也很難激活異構(gòu)酶，因此酶活性的保存顯得尤為重要。

周雪艷[14]用10 g異構(gòu)酶優(yōu)化的連續(xù)異構(gòu)柱高徑比20.83，異構(gòu)速度4.8 BV/h（0.8 mL/min），試驗設置的5組恒溫連續(xù)異構(gòu)裝置共填裝500 g固定化異構(gòu)酶，采用3 BV/h（25 mL/min）異構(gòu)速度連續(xù)異構(gòu)20 kg 50%（w/w）葡萄糖液，異構(gòu)酶的用量下降至2.5%（對糖液總量），異構(gòu)酶仍保持較優(yōu)酶活性，若按異構(gòu)酶的理化指標要求（酶生產(chǎn)能力≥5 t/kg）[7]，則500 g異構(gòu)酶至少可異構(gòu)2.5 t葡萄糖，可滿足小型的葡萄糖連續(xù)異構(gòu)的生產(chǎn)需求。試驗中連續(xù)異構(gòu)柱單柱高徑比7.5，連續(xù)5柱的總高徑比37.5，糖液異構(gòu)流速3 BV/h（25 mL/min），果糖平均轉(zhuǎn)化率達48.43%，該試驗設置與蔗糖生產(chǎn)結(jié)晶果糖的工藝[10]結(jié)合可構(gòu)建一個完整的果糖生產(chǎn)架構(gòu)體系，實現(xiàn)實驗室小型生產(chǎn)結(jié)晶果糖的完整流程。