張怡雯， 韋汶言， 趙晶瑾*

(1.珍稀瀕危動植物生態(tài)與環(huán)境保護(hù)教育部重點實驗室(廣西師范大學(xué)), 廣西 桂林 541006；2.廣西師范大學(xué) 環(huán)境與資源學(xué)院, 廣西 桂林 541006)

熒光偏振(fluorescence polarization，F(xiàn)P)技術(shù)具有操作簡單、反應(yīng)快速、穩(wěn)定性好等多種優(yōu)勢，吸引了眾多學(xué)者的關(guān)注[1]。FP理論最早在1926年被發(fā)現(xiàn)和提出[2]。FP檢測技術(shù)是通過分析體系中熒光分子的偏振信號變化差異，實現(xiàn)對分子間相互作用的研究以及所選目標(biāo)物的檢測。能引起偏振信號變化的因素很多，如反應(yīng)物之間的結(jié)合強(qiáng)度、所形成復(fù)合物體積、質(zhì)量大小、溶液性質(zhì)等，偏振信號強(qiáng)度的變化可以通過儀器上的垂直或水平偏振器進(jìn)行檢測，原理如圖1所示[3]。傳統(tǒng)熒光偏振分析方法多是基于抗原與抗體結(jié)合的熒光偏振免疫分析(fluorescence polarization immunoassay，F(xiàn)PIA)技術(shù)，這對實際樣品中痕量分析物質(zhì)的精準(zhǔn)檢測帶來很大限制。隨著核酸技術(shù)的發(fā)展，科研人員研究利用核酸適配體作為目標(biāo)識別單元，拓寬了FP技術(shù)檢測的應(yīng)用范圍[4]，但是仍存在檢測背景高或靈敏度較差等問題。近年來，科研人員借助于材料科學(xué)和標(biāo)記技術(shù)的進(jìn)步，從2個方面開發(fā)了一系列信號放大策略[5]來提高FP檢測技術(shù)的靈敏度：一方面是利用生物大分子和納米材料的質(zhì)量放大法，放大元件如蛋白質(zhì)[6]、金納米粒子(AuNPs)[7]以及氧化石墨烯(GO)[8]等。另一方面是設(shè)計特定的體系來實現(xiàn)目標(biāo)分子循環(huán)信號放大反應(yīng)，此類方法如酶催化的目標(biāo)回收循環(huán)信號放大[9]、目標(biāo)催化的DNA循環(huán)自組裝[10]等。這些方法的開發(fā)顯著促進(jìn)了熒光偏振分析技術(shù)的發(fā)展。由于FP分析技術(shù)適用于均相檢測，無需分離、操作簡單、快速、所需樣品量少，且無毒性和放射性物質(zhì)影響，因此在多學(xué)科領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用，如食品與環(huán)境分析[3]、生命科學(xué)研究[11-12]與高通量篩選和藥物發(fā)現(xiàn)[13]等。

本文綜述熒光偏振技術(shù)在生物小分子、核酸、蛋白質(zhì)與生物酶、金屬離子、農(nóng)藥等生化物質(zhì)分析檢測中的研究進(jìn)展，并對其發(fā)展趨勢進(jìn)行展望。

圖1 熒光偏振信號測量原理[3]Fig.1 Schematic representation of fluorescence polarization measurement[3]

1 熒光偏振技術(shù)在生化分析檢測中的應(yīng)用

1.1 生物小分子檢測

圖2 熒光偏振技術(shù)檢測生物小分子的原理Fig.2 Schematic diagram of the principle of small biomolecules based on fluorescence polarization detection technology

生物小分子參與維持生命正常機(jī)能過程，在人體的新陳代謝、免疫、組織修復(fù)等方面發(fā)揮著重要作用，因此，針對一些生物小分子進(jìn)行快速準(zhǔn)確檢測具有重要意義。半胱氨酸是人體必需的氨基酸和生糖氨基酸，是老年癡呆及心血管等相關(guān)疾病的生理調(diào)節(jié)劑[14]。現(xiàn)有文獻(xiàn)報道的FP分析方法主要是利用核酸適配體實現(xiàn)對生物小分子的特異性識別，通過核酸信號轉(zhuǎn)換，利用納米材料的高負(fù)載優(yōu)勢和質(zhì)量放大策略實現(xiàn)對目標(biāo)分子的高選擇性靈敏測定。Jiang等[15]利用熒光量子點(QDs)和銀納米粒子(AgNPs)作為信號輸出和放大元件，實現(xiàn)半胱氨酸的FP檢測。如圖2(a)所示，核酸探針修飾的QDs和AgNPs通過T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)形成QDs-T-Hg2+-T-AgNPs復(fù)合物，分子量增大，旋轉(zhuǎn)速度變慢，F(xiàn)P顯著增強(qiáng)，當(dāng)半胱氨酸與Hg2+結(jié)合后，QDs探針游離，F(xiàn)P降低。利用QDs和AgNPs的聯(lián)合質(zhì)量放大作用，使檢測限達(dá)到11 nmol/L。基于相似原理，Zhang等[7]利用AuNPs信號增強(qiáng)方法，對半胱氨酸的檢出限為0.5 μmol/L。Ruta等[16]基于熒光分子標(biāo)記的核酸適配體特異性識別L-酪氨酸酰胺和L-精氨酸酰胺建立了FP分析檢測方法，檢測限為100 nmol/L。ATP是人體內(nèi)一種重要的生物活性物質(zhì)，是細(xì)胞代謝活動中重要的調(diào)節(jié)因子，在細(xì)胞各項生理功能中起著關(guān)鍵作用。Huang等[8]開發(fā)了基于核酸切刻內(nèi)切酶信號放大和GO增強(qiáng)的FP適體傳感方法，用于ATP的高靈敏度和高選擇性檢測，檢測限為2.0 pmol/L。Li等[6]基于鄰近效應(yīng)，利用鏈霉親和素增強(qiáng)熒光各向異性構(gòu)建一種可通用檢測小分子的新方法。Fan等[17]利用MoS2納米片作為信號增強(qiáng)元件，建立一種用于ATP檢測的免標(biāo)記方法。如圖2(b)所示，當(dāng)核酸適體探針與ATP結(jié)合后，可以抵抗核酸外切酶I對核酸適體探針的水解，使嵌入有熒光染料的核酸適體探針吸附在納米片表面，F(xiàn)P信號顯著增強(qiáng)，檢測限達(dá)到34.4 nmol/L。該方法利用核酸外切酶作用，有效降低了背景干擾，提高了靈敏度。

1.2 核酸檢測

核酸可分為脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)，是生物體內(nèi)細(xì)胞增殖、分化、發(fā)育的表達(dá)途徑[18]，其中DNA含有生物體的重要遺傳信息，在生物體發(fā)育和正常運轉(zhuǎn)中必不可少。通過DNA雜交、DNA-蛋白質(zhì)結(jié)合等方式，可實現(xiàn)對目標(biāo)核酸的快速識別，再借助核酸信號放大技術(shù)及FP技術(shù)的高度敏感性所構(gòu)建的分析方法，在提高檢測靈敏度方面顯示出良好的性能。Liang等[19]基于AuNP-DNA樹狀大分子信號放大構(gòu)建了一種新型超靈敏、高選擇性檢測HIV-DNA的FP方法，檢測限為73 pmol/L。Zhang等[9]基于目標(biāo)輔助外切酶Ⅲ催化信號放大FP策略，經(jīng)過酶催化循環(huán)降解核酸探針后產(chǎn)生明顯信號差異，DNA檢測限可達(dá)83 amol/L。微小RNA(miRNA)是存在于各種生物體內(nèi)一類長度約為22 個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，在真核基因表達(dá)調(diào)控中有著重要作用。Zhu等[10]使用十面體銀納米粒子增強(qiáng)和鏈置換反應(yīng)循環(huán)信號放大FP方法來檢測miRNA-21，檢測限為93.8 pmol/L。本課題組[20-21]在該方向也開展了研究，如利用硅納米球為信號增強(qiáng)元件，再結(jié)合核酸雜交鏈反應(yīng)構(gòu)建的信號放大FP分析方法，檢測限為35 pmol/L；基于鏈霉親和素修飾的納米球及T7外切酶輔助信號放大開發(fā)的新型FP方法(圖3)，通過納米材料的質(zhì)量放大法和酶輔助核酸雙循環(huán)信號放大策略靈敏檢測miRNA-141，檢測限可達(dá)到1 pmol/L。

圖3 熒光偏振檢測技術(shù)用于miRNA-141分析的原理[21]Fig.3 Schematic diagram of the principle of miRNA-141 based on fluorescence polarization technology[21]

1.3 蛋白質(zhì)與生物酶檢測

蛋白質(zhì)是生命活動的主要承擔(dān)者，在生物體內(nèi)的新陳代謝、生長發(fā)育以及衰老過程中發(fā)揮不可或缺的作用。由于蛋白質(zhì)本身質(zhì)量和體積相對較大，可直接利用免疫識別方法對其進(jìn)行FP檢測，也可利用核酸適配體特異性識別功能，當(dāng)熒光染料修飾的適體探針與目標(biāo)蛋白質(zhì)形成復(fù)合物后，質(zhì)量發(fā)生有效增加，F(xiàn)P值變化顯著。如Nishiyama等[22]通過熒光偏振免疫分析(FPIA)快速定量檢測人血清中新型冠狀病毒抗體。Zhang等[23]設(shè)計一種新穎的基于核酸適體與蛋白質(zhì)結(jié)合使偏振信號減小的方法，實現(xiàn)血液蛋白中凝血酶的靈敏測定。生物酶多數(shù)由蛋白質(zhì)組成，參與生物體內(nèi)的新陳代謝、能量轉(zhuǎn)換等進(jìn)程，目前FP技術(shù)已被應(yīng)用于多種生物酶的分析測定，如凝血酶[22-24]、端粒酶[25]、唾液溶菌酶[26]、末端脫氧核苷酸酶[27]、脫氧核糖核酸酶(DNase)[28]、DNA糖基化酶[29]等。這些方法多數(shù)是利用酶底物鏈和其熒光標(biāo)記的互補(bǔ)鏈雜交前后所引起偏振信號的差異來實現(xiàn)對酶活性的靈敏檢測。Li等[24]基于TiS2納米片的信號增強(qiáng)效應(yīng)開發(fā)一種酶催化放大的FP分析策略，實現(xiàn)對葉酸受體和凝血酶等生物分子的檢測。Zhang等[27]提出基于框架核酸包裹蛋白質(zhì)無機(jī)雜化納米花增強(qiáng)的三級信號放大FP傳感策略，用于定量和定性檢測末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶，檢測限達(dá)到0.023 U/mL。Choi等[28]在基于液滴的微流控芯片中通過無共軛FP分析DNase的活性，成功確定乙二胺四乙酸抑制DNase活性的半數(shù)最大抑制濃度(IC50)為1.56 mmol/L。

1.4 金屬離子檢測

重金屬污染不僅會使生態(tài)環(huán)境惡化，也會通過生物積累作用危害人類健康。鉛離子(Pb2+)是常見的有毒重金屬離子之一，會損害人體腎臟、免疫系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)[30]。通過FP技術(shù)檢測Pb2+的報道較多[31-33]，如Yin等[31]通過AuNPs負(fù)載的熒光核酸探針和金屬核酸酶切割作用，建立一種高靈敏的FP分析法。如圖4(a)所示，當(dāng)目標(biāo)離子被相應(yīng)DNA酶序列識別后，核酸酶催化底物熒光探針斷裂，使含有熒光分子的一端釋放到溶液中，熒光分子脫離AuNPs后其FP信號減小。該方法通過改變核酸探針序列能夠特異性識別檢測Pb2+和Cu2+。汞離子(Hg2+)是環(huán)境中毒性最強(qiáng)的重金屬之一，其毒性可通過食物鏈高度富集和放大[34]，開發(fā)靈敏的汞離子分析方法意義重大。Ye等[35]同樣利用AuNPs作為FP信號增強(qiáng)元件實現(xiàn)Hg2+的特異性檢測(圖4b)，當(dāng)熒光探針通過T-Hg2+-T配位作用與AuNPs形成復(fù)合物后，由于AuNPs在復(fù)合物中的質(zhì)量增強(qiáng)效應(yīng)，F(xiàn)P信號顯著增大，方法檢出限為1.0 nmol/L。Zhang等[36]利用K+介導(dǎo)的G-四鏈體增強(qiáng)設(shè)計了基于Cds-CdTe量子點的新型多功能FP傳感器用于Hg2+的檢測，檢測限為8.6 nmol/L。FP檢測方法也被應(yīng)用于其他重金屬離子的檢測，如Cu2+[31,37-38]、Ag+[11,39-41]、Cd2+[42]等。本課題組[37]通過點擊化學(xué)連接效應(yīng)和二氧化硅量子點輔助FP信號增強(qiáng)開發(fā)一種檢測Cu2+的新方法。Qi等[40]基于熒光染料嵌入不同堿基與Ag+結(jié)合后核酸探針信號的差異變化，設(shè)計一種以二氧化錳納米片輔助信號增強(qiáng)的FP方法，實現(xiàn)對Ag+的靈敏測定，檢測限為9.1 nmol/L。相對于基于原子吸收等大型儀器的金屬離子檢測方法，F(xiàn)P技術(shù)具有儀器操作簡便、反應(yīng)快速、樣品需求少、毒性廢物產(chǎn)生量低等優(yōu)勢，再結(jié)合多種信號放大方法，使FP技術(shù)在金屬離子分析檢測領(lǐng)域得到很好的應(yīng)用。

圖4 熒光偏振技術(shù)檢測金屬離子的原理Fig.4 Schematic diagram of the principle of metal ion based on fluorescence polarization detection technology

1.5 農(nóng)藥及抗菌藥物檢測

農(nóng)藥的過量使用不僅會造成生態(tài)環(huán)境的破壞，還會造成大量農(nóng)藥殘留，威脅人類的生命健康?？股丶翱咕幬锬苡行е斡鞣N細(xì)菌感染性疾病，但濫用抗生素及抗菌藥物也會對人體產(chǎn)生嚴(yán)重危害[43]。目前，應(yīng)用FPIA對農(nóng)藥殘留檢測的技術(shù)已有40多年的發(fā)展，現(xiàn)已基本成熟[44]，適用于多種污染物的快速檢測，表1總結(jié)了近年來FPIA在農(nóng)藥殘留檢測中的應(yīng)用[45-55]。其中Eremin課題組[56]做出許多貢獻(xiàn)，他們建立了三嗪類、苯氧乙酸類、磺酰脲類除草劑等多種農(nóng)藥的FPIA檢測方法。FPIA也被用于農(nóng)藥代謝物的研究，如Shim等[57]建立了6-氯煙酸的FPIA檢測方法，檢出限為4 mg/L。1990年，我國首次建立了血清中慶大霉素[58]的FPIA檢測方法，檢測靈敏度達(dá)0.3 mg/L。隨之將FPIA應(yīng)用于卡那霉素、新霉素及磺胺嘧啶抗菌藥[59-63]的檢測，取得一定成果。相較于FPIA，基于適體識別或核酸信號放大構(gòu)建的FP技術(shù)顯示出更靈敏、檢出限更低的分析效果。Ma等[64]構(gòu)建了一個基于核酸適配體識別的簡單、無標(biāo)記FP傳感方法檢測氯霉素，檢測限為0.06 nmol/L。本課題組[65]也將FP檢測方法成功應(yīng)用于有機(jī)磷農(nóng)藥(OPs)的分析測定，通過農(nóng)藥對乙酰膽堿酯酶活性的抑制作用以及納米片的信號增強(qiáng)效果，使該策略的靈敏度顯著提高，對有機(jī)磷農(nóng)藥二嗪農(nóng)的檢測線性范圍是0.01～20 μg/L，檢測限為0.01 μg/L。

表1 近年來 FPIA 在農(nóng)藥殘留檢測中的應(yīng)用

1.6 其他相關(guān)物質(zhì)檢測

FP技術(shù)在生化相關(guān)物質(zhì)如真菌毒素、腫瘤標(biāo)志物[66-68]、細(xì)胞因子[69-70]等方面的檢測同樣具有一定優(yōu)勢。真菌毒素是真菌在食品或飼料中生長產(chǎn)生的代謝物，對生命健康危害極大，如赭曲霉毒素和黃曲霉毒素都是引發(fā)腎癌、肝癌等疾病的劇毒物質(zhì)。已有文獻(xiàn)[71]報道了基于免疫反應(yīng)的FPIA技術(shù)可用于真菌毒素的競爭性檢測。在最新的FPIA研究中，Nakamura等[72]結(jié)合微流控裝置和便攜式FP分析儀，成功利用FPIA對8種谷物和小麥類食品中脫氧雪腐鐮刀菌醇(DON)進(jìn)行快速、簡便地檢測，標(biāo)準(zhǔn)溶液中DON的檢出限為0.035 μg/L。Huang等[73]分別合成了4種熒光示蹤劑優(yōu)化FPIA方法用于檢測水稻樣品中的赭曲霉毒素A(OTA)，檢測范圍為0.03～0.78 μg/L。Wang等[74]建立一種基于多克隆抗體的快速、廉價FPIA法測定飲料中替那唑酸，檢出限為0.13 μg/L?；谏飩鞲屑夹g(shù)構(gòu)建的FP檢測方法，如：Li等[75]利用賴氨酸羅丹明B標(biāo)記的OTA，分別設(shè)計信號減弱和信號增強(qiáng)型2種FP分析方法，實現(xiàn)對OTA的靈敏快速測定。Huang等[76]基于核酸等溫指數(shù)擴(kuò)增，發(fā)展一種新穎的FP分析策略，以黃曲霉毒素B1(AFB1)為實驗?zāi)Ｐ?，證明該策略的可行性。Ye等[77]利用GO增強(qiáng)檢測信號構(gòu)建基于核酸適體的FP法，實現(xiàn)低成本、高靈敏地檢測AFB1，檢測限為0.05 nmol/L。

外泌體主要來源于細(xì)胞內(nèi)特異性分泌的多囊泡體，參與機(jī)體免疫應(yīng)答、細(xì)胞通訊等方面。但來自腫瘤細(xì)胞的外泌體會介導(dǎo)細(xì)胞間遺傳信息傳達(dá)，促進(jìn)腫瘤的生長與侵襲[78]。因此，外泌體的檢測對癌癥疾病研究和治療具有重要意義。Zhang等[66]利用標(biāo)記有熒光分子的適體探針與外泌體的特異性結(jié)合實現(xiàn)FP信號差異，巧妙地利用外泌體本身的囊泡結(jié)構(gòu)作為質(zhì)量放大信號，達(dá)到快速靈敏的外泌體檢測效果(圖5)。此外，F(xiàn)P技術(shù)在檢測外部細(xì)胞損傷方面也有一定應(yīng)用。當(dāng)細(xì)胞膜內(nèi)物質(zhì)受到損傷后，膜內(nèi)活性物質(zhì)會發(fā)生改變，影響細(xì)胞膜的流動性[79]。如果直接把熒光素標(biāo)記在細(xì)胞膜上，受損傷的細(xì)胞膜流動性發(fā)生變化，其FP值也會隨之發(fā)生變化?；诖嗽砜煽焖贆z測出體內(nèi)損傷的細(xì)胞，目前已用于檢測CT26細(xì)胞[80]、心肌細(xì)胞[81]、胃細(xì)胞[82]等。

圖5 熒光偏振檢測技術(shù)用于外泌體分析的原理[66]Fig.5 Schematic diagram of the principle of exosomes based on fluorescence polarization detection technology[66]

2 總結(jié)與展望

熒光的偏振性對于分子質(zhì)量、體積、結(jié)合和解離都非常敏感，由此而發(fā)展的FP技術(shù)具有簡便快速、直觀靈敏等優(yōu)勢。本文簡要介紹熒光偏振技術(shù)的原理及其在生化分析檢測領(lǐng)域中的應(yīng)用。傳統(tǒng)的方法主要基于抗原與抗體結(jié)合的熒光偏振免疫技術(shù)，但是隨著核酸技術(shù)和納米材料的發(fā)展，研究者們已經(jīng)開發(fā)出敏感性更強(qiáng)、靈敏度更高的熒光偏振分析技術(shù)。同時為獲得更佳的分析效果也可以與其他技術(shù)手段相結(jié)合發(fā)展聯(lián)用技術(shù)，如：可用于多組分分析的時間分辨熒光偏振技術(shù)(TRFPA)[83]、時間分辨熒光各向異性成像技術(shù)(TR-FAIM)[84-85]、毛細(xì)管電泳激光誘導(dǎo)熒光偏振(CE-LIF-FP)[86]等。不過，該技術(shù)的應(yīng)用仍然存在易受干擾、標(biāo)記成本較高等局限。因此，開發(fā)穩(wěn)定性強(qiáng)、成本更低、功能多樣的熒光偏振檢測技術(shù)將成為未來關(guān)注的重點。目前的發(fā)展主要呈現(xiàn)以下幾個趨勢：1)選取多元化的偏振信號增強(qiáng)元件。除了選擇蛋白質(zhì)、核酸以及納米顆粒、納米片等具有較大質(zhì)量的增強(qiáng)元件，還可以隨著新材料等研究的進(jìn)步，繼續(xù)開發(fā)新型的信號增強(qiáng)元件，提高檢測穩(wěn)定性和靈敏度、擴(kuò)大檢測范圍。2)發(fā)展新型無標(biāo)記檢測模式。該技術(shù)不僅檢測成本低、分析速度快和操作簡便，還有利于實現(xiàn)對分析樣品的直接測定。3)開發(fā)便攜的小型化儀器。實際樣品在采集運輸過程中可能受到污染，影響檢測的準(zhǔn)確性，便攜小型化儀器對工作環(huán)境適應(yīng)力強(qiáng)，可現(xiàn)場實時定量檢測分析物。4)拓展應(yīng)用于復(fù)雜的實際樣品中。實際環(huán)境中檢測技術(shù)易受環(huán)境變化和干擾物的影響，提高FP分析方法的選擇性，使其在復(fù)雜的實際樣品中具有廣泛適用性。