石磊泰，鄒 劍，李玉華，俞永新

進入21世紀后，狂犬病仍然是重要的公共衛(wèi)生威脅，全世界每年因犬介導的狂犬病死亡的人數(shù)估計有59 000人，大多數(shù)死亡發(fā)生在亞洲(59.6%)和非洲(36.4%)。印度為當前狂犬病疫情最嚴重的國家，印度狂犬病死亡的人數(shù)在亞洲(占狂犬病死亡人數(shù)的59.9%)以及全世界均居首位(占狂犬病死亡人數(shù)的35%)[1-2]。第二位是中國，2007年狂犬病疫情高峰時，發(fā)病人數(shù)為3 300例。從2004年到2016年，狂犬病病死數(shù)量一直位居國內(nèi)傳染病死亡人數(shù)前三位?？梢?，我國狂犬病疫情形勢嚴峻[3]。

狂犬病一旦發(fā)病，病程進展迅速，幾乎100%死亡，潛伏期可以從數(shù)天到數(shù)年，目前為止尚無特效治療藥物，有效預防手段只有對動物和人開展疫苗接種?？刂坪拖麥缛祟惪袢〉母敬胧┲校瑢θ愡M行大規(guī)模免疫接種是最根本有效的措施。在西歐、中歐、加拿大和美國大部分地區(qū)應用減毒活疫苗通過誘餌投放的方式口服免疫野生動物，已成功消除當?shù)氐暮袢〔⑦_到減少和控制人狂犬病的效果[4-6]。同時，世界衛(wèi)生組織(WHO)極力鼓勵研究和發(fā)展安全有效的犬用誘餌口服疫苗用于家犬，并已研究制定了現(xiàn)場應用口服犬用疫苗指南[7]，一些高度減毒的減毒株如SAG2和VRG株已被WHO建議用于流浪犬的口服免疫[8-9]，并已在很多國家廣泛應用[10-12]。目前，狂犬病減毒活疫苗的研究仍在不斷進展中，并已取得良好的結(jié)果，一些高度減毒、免疫原性良好的新減毒株已被篩選出來。

本實驗室早在20世紀80年代就開始了口服狂犬病減毒活疫苗的研究，在早期階段，培養(yǎng)了一種毒性較弱的減毒株CTN-181，該毒株對4周齡小鼠沒有致病性，但對3周齡及以下小鼠仍有致病性[13]，其遺傳穩(wěn)定性較差[14]。

為了進一步篩選出毒力更低、減毒特性更穩(wěn)定、免疫原性更好的疫苗株，我們將CTN-181在豚鼠頜下腺中進行3次傳代，然后通過噬斑進行純化，獲得1株對3周齡小鼠腦內(nèi)接種無致病力、對乳鼠腦內(nèi)致病力明顯減弱、免疫原性良好、遺傳穩(wěn)定性高的減毒株，命名為CTN181-3[14]。

本文對CTN181-3株的表型和基因型特性及其遺傳穩(wěn)定性進行全面的研究，為開發(fā)一種可用于動物口服和人體肌內(nèi)接種的減毒活疫苗提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 毒種和細胞 狂犬病毒CTN181-3株為本文研究用毒株；CTN-1株為CTN-181株的親本株，CTN-181株為CTN181-3的親本株，均由本室篩選并保存[15-16]；Vero細胞和BHK21細胞由ATCC提供，BSR細胞由巴斯德研究所提供。

1.2 實驗動物 昆明乳鼠和小鼠，Hartley豚鼠，SPF級，由中國食品藥品檢定研究院動物繁育場提供；金黃地鼠由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物實驗均按我國動物福利要求完成。

1.3 病毒毒力測定 將CTN181-3病毒分別腦內(nèi)接種于2周齡和3周齡小鼠，0.03 mL/只；口腔接種3周齡小鼠和8周齡金黃地鼠，0.1 mL/只，觀察21 d，記錄動物的發(fā)病死亡結(jié)果，同時以空斑法(PFU/mL)測定病毒滴度(PFU/mL)。

1.4 病毒空斑(PFU)滴定 在六孔板中制備單層BHK21細胞，將待測病毒稀釋液稀釋成10-1～10-7系列，每個稀釋度做復孔，每孔加0.2 mL；用病毒稀釋液作空白對照。輕輕搖勻，置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中，吸附1 h后每孔加甲基纖維素 4 mL 覆蓋，在 5% CO2、35 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，7 d后棄掉覆蓋物，每孔加入2 mL結(jié)晶紫染料，染色15 min后計數(shù)，計算病毒的噬斑形成單位(PFU/mL)。

1.5 CTN181-3株的傳代穩(wěn)定性

1.5.1 乳鼠腦內(nèi)傳代毒力穩(wěn)定性 將CTN181-3株腦內(nèi)接種1～3 d齡乳鼠，待乳鼠發(fā)病瀕死時無菌取腦，研磨后制成病毒懸液，腦內(nèi)接種相同日齡乳鼠連續(xù)傳5代，分別測定每代病毒材料的lgPFU和lgLD50，LD50測定采用3周齡小鼠腦內(nèi)接種法，0.03 mL/只。

1.5.2 豚鼠頜下腺傳代毒力穩(wěn)定性 將CTN181-3株頸部皮下注射2只豚鼠，每只接種1 mL,注射后2 d收取豚鼠頜下腺，研磨制成病毒懸液，病毒懸液在BHK21細胞上增殖一代后以同法接種豚鼠傳下一代，共在豚鼠頜下腺連續(xù)傳4代，分別測定每代病毒材料的lgPFU和lgLD50，LD50測定采用3周齡小鼠腦內(nèi)接種法，0.03 mL/只。

1.5.3 細胞傳代后毒力穩(wěn)定性 將CTN181-3株分別在BSR細胞和Vero細胞上連續(xù)傳10代，用3周齡小鼠對傳代后毒株進行腦內(nèi)(0.03 mL/只)和肌內(nèi)(0.1 mL/只)毒力測定。

1.6 病毒全基因序列測定

1.6.1 引物設計及合成 根據(jù)GenBank中登錄號為FJ959397的CTN-1株設計8對引物，用于CTN181-3株全基因組分段擴增和序列測定，見表1。

表1 狂犬病病毒CTN克隆株全基因組分段擴增所用引物Tab.1 Primers used for CTN complete genome amplification

1.6.2 病毒RNA的提取及病毒基因組的分段PCR擴增 用QIAamp病毒RNA提取狂犬病病毒CTN181-3的基因組RNA。使用GoScript逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用表1中的引物進行PCR分段擴增。反應體系共50 μL：10 μL 5×Phusion HF緩沖液、1 μL 10 mmol/L dNTP、2.5 μL上游和下游引物、1.5 μL DMSO、0.5 μL DNA聚合酶、2 μL cDNA和去離子水。反應條件：在98 ℃下初始變性30 s；98 ℃持續(xù)10 s，53 ℃持續(xù)30 s，72 ℃持續(xù)90 s，總共30個循環(huán)；在72 ℃下延伸5 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定，通過QIA快速凝膠提取試劑盒進行純化和回收。

1.6.3 PCR擴增產(chǎn)物的克隆、序列測定及序列拼接與分析 將PCR純化產(chǎn)物與pGEM-T載體系統(tǒng)連接后轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，挑取陽性克隆，菌落PCR鑒定無誤后測序。每個片段至少應送3個陽性克隆進行雙向測序驗證。測序結(jié)果通過DNAStar和MegAlign軟件進行拼接分析。

2 結(jié) 果

2.1 CTN181-3株對實驗動物的毒力 以5.10 lgPFU/只的高滴度病毒腦內(nèi)接種3周齡小鼠均無致病性；對2周齡小鼠的致病性亦明顯降低，如以4.10 lgPFU/只病毒接種時，只有20%小鼠死亡。以5.60 lgPFU/只的病毒量口腔感染3周齡小鼠和8周齡地鼠，觀察21 d均無動物出現(xiàn)發(fā)病死亡,見表2。

表2 CTN181-3對小鼠和金黃地鼠的毒力Tab.2 Pathogenicity of CTN181-3 in mice and golden hamsters

結(jié)果顯示，CTN181-3株對3周齡小鼠腦內(nèi)接種無致病性，對2周齡小鼠腦內(nèi)接種呈現(xiàn)低毒力；口腔感染3周齡小鼠和8周齡金黃地鼠后實驗動物無發(fā)病死亡。

2.2 CTN181-3的傳代穩(wěn)定性

2.2.1 在乳鼠腦內(nèi)和豚鼠頜下腺傳代后的毒力穩(wěn)定性 CTN181-3通過乳鼠腦內(nèi)連續(xù)傳5代，病毒滴度可達7.10 lgPFU/mL，第1、3、5代乳鼠腦懸液對3周齡小鼠腦內(nèi)接種未見發(fā)病。另通過豚鼠頜下腺連續(xù)傳4代，病毒滴度最高可達7.63 lgPFU/mL，分別用4個代次豚鼠頜下腺病毒懸液接種到3周齡小鼠的腦內(nèi)，沒有發(fā)病，這表明CTN181-3保持了減毒病毒的穩(wěn)定性，并且沒有出現(xiàn)減毒特性的回復，結(jié)果如表3所示。

表3 CTN181-3在乳鼠腦內(nèi)和豚鼠頜下腺培養(yǎng)傳代后病毒的毒力穩(wěn)定性Tab.3 Neroattenuation stability of CTN181-3 after serial passages in brains of suckling mice and submandibular glands of guinea pigs

2.2.2 細胞傳代毒力和基因穩(wěn)定性 CTN181-3株在BSR細胞和Vero細胞上各傳10代后，分別得到CTN181-3 B10和CTN181-3 V10,兩傳代株病毒的神經(jīng)毒力經(jīng)3周齡小鼠腦內(nèi)和肌內(nèi)測試，結(jié)果小鼠均未發(fā)病和死亡，見表4。結(jié)果顯示，CTN181-3株經(jīng)乳鼠腦內(nèi)、豚鼠頜下腺和兩種細胞培養(yǎng)多代后，未見病毒毒力返祖，說明CTN181-3株遺傳穩(wěn)定性為十分穩(wěn)定。

表4 CTN181-3 B10株和V10株對3周齡小鼠的致病性Tab.4 Pathogenicity of the B10 strain and V10 strain in 21-day-old mice

2.3 CTN181-3株基因型特性及其減毒基因的分析

2.3.1 CTN181-3的基因特征 CTN181-3株的基因全序列長度為11 924 bp，已被納入GenBank，登錄號為KU946961。其基因組組成與GenBank上發(fā)表的其他狂犬病病毒基因組一致。從3′端到5′端，先導RNA、5個蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基因(N、P、M、G、L)和非編碼尾部結(jié)構(gòu)依次排列。其中3′先導區(qū)包括59個核苷酸，5′非編碼區(qū)包括71個核苷酸。各結(jié)構(gòu)基因皆包括3′端AACA和5′端的polyA尾結(jié)構(gòu)。N基因位于 60～1 484 nt，ORF為72～1 424 nt，編碼450個氨基酸；P基因位于1 487～2 475 nt，ORF為1 516～2 409 nt，編碼297個氨基酸；M基因位于2 481～3 283 nt，ORF為 2 496～3 104 nt，編碼202個氨基酸；G基因位于3 289～5 355 nt，ORF為3 316～4 890 nt，編碼524個氨基酸；L基因位于5 380～11 853 nt，ORF為5 407～11 793 nt，編碼2 128個氨基酸。各結(jié)構(gòu)基因間隔區(qū)分別為2、5、5、24 個核苷酸。

2.3.2 基因同源性比較 從GenBank挑選國內(nèi)外已公開發(fā)表的狂犬病疫苗株和街毒株的基因組序列與我國的狂犬病毒減毒株進行全基因組的同源性分析。

狂犬病毒減毒株CTN181-3與國內(nèi)外疫苗株和街毒株的全基因組同源性在81.4%～93.3%，與國內(nèi)4個分離株HN10、BD06、DRV和MRV的同源性為82.9%～93.3%，而與國外分離株的同源性僅為81.4%～84.4%。見表5。說明CTN181-3株與國內(nèi)分離株在遺傳進化過程中親緣關系較近；而與國外其他疫苗株和街毒株的同源性則較低，親緣進化關系較遠。

表5 CTN181-3與其他株狂犬病病毒全長核苷酸和氨基酸同源性比較(%)Tab.5 Comparison of full-length-sequence nucleotide and amino acid similarity among CTN181-3 and other rabies virus strains (%)

2.3.3 CTN181-3的減毒基因分析 與致病性較高的CTN-1株相比，CTN181-3株在P基因5′端的mRNA polyA尾終止信號A7區(qū)段有1個A殘基的丟失。CTN181-3與CTN-1的同源性為99.8%，與CTN-181的同源性為99.9%。CTN181-3與其親本株CTN-181、CTN-1的所有核苷酸和氨基酸差異位點見表6。

表6 CTN-1、CTN-181和CTN181-3核苷酸和氨基酸位點差異Tab.6 Summary of nucleotide and amino acid differences among CTN-1,CTN-181 and CTN181-3

結(jié)果顯示，CTN181較其母株CTN-1發(fā)生了8個氨基酸位點(N、M、G、L區(qū)各發(fā)生1、1、4、2個)的突變，其中[G276 L(TTG)→V(GTG)和L1496 M(ATG)→W(TGG)]2位氨基酸突變在CTN181株未發(fā)生，為CTN181-3株特有。由此我們認為，CTN181-3的毒力高度減弱、遺傳穩(wěn)定性高度穩(wěn)定的分子基礎為上述8個位點氨基酸突變的共同作用，而G276和L1496位氨基酸突變則導致CTN181-3株的毒力進一步降低。

3 討 論

本文對實驗室培育篩選到的CTN181-3減毒株的致病性、分子特性和遺傳穩(wěn)定性進行了系統(tǒng)研究。CTN181-3株對實驗室狂犬病敏感動物無論是腦內(nèi)還是口腔感染均無致病性，在同等病毒量的前提下，第1代病毒CTN-1株對4周齡及以上小鼠有致病性；第2代病毒CTN-181株對4周齡小鼠無致病性，但對4周齡以下小鼠有致病性[13]；而第3代病毒CTN181-3株對3周齡小鼠無致病性；三代病毒對小鼠的致病性呈下降趨勢，毒力逐代降低減弱。毒力穩(wěn)定性方面，CTN181-3株病毒通過乳鼠腦內(nèi)、豚鼠頜下腺、不同的細胞株多代傳代，病毒的致病性沒有發(fā)生改變，減毒基因也保持不變，均無回復突變發(fā)生。因此，用CTN181-3株制備口服活疫苗可以避免病毒對外傳播引起任何動物致病的危險性。以上結(jié)果達到了WHO和國外用于野生動物和犬口服疫苗的基本要求，如在全球廣泛應用的SAG2株，以6.5 lgPFU的劑量腦內(nèi)注射6周齡成年小鼠不致病，乳鼠腦內(nèi)回傳5代毒力未返祖[10]。

與國內(nèi)外疫苗株和街毒株進行全基因組同源性對比分析，狂犬病毒減毒株CTN181-3株與國內(nèi)外疫苗株和街毒株的全基因組同源性在81.4%～93.3%，與國內(nèi)4個分離株HN10、BD06、DRV和MRV的同源性為82.9%～93.3%，而與國外分離株的同源性僅為81.4%～84.4%。說明CTN181-3株與國內(nèi)分離株在遺傳進化過程中親緣關系較近；而與國外其他疫苗株和街毒株的同源性則較低，親緣進化關系較遠。

從CTN181-3株與其親本株CTN181以及CTN-1株[17-18]的全基因序列分析結(jié)果來看，與狂犬病毒毒力密切相關的G333位點[19]，已經(jīng)由CTN-1株的精氨酸變?yōu)镃TN181株和CTN181-3株的谷氨酰胺，毒力已經(jīng)大幅降低；而與毒力相關的另一位點G194[20-21]，無論是CTN-1株、CTN181株還是CTN181-3株，該位點均為天冬酰胺，而不是會導致毒力升高的賴氨酸。就CTN181-3株而言，這2個毒力關鍵位點已經(jīng)顯示出低毒力的分子特征。

與CTN181株相比，CTN181-3株有4個氨基酸位點發(fā)生變化，分別是G266位點由N(AAT)變?yōu)镈(GAT)，G276位點由L(TTG)變?yōu)閂(GTG)，G299位點由K(AAA)變?yōu)镽(AGA)，L1496位點由M(ATG)變?yōu)閃(TGG)。其中G276(V)和L1496(W)為CTN181-3株特有。CTN181-3株除保留CTN181株的減毒基因外，另發(fā)生2個氨基酸的突變。因此，可認為這2個氨基酸是CTN181-3株毒力進一步減弱的分子基礎。

綜上所述，CTN181-3株的神經(jīng)毒力高度減弱，毒力十分穩(wěn)定。其實驗室指標與被WHO認可并推廣應用近30年的口服疫苗株SAG2相當[10]，是一株良好的狂犬病口服活疫苗候選株，目前對犬和其他大型動物的實驗以及田間試驗正在計劃之中。

利益沖突：無

引用本文格式：石磊泰，鄒劍，李玉華，等.1株狂犬病毒減毒株的毒力和分子特性研究[J]．中國人獸共患病學報，2022，38(9)：790-795，801.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.114