李奇聰, 金秋珠, 駱海玉*, 顏楨靈, 鄧業(yè)成*, 鄧志勇

(1.珍稀瀕危動植物生態(tài)與環(huán)境保護教育部重點實驗室(廣西師范大學), 廣西 桂林 541006；2.廣西漓江流域景觀資源保育與可持續(xù)利用重點實驗室(廣西師范大學), 廣西 桂林 541006；3.廣西珍稀瀕危動物生態(tài)學重點實驗室(廣西師范大學), 廣西 桂林 541006；4.廣西師范大學 可持續(xù)發(fā)展創(chuàng)新研究院, 廣西 桂林 541006)

柑橘潰瘍病是由柑橘黃單胞桿菌柑橘亞種(Xanthomonascitrisubsp.citri，同物異名為X.campestrispv.citri或X.axonopodispv.citri)引起的一種細菌性病害[1]，是柑橘生產(chǎn)中的重要病害之一，對全球柑橘產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有巨大破壞作用[2-4]。病原菌在柑橘幼果期或新梢抽發(fā)期通過氣孔、傷口等渠道侵染植物果實、葉片及枝梢。植株感染柑橘潰瘍病菌后形成水漬狀病斑，后期病斑逐漸木栓化并呈現(xiàn)火山口狀。染病嚴重時可造成植株葉片和果實大量脫落，影響果實品質(zhì)，并造成大量減產(chǎn)，甚至導致植株死亡，嚴重影響經(jīng)濟效益[5-6]，每年需大量化學藥劑對其進行防治，但由此引起農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染、耐藥性等一系列問題，嚴重阻礙了柑橘產(chǎn)業(yè)的健康綠色發(fā)展之路[7-8]。近年來，具有廣譜、高效、環(huán)境相容性好等特點的生物防治方法，尤其是微生物防治逐漸被重視，國內(nèi)外越來越多研究者圍繞微生物防治柑橘潰瘍病開展研究。

生防微生物是指那些可以用于防治植物病害的有益微生物。自然界中存在大量可以抑制植物病原菌的拮抗微生物，生防微生物自身或其代謝產(chǎn)物具有多種生物活性，可用于抑菌、殺蟲、抗氧化等領(lǐng)域。通過微生物繁殖和微生物發(fā)酵可制成微生物活體農(nóng)藥和微生物代謝產(chǎn)物農(nóng)藥，而實現(xiàn)農(nóng)業(yè)的綠色經(jīng)濟可持續(xù)發(fā)展離不開對生防微生物的研究開發(fā)。

近年來，關(guān)于柑橘潰瘍病生防微生物的研究逐漸增多，包括利用細菌、放線菌、真菌和噬菌體進行生物防治。本文對近20年來用于柑橘潰瘍病防治的微生物的最新研究進行綜述，以期為柑橘潰瘍病生物防治的進一步研究提供參考，不斷推進我國柑橘潰瘍病的科學、高效防治及可持續(xù)治理技術(shù)的應(yīng)用。

1 生防細菌及其作用機制

拮抗細菌及其代謝物的使用被認為是一種很有前途的植物保護策略，已有較多研究從柑橘葉片、果實及柑橘果園的土壤中分離出對柑橘潰瘍病菌具有拮抗作用的細菌。目前研究較多的柑橘潰瘍病菌拮抗細菌包括芽孢桿菌Bacillussp.、假單胞菌Pseudomonassp.和其他菌種(表1)。

1.1 芽孢桿菌及其作用機制

芽孢桿菌在自然界中廣泛存在，不僅是植物根際、土壤等外界環(huán)境中常見的微生物，更是植物體內(nèi)常見的內(nèi)生細菌。芽孢桿菌除可以產(chǎn)生芽孢外，還具有抗逆能力強、繁殖速度快、營養(yǎng)要求簡單、能產(chǎn)生多種抗菌活性物質(zhì)等優(yōu)勢[9]，因此成為植物病原菌拮抗細菌研究的重點和熱點[10]。目前國內(nèi)外已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多對柑橘潰瘍病菌有拮抗作用的芽孢桿菌屬細菌，主要包括枯草芽孢桿菌B.subtilis、解淀粉芽孢桿菌B.amyloliquefaciens和短小芽孢桿菌B.pumilus等(表1)。

應(yīng)用篩選出的芽孢桿菌活菌株或菌劑防治柑橘潰瘍病取得了顯著效果。例如：Das等[11]發(fā)現(xiàn)在田間實驗條件下，噴施枯草芽孢桿菌B.subtilisS-12懸浮液(含細胞2.7×109個/mL)的柑橘植株發(fā)病率顯著下降；Daungfu等[12]發(fā)現(xiàn)從柑橘屬植物中分離得到的解淀粉芽孢桿菌B.amyloliquefaciensLE109的細胞懸浮液和提取物可完全控制柑橘葉片潰瘍病的發(fā)生；陳嬌梅等[13]研究發(fā)現(xiàn)，與單獨使用短小芽孢桿菌B.pumilusYH1菌體或代謝產(chǎn)物相比，使用其培養(yǎng)液(菌體+代謝產(chǎn)物)對離體葉片上柑橘潰瘍病的防治效果更佳。

研究芽孢桿菌的防治機制發(fā)現(xiàn)，其可能通過菌體或產(chǎn)物發(fā)揮防治作用，也可能通過誘導宿主相關(guān)防御酶的產(chǎn)生，提高宿主抗病能力而產(chǎn)生作用。陳力等[14]利用對峙培養(yǎng)法篩選到1株對柑橘潰瘍病菌具有較強抑制作用的枯草芽孢桿菌B.subtilisCQBS03，其對柑橘潰瘍病菌具有抑菌活性的物質(zhì)可能為外泌型蛋白。陳嬌梅等[13]篩選出對柑橘潰瘍病有較好防效的3株芽孢桿菌屬菌株均具有較強的蛋白酶活性。賴家豪等[15]研究發(fā)現(xiàn)3株對柑橘潰瘍病有防治效果的內(nèi)生細菌(其中包含2株芽孢桿菌)，均可不同程度地誘導和增強臍橙樹體內(nèi)防御酶的活性。

綜上所述，盡管國內(nèi)外已篩選出多株對柑橘潰瘍病菌有拮抗作用的芽孢桿菌，但關(guān)于芽孢桿菌拮抗柑橘潰瘍病菌具體機制的研究還比較缺乏，具體抑菌活性物質(zhì)的分離鑒定也極少報道，大多研究均直接使用芽孢桿菌活菌株或菌劑來防治柑橘潰瘍病，田間效果穩(wěn)定性難以得到保證，需要深入研究拮抗芽孢桿菌在田間果園的最佳定殖條件以及作用的活性物質(zhì)，使拮抗菌以最有效的方式定殖于植株，或以最有效成分作用于植株，從而使其生防潛力得到更大發(fā)揮。

1.2 假單胞菌及其作用機制

與芽孢桿菌相似，假單胞菌抑制病原體和產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)的生防潛力一直是研究的熱點。假單胞菌是土壤中廣泛分布的需氧型革蘭氏陰性菌，是一類不呈螺旋狀、或直或微彎，無菌柄和鞘，不產(chǎn)芽孢的桿菌[16]。它是植物根際較普遍的微生物類群之一，此類細菌的多數(shù)種類株系都具有拮抗作用。對柑橘潰瘍病菌具有拮抗作用的菌株有熒光假單胞菌P.fluorescent、銅綠假單胞菌P.aeruginosa等，詳見表1。

巴西隆德里納州立大學Andrade研究團隊篩選出對柑橘潰瘍病菌有拮抗作用的多株假單胞菌，例如銅綠假單胞菌P.aeruginosaLV、P.aeruginosaLN和假單胞菌Pseudomonassp. LN等，并對這些菌株的次生代謝產(chǎn)物進行分離，以評價代謝產(chǎn)物的抑菌活性。該研究團隊Oliveira等[17-18]報道了從感染柑橘潰瘍病的病葉中分離得到的銅綠假單胞菌P.aeruginosaLV次生代謝產(chǎn)物對柑橘潰瘍病的防治效果，發(fā)現(xiàn)其二氯甲烷提取物以及通過活性追蹤得到的活性組分F3在溫室條件下能有效減少柑橘潰瘍病斑形成，與未經(jīng)處理的柑橘植株相比，病斑分別減少80%和94%；并從活性組分F3中分離得到一個具有活性的天然有機銅抗生素類化合物(OAC)。此外，該研究團隊Spago等[19]發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌P.aeruginosaLN的活性組分VLC4f在溫室條件下可減少柑橘植株94%的潰瘍病斑。

阿根廷圖庫曼國立大學Adler團隊[20]則從假單胞菌代謝物中提取嗜鐵素(siderophores)，并研究嗜鐵素對柑橘潰瘍病菌的拮抗活性。從拮抗柑橘潰瘍病菌的銅綠假單胞菌P.aeruginosa發(fā)現(xiàn)具抗生素活性的綠膿桿菌螯鐵蛋白(pyochelin)。隨后，團隊成員先后從對柑橘潰瘍病菌有拮抗作用的熒光假單胞菌P.fluorescens和假單胞菌P.protegensCS1中均提取到新的活性物質(zhì)enantio-pyochelin[21-22]；同時，評估添加鐵和抗壞血酸對其抗菌能力的影響時，發(fā)現(xiàn)補充鐵并未影響柑橘潰瘍病菌對enantio-pyochelin的敏感性，而補充抗壞血酸則大大降低了其敏感性，表明氧化應(yīng)激反應(yīng)可能參與了enantio-pyochelin對柑橘潰瘍病菌的抑制機制[21]。柑橘潰瘍病菌對氧化脅迫的耐受能力較低[21]，結(jié)合細菌氧化應(yīng)激的防治策略值得考慮。

目前，關(guān)于假單胞菌在植物病害生物防治中的作用機制，研究認為它通過分泌一種或幾種抗生物質(zhì)來抑制病原菌的生長[23]，所以生防假單胞菌的研究多集中在從次生代謝產(chǎn)物中篩選活性化合物。國外相關(guān)研究較為成熟的團隊主要報道篩選具拮抗作用的假單胞菌，提取、純化具拮抗活性的化合物，但目前篩選到的化合物應(yīng)用到生產(chǎn)中的還較少。

1.3 其他菌種

除了芽孢桿菌和假單胞菌外，有研究團隊篩選到具拮抗作用的其他菌種。例如，張洪波等[24]從柑橘葉表篩選得到2株對柑橘潰瘍病菌有較好抑制作用的菌株Kx15和Kx48，在溫室內(nèi)對柑橘潰瘍病的防治效果分別為45.6%和55.6%，在果園中對柑橘潰瘍病的防治效果分別為40.3%和47.7%，經(jīng)鑒定分別為葡萄糖桿菌屬Gluconobacter和乳酸桿菌屬Lactobacillus。Gholami等[25]從土壤和受柑橘潰瘍病菌侵染的柑橘健康莖中，分別得到對柑橘潰瘍病菌具有顯著抑制作用的克羅諾桿菌Cronobactersp. DGH1和腸桿菌Enterobactersp. DGH3。

表1 對柑橘潰瘍病菌具拮抗作用的細菌

2 生防放線菌及其作用機制

放線菌能產(chǎn)生多種拮抗物質(zhì)，也成為生物防治領(lǐng)域重點研究的一類微生物。目前從微生物中發(fā)現(xiàn)的生物活性物質(zhì)超過50%由放線菌產(chǎn)生[41]，有多種抗生素已廣泛應(yīng)用到病害防治，例如目前常用的農(nóng)用鏈霉素、春雷霉素及中生菌素。從放線菌中篩選出柑橘潰瘍病菌的拮抗菌株，開發(fā)生防藥劑成為了柑橘潰瘍病生物防治的重要研究方向之一。目前已報道的對柑橘潰瘍病菌具拮抗作用的放線菌主要為鏈霉菌屬菌株，詳見表2。

Wattana-Amorn等[42]從鏈霉菌Streptomycessp. strain 22-4提取到對柑橘潰瘍病菌有抑制作用的2個環(huán)二肽化合物cyclo(L-Pro-L-Tyr)和cyclo(D-Pro-L-Tyr)。馬冠華等[43]通過平板對峙培養(yǎng)法篩選出3株對柑橘潰瘍病菌有拮抗作用的放線菌，其抑菌圈直徑達42.0～60.0 mm，同時，發(fā)現(xiàn)其粗提物可提高柑橘潰瘍病菌菌液電導率、還原糖與蛋白質(zhì)含量，推測是通過影響潰瘍病菌細胞壁和細胞膜通透性起作用。

目前有關(guān)放線菌防治柑橘潰瘍病的應(yīng)用及作用機制報道較少，從放線菌中篩選柑橘潰瘍病菌的拮抗菌株數(shù)量及菌屬分布也較為有限，而開發(fā)柑橘潰瘍病放線菌生防劑具有巨大潛力，后期還可繼續(xù)擴大篩選范圍，并加大應(yīng)用安全性及作用機制方面的研究。

表2 對柑橘潰瘍病菌具拮抗作用的放線菌

3 生防真菌及其作用機制

作為拮抗柑橘潰瘍病菌的一類生防微生物，真菌在柑橘潰瘍病菌生物防治方面具有巨大的開發(fā)潛力，但對真菌的研究程度低于細菌。目前已報道的對柑橘潰瘍病菌具拮抗作用的真菌如表3所示?？紤]到來自極端環(huán)境的真菌產(chǎn)生活性代謝物的潛力，2018年Vieira等[49]從南極土壤和海洋沉積物的真菌中提取對柑橘潰瘍病菌有拮抗作用的次生代謝產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)陸地(土壤)和海洋(沉積物)真菌提取物的平均抑制率分別為94%和97%；對產(chǎn)生抗菌活性代謝產(chǎn)物的菌株進行鑒定，歸為5個不同屬：假裸囊菌屬Pseudogymnoascus，青霉屬Penicillium、Cadophora屬，擬盾殼霉屬Paraconiothyrium和Toxicladosporium屬。該團隊2021年報道了從南極洲海洋沉積物篩選得到的青霉菌Penicilliumsp. CRM1540活性產(chǎn)物的分離和鑒定，獲得活性化合物青霉酸(penicillic acid)；當該化合物濃度為25 μg/mL時，對柑橘潰瘍病菌的體外抑菌率達90%，在活體試驗中，與對照組相比，可有效減少甜橙Citrussinensis(L.) Osbeck葉片中柑橘潰瘍病75.37%的病癥(以病斑數(shù)量計)[50]。Xie等[51]研究叢枝菌根真菌Paraglomusoccultum對柑橘潰瘍病的防治效果，結(jié)果表明，預先接種叢枝菌根真菌的柑橘對潰瘍病抗性明顯增強。顏楨靈等[52]從不同抗病品種的健康柑橘植株不同組織中分離純化得到72株內(nèi)生真菌，并測定其中30株內(nèi)生真菌發(fā)酵提取物對柑橘潰瘍病菌的抑菌活性，結(jié)果顯示，29株內(nèi)生真菌表現(xiàn)出不同程度的抑制活性。

對于生防真菌作用于柑橘潰瘍病菌的相關(guān)機制報道極少。Xie等[51]研究發(fā)現(xiàn)接種叢枝菌根真菌P.occultum(AMF)的柑橘與未接種的相比，其根部過氧化氫(H2O2)、一氧化氮(NO)、鈣調(diào)蛋白(CaM)和水楊酸(SA)的積累明顯增加，同時伴隨著根部PtEPS1(enhance pseudomonas susceptibility 1)和PtPR4(pathogenesis related gene 4)表達水平上調(diào)，表明預先接種AMF真菌的柑橘植株可通過增加信號底物的積累和病原菌防御基因的表達而對柑橘潰瘍病菌的侵染產(chǎn)生更強的抵抗力。

以上研究表明，一些特境真菌，包括極端環(huán)境真菌(南極土壤真菌)、海洋真菌、植物內(nèi)生真菌等，具有產(chǎn)生抑制柑橘潰瘍病菌活性產(chǎn)物的巨大潛力，但目前相關(guān)研究報道仍較少，有待進一步深入開發(fā)和利用。

表3 對柑橘潰瘍病菌具拮抗作用的真菌

4 噬菌體及其作用機制

使用噬菌體作為柑橘潰瘍病防治劑也是一種生態(tài)友好型的防治方法。噬菌體是一種感染細菌的病毒，是環(huán)境的天然組成部分，特異性強、呈指數(shù)傳播等優(yōu)勢使它們成為一種優(yōu)良的生物防治劑。但國內(nèi)關(guān)于利用噬菌體防治柑橘潰瘍病的研究較少，國外關(guān)于噬菌體生物農(nóng)藥的研究相對較為成熟(表4)。Ahmad等[53]分離并鑒定了能夠感染柑橘潰瘍病菌的絲狀噬菌體F1，同時發(fā)現(xiàn)F1可引起受其侵染的柑橘潰瘍病菌細胞的幾個生理變化，包括胞外多糖產(chǎn)生水平降低、活力降低、生長速度減慢、毒力顯著降低，尤其是柑橘潰瘍病菌毒力的降低，表明噬菌體F1具有被用作防治柑橘潰瘍病生防劑的潛力。同年，Ahmad等[54]還報道了能有效附著在宿主細胞(包括耐藥菌株)的2株噬菌體Cp1和Cp2。其中，Cp1可以普遍裂解從日本不同地區(qū)分離得到的柑橘潰瘍病病株[55]。2018年，Yoshikawa等[56]報道發(fā)現(xiàn)1株新型噬菌體N1，該噬菌體具有384 670 bp超大基因組，且比其他感染柑橘黃單胞菌的噬菌體具有更廣泛的宿主特異性，可能成為柑橘潰瘍病噬菌體生物防治的候選菌株。肖逍等[57]分離獲得1株烈性噬菌體P9，體外裂解測定發(fā)現(xiàn)其對供試的柑橘潰瘍病菌具有快速殺菌能力，30 min可以殺滅90%的宿主菌，150 min就可以徹底清除宿主菌，經(jīng)鑒定屬于有尾噬菌體目Caudovirales短尾噬菌體科Podoviridae。

噬菌體在柑橘潰瘍病防治中表現(xiàn)出較大潛力，但將噬菌體用于柑橘潰瘍病的防治還面臨很多難題，例如噬菌體在柑橘葉表的殘留時間短，噬菌體需要在高濃度條件下才能進行有效控制疾病害[58]。噬菌體處理是一種很有前途的柑橘潰瘍病防治新方法。利用噬菌體防治柑橘潰瘍病或生產(chǎn)無潰瘍病苗木是否經(jīng)濟可行、效果滿意，尚需進一步評價。

表4 對柑橘潰瘍病菌有拮抗作用的噬菌體

5 總結(jié)與展望

我國利用生防微生物對柑橘潰瘍病進行生物防治的研究主要集中在篩選對柑橘潰瘍病菌有拮抗作用的芽孢桿菌和放線菌，而國外在生防細菌、生防真菌和噬菌體方面均有研究。國外研究不局限于微生物活體的篩選，還注重篩選有活性的代謝產(chǎn)物，例如Andrade研究團隊歷經(jīng)多年，從銅綠假單胞菌代謝物中分離得到對柑橘潰瘍病菌有較強抑制作用的天然有機銅化合物，但尚未進行結(jié)構(gòu)鑒定；Adler團隊從熒光假單胞菌、銅綠假單胞菌和防御假單胞菌提取嗜鐵素，并研究其對柑橘潰瘍病菌的抑菌機制。與國外相比，我國對柑橘潰瘍病生防微生物的研究范圍比較狹窄，研究層次比較淺，還處在篩選拮抗菌的階段，尚未對活性物質(zhì)進行分離純化，具體抑菌機制也有待深入研究。

國內(nèi)外報道的大多數(shù)生防微生物研究還停留在室內(nèi)實驗和中試階段。在離體與活體2種條件下，拮抗菌株對病菌的拮抗能力不一定存在正相關(guān)關(guān)系，即篩選得到的菌株在實驗室對病原菌的抑菌效果強，卻不一定是田間可應(yīng)用的最好生防菌。既能在田間環(huán)境中產(chǎn)生有效拮抗物質(zhì)，又能適應(yīng)環(huán)境在植株上很好定殖，才是具有應(yīng)用價值的生防菌。因此，柑橘潰瘍病菌生防微生物的研究應(yīng)由實驗向?qū)嶋H生產(chǎn)運用方向發(fā)展，注重田間防治效果。

綜上，目前對柑橘潰瘍病生防微生物的研究主要包括細菌、放線菌、噬菌體和真菌。其中，以細菌中的芽孢桿菌研究較多；從放線菌中分離得到一些活性物質(zhì)，但篩選的菌株種類及數(shù)量均較少；對噬菌體及真菌防治柑橘潰瘍病的研究相對較少。此外，當前生防微生物研究均缺乏具體防治機制的探討，活性成分的分離鑒定也有待深入開展。未來一方面可擴大篩選范圍，篩選不同來源微生物，例如近年來報道的植物內(nèi)生真菌等特境微生物；另一方面，應(yīng)加強田間試驗的開展及安全性評估，促進生防菌的應(yīng)用；此外，還需加強具體作用機制的研究，以期促進柑橘潰瘍病生防菌的開發(fā)應(yīng)用及柑橘產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。