陳云英，王冰潔，潘星羽，余婉容，吾力江·卡馬力，趙 莉，班萬里，劉 帥，郭 璐，段蘭利，徐 晶，穆尼拉·特列吾汗，喻昌盛，烏云花，張壯志

細(xì)粒棘球蚴病俗稱囊型包蟲病(Cystic echinococcosis，CE)，是由細(xì)粒棘球絳蟲(Echinococcosisgranulosus，Eg)中絳期幼蟲引起的一種人獸共患寄生蟲病[1-2]。Eg在犬的小腸內(nèi)發(fā)育為成蟲，45 d后發(fā)育為帶有孕節(jié)的成蟲釋放蟲卵，蟲卵隨糞便排出體外，污染外界環(huán)境[3]。在中亞地區(qū)，至少有2.7億人處于囊型棘球蚴病的高危環(huán)境中[4]。2012—2016年的一項(xiàng)全國調(diào)查顯示，中國西部地區(qū)約有5 000萬人有感染該病的風(fēng)險(xiǎn)，其中約有17萬人是棘球蚴病患者[5]。我國是包蟲病發(fā)病率最高的國家之一，病例多發(fā)于新疆、寧夏、西藏等以畜牧業(yè)為主要經(jīng)濟(jì)來源的地區(qū)[6]，該病主要寄生于肝肺，危害主要以機(jī)械性損害為主，嚴(yán)重程度取決于感染棘球蚴的體積、數(shù)量、寄生時(shí)間等[7]。

包蟲病在我國高發(fā)流行，但目前缺乏有效的技術(shù)手段控制該病。犬作為傳播的核心傳染源，缺乏有效的疫苗接種，關(guān)鍵原因在于缺乏明確功能的疫苗靶基因。通過差異顯示和基因組學(xué)研究不同發(fā)育階段的蟲體，發(fā)現(xiàn)EgM9基因是細(xì)粒棘球絳蟲成蟲階段的特異基因，尤其在其體表和睪丸中高表達(dá)[9]。用原核表達(dá)抗原接種犬可明顯減少蟲體數(shù)量和抑制蟲體發(fā)育，提示EgM9可能是蟲體發(fā)育尤其是睪丸發(fā)育的關(guān)鍵基因，影響精子的產(chǎn)生。目前在GenBank中還沒有發(fā)現(xiàn)與編碼EgM9蛋白的相似序列，對于EgM9蛋白的功能以及成熟蟲體蟲卵的基因表達(dá)的研究也不是十分清楚[10]。EG-09888基因在細(xì)粒棘球絳蟲成蟲減數(shù)分裂受精卵的形成過程中高表達(dá)[11-12]，所以本試驗(yàn)通過建立細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴(protoscoleces,PSCs)向成蟲方向發(fā)育體外培養(yǎng)模型，用熒光定量PCR方法確定不同發(fā)育時(shí)期EgM9及EG-09888的表達(dá)情況，為探索EgM9基因在細(xì)粒棘球絳蟲成蟲發(fā)育中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 倫理申明 本研究獲得了新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所倫理委員會的批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號：2021-03)，所有動物均按照中華人民共和國動物倫理程序和指南進(jìn)行處理。

1.2 蟲株 細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴(PSCs)采自于新疆烏魯木齊市華凌市場新鮮屠宰的自然感染細(xì)粒棘球蚴的綿羊肝臟，細(xì)粒棘球絳蟲(Eg)由本實(shí)驗(yàn)室分離保存。

1.3 主要試劑 RPMI-1640培養(yǎng)基、雙抗(Hyclone公司)；胎牛血清(BI)；酵母、葡萄糖、牛磺膽酸鹽、胰蛋白酶、胃蛋白酶、1%亞甲基藍(lán)(Sigma公司)；蘇木素染液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；RNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、2×SG Fast qPCR Mix(上海生工生物技術(shù)有限公司)。

1.4 方 法

1.4.1 原頭蚴的采集 將自然感染帶有包囊的綿羊肝臟帶回實(shí)驗(yàn)室，用蒸餾水沖洗肝臟表面，用75%酒精進(jìn)行表面消毒，在超凈臺中切開包囊，吸出囊液，從中分離出細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴，用含雙抗的PBS清洗5遍。

1.4.2 原頭蚴的活力檢測 按照1∶10的比例加入1%的胃蛋白酶溶液(pH2.0)，37 ℃水浴消化30 min后，用含雙抗的PBS清洗3遍，1 μL原頭蚴加入1%亞甲基藍(lán)9 μL染色3 min檢測活力。活性好的原頭蚴呈無色，活性差的呈藍(lán)色，重復(fù)3次取平均值，活力達(dá)到99%以上的原頭蚴可用于體外培養(yǎng)試驗(yàn)。若活力在95%以下，建議增加漂洗次數(shù)除去活力不佳的原頭蚴后重新檢測[13-14]。

1.4.3 體外培養(yǎng)模型的建立 將5 000枚原頭蚴加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入含20%胎牛血清的完全培養(yǎng)基(61 mLRPMI-1640，20 mL胎牛血清，10 mL 2%胰蛋白酶，4.5 mL 5%酵母，1.5 mL 3%葡萄糖，1 mL青鏈霉素，1 mL 0.2%?；悄懰徕c，1 mL HEPS)，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第2 d換液觀察有無污染情況，棄掉原培養(yǎng)基，加入新鮮的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。每隔3 d換1次液，每天鏡下觀察蟲體狀態(tài)。

1.4.4 不同發(fā)育時(shí)期蟲體收集 培養(yǎng)第0 d、第1 d、第5 d、第20 d、第30 d、第40 d、第50 d的蟲體在顯微鏡下觀察拍照并收集樣本，分別保存于4 ℃、4%多聚甲醛中和-80 ℃、RNA later中，用于后續(xù)的H&E染色、RNA提取及熒光定量PCR檢測。

1.4.5 不同發(fā)育時(shí)期蟲體H&E染色 將保存于4%多聚甲醛中的蟲體經(jīng)蒸餾水沖洗數(shù)次后，用稀釋10倍的蘇木素染液染色過夜，用30%～70%酒精逐級脫水，1%鹽酸-酒精褪色10 s，透明15～30 min，中性樹膠封片。

1.4.6 引物設(shè)計(jì)和合成 參照GenBank上已公布的β-Actin(XM_024499161)、EgM9(AF482720)、EG-09888(XM_024499137)mRNA基因序列使用Primer Premier 5.0分別設(shè)計(jì)引物，送北京鼎國昌盛生物科技有限公司合成。β-Actin的引物序列為F：5′-GGTTACATCCCTCCGACCTTG-3′，R：5′-AA-GCAGCCTCCTCTTGAGTG-3′，Tm=60 ℃，片段大小為243 bp；EgM9的引物序列為F：5′-GTGAATTTTGCCTGCCCGTT-3′，R：5′-GCACA-ACCTCAGTCATGGGT-3′，Tm=65 ℃，片段大小為142 bp；EG-09888的引物序列為F：5′-AATCAGGGTCCCAACGTCAT-3′，R：5′-ATCGCA-ACGTGAAGAACTCG-3，Tm=65 ℃，片段大小為183 bp。

1.4.7 RNA提取、cDNA合成 取蟲體10 μL(約2 000條)按RNA提取試劑盒操作步驟提取蟲體RNA，并用Mighty Script第一鏈cDNA合成Master Mix(去基因組DNA)試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.4.8 熒光定量PCR反應(yīng) 熒光定量PCR反應(yīng)體系20 μL：2×SG Fast qPCR Mix 10 μL，上下游引物各0.8 μL(10 μmol/L)，cDNA 1 μL，用ddH2O補(bǔ)至20 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 預(yù)變性3 min；95 ℃ 變性3 s，65 ℃ 退火/延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本3個(gè)重復(fù)，程序結(jié)束后自動得出熔解曲線。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴向成蟲方向體外發(fā)育模型的建立 細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴向成蟲方向體外發(fā)育模型見圖1。獲得的Eg原頭蚴活力近99%，Eg原頭蚴呈現(xiàn)兩種形態(tài)：一種為頂突凹入，一種為頂突外翻(圖1A)。培養(yǎng)第1 d時(shí)原頭蚴活力較好，少部分原頭蚴出現(xiàn)外翻(圖1B)；培養(yǎng)第5 d時(shí)原頭蚴出現(xiàn)明顯伸縮蠕動，有部分原頭蚴頭節(jié)外翻，頂突和4個(gè)吸盤完全翻出(圖1C)；第15～21 d時(shí)大量原頭蚴開始外翻且體節(jié)有增長趨勢，頸部以下狹窄和清晰的區(qū)域標(biāo)志著第1節(jié)片已形成生殖器官雛形(圖1D)；在第21 d時(shí)，出現(xiàn)了明顯的分節(jié)現(xiàn)象，產(chǎn)生幼節(jié)(圖1E)；第30～40 d分節(jié)現(xiàn)象逐漸明顯，幼節(jié)長度逐漸增長(圖1F-G)；第50 d產(chǎn)生成節(jié)，此時(shí)蟲體形態(tài)為3個(gè)節(jié)片(圖1H)。

A：PSCs活力鑒定(1%亞甲基藍(lán)染色成活率為99%)；B：體外培養(yǎng)第1 d的PSCs；C：體外培養(yǎng)第5 d的PSCs；D：體外培養(yǎng)第10 d的PSCs；E：體外培養(yǎng)第20 d的PSCs；F：體外培養(yǎng)第30 d的PSCs；G：體外培養(yǎng)第40 d的PSCs；H：體外培養(yǎng)第50 d的PSCs。圖1 顯微鏡下體外發(fā)育不同時(shí)期蟲體形態(tài)變化(10×)Fig.1 Morphological changes of PSCs in different developmental stages in vitro(10×)

2.2 蟲體H&E染色結(jié)果 體外培養(yǎng)不同時(shí)期的蟲體經(jīng)H&E染色(圖2)，第0 d原頭蚴呈圓形，內(nèi)部可見內(nèi)陷的頂突小鉤(圖2A)；體外培養(yǎng)至10 d時(shí)，頂突開始外翻，朝鏈體節(jié)方向發(fā)育，有少量鈣質(zhì)小體(圖2B)；第20 d時(shí)出現(xiàn)分節(jié)現(xiàn)象產(chǎn)生幼節(jié)(圖2C)；第21～40 d時(shí)隨著時(shí)間的推移幼節(jié)長度也在增長，鏈體節(jié)的節(jié)片由此向后連續(xù)長出(圖2D-E)；在50 d時(shí)產(chǎn)生成節(jié)(圖2F)。

A：體外培養(yǎng)第0 d的PSCs；B：體外培養(yǎng)第10 d的PSCs；C：體外培養(yǎng)第20 d 的PSCs；D：體外培養(yǎng)第30 d的PSCs；E：體外培養(yǎng)第40 d的PSCs；F：體外培養(yǎng)第50 d的PSCs。圖2 體外發(fā)育不同時(shí)期蟲體H&E染色(10×)Fig.2 H&E staining of PSCs at different stages of development in vitro(10×)

2.3 引物特異性 內(nèi)參基因和目的基因的熔解曲線見圖3。從熔解曲線可看出，β-Actin、EgM9、EG-09888基因的熔解溫度均為65 ℃，基線平穩(wěn)，呈單峰，無非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物和二聚體，表明引物具有極好的特異性。

A：β-Actin基因熔解曲線；B：EgM9基因熔解曲線；C：EG-09888基因熔解曲線。圖3 內(nèi)參基因和目的基因的熔解曲線Fig.3 Melting curves of reference and target genes

2.4EgM9基因在細(xì)粒棘球絳蟲體外發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)分析 從圖4中可以看出，EgM9基因隨著體外培養(yǎng)天數(shù)的增加其表達(dá)量也在升高，第20 d表達(dá)量與第0 d比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.31，P<0.05)；第20、30、40 d表達(dá)量變化不明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.072，P>0.05)；第50 d表達(dá)量最高，與之前不同培養(yǎng)天數(shù)蟲體的表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=11.32，P<0.05)。EgM9和EG-09888基因在各時(shí)期的表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖4。

①：P<0.05；②：P>0.05圖4 蟲體不同發(fā)育階段EgM9和EG-09888基因的表達(dá)情況Fig.4 PSCs expression of the EgM9 gene and EG-09888 gene in different developmental stages

3 討 論

體外培養(yǎng)寄生蟲是在無菌、適當(dāng)?shù)臏囟?、濕度和必需營養(yǎng)物質(zhì)條件下體外完成整個(gè)生長發(fā)育過程并維持其結(jié)構(gòu)和功能，具有可以簡化其生長環(huán)境、方便添加試驗(yàn)因素、容易觀測試驗(yàn)結(jié)果的優(yōu)點(diǎn)。由于體內(nèi)培養(yǎng)試驗(yàn)存在一定不便，如棘球蚴的生長發(fā)育不能清晰直觀地觀察和研究。因此，對細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴的體外培養(yǎng)，很多學(xué)者進(jìn)行了不同的嘗試[15-18]。本試驗(yàn)采用“無干擾、非宿主的”厭氧培養(yǎng)體系，該體系不存在外來生物組織、細(xì)胞及細(xì)胞因子等，通過加入適量膽酸鹽和胰蛋白酶為原頭蚴提供最佳培養(yǎng)條件，原頭蚴可以在完全沒有宿主細(xì)胞的情況下保持活性并發(fā)育。

在我們的研究中原頭蚴體外培養(yǎng)第3～5 d外翻率為70%～80%。培養(yǎng)第17～21 d外翻率為60%～70%，并觀察到第1節(jié)片的產(chǎn)生；培養(yǎng)第25～30 d和第37～40 d，表現(xiàn)為幼節(jié)的增長；培養(yǎng)第50 d，成節(jié)出現(xiàn)。但在培養(yǎng)50 d后，蟲體不能進(jìn)一步發(fā)育并出現(xiàn)了崩解現(xiàn)象，不再發(fā)現(xiàn)其他生殖器官的明顯發(fā)育。由于寄生蟲生活史較復(fù)雜，加之對營養(yǎng)要求高，因此體外培養(yǎng)比較困難，終末宿主犬腸道系統(tǒng)的多樣化環(huán)境，不僅包括腸道內(nèi)容物，還包括潛在的宿主分泌因子都對其體內(nèi)成蟲發(fā)育具有相關(guān)作用，但體外培養(yǎng)未能提供其生殖發(fā)育相關(guān)因子，可能是導(dǎo)致其生殖器官不明顯的主要因素。體外培養(yǎng)原頭蚴的生長發(fā)育與培養(yǎng)體系的穩(wěn)定性、pH值、溫度以及原頭蚴的密度等有很大關(guān)系[15,19-20]。根據(jù)Mohammadzadeh等[21]研究顯示體外培養(yǎng)的原頭蚴向成蟲方向發(fā)育總是落后于犬體內(nèi)的發(fā)育，表示體外培養(yǎng)蟲體具有一定滯后性，且均未發(fā)現(xiàn)生殖器官的全面發(fā)育。

張文寶等[9-10]篩選出了成熟蟲體的特異性表達(dá)基因，即EgM9基因家族，進(jìn)行免疫實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示EgM9蛋白免疫效果最好，可以使蟲體發(fā)育受阻，減卵率達(dá)到97.7%，蟲體數(shù)量明顯減少。趙莉等[22]監(jiān)測重組蛋白EgM9免疫犬的特異性抗體變化，證實(shí)EgM9與Iscom佐劑結(jié)合能引起犬特異性免疫應(yīng)答。郭寶平等[23]也對EgM9抗原的免疫保護(hù)作用進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證實(shí)了EgM9蛋白對犬有很好的免疫保護(hù)效果。EgM9基因可能是蟲體發(fā)育尤其是睪丸發(fā)育的關(guān)鍵基因，影響精子的產(chǎn)生。因此，本試驗(yàn)以β-Actin基因?yàn)閮?nèi)參，對蟲體不同發(fā)育階段EgM9和EG-09888基因的表達(dá)情況進(jìn)行研究，采用熒光定量PCR的相對定量，通過2-ΔΔCt法可以將定量結(jié)果校正為以細(xì)胞或基因組為單位，從而使不同樣品之間具有可比性，可用于比較mRNA的表達(dá)情況[24-25]。雖然通過形態(tài)學(xué)鑒定未觀察到培養(yǎng)的蟲體體內(nèi)有明顯的雄性器官如睪丸的產(chǎn)生及雌性器官子宮的產(chǎn)生，但通過熒光定量PCR檢測EgM9和EG-09888基因在各時(shí)期表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由于EG-09888基因調(diào)控細(xì)粒棘球絳蟲減數(shù)分裂中精子的發(fā)生，在細(xì)粒棘球絳蟲成蟲階段高表達(dá)，預(yù)示蟲體有雄性器官發(fā)育形成的趨勢，也證實(shí)EgM9與EG-09888基因在細(xì)粒棘球絳蟲成蟲中共同管控精子的產(chǎn)生和發(fā)育。但由于體外培養(yǎng)蟲體發(fā)育的滯后性，因此未能觀察到生殖器官的明顯特征。體外培養(yǎng)的蟲體第3節(jié)片產(chǎn)生時(shí)，其EgM9基因表達(dá)量就開始增高，可能是由于蟲體進(jìn)行減數(shù)分裂，向成蟲階段發(fā)育。

綜上所述，通過體外培養(yǎng)，可以獲得不同發(fā)育時(shí)期的細(xì)粒棘球絳蟲，為研究基因表達(dá)以及基因干預(yù)提供材料，同時(shí)明確EgM9基因在成蟲發(fā)育及蟲卵產(chǎn)生中的功能，可為其作為犬用疫苗靶抗原奠定理論基礎(chǔ)。

利益沖突：無

引用本文格式：陳云英，王冰潔，潘星羽，等.細(xì)粒棘球絳蟲體外不同發(fā)育時(shí)期EgM9基因差異表達(dá)研究[J]．中國人獸共患病學(xué)報(bào)，2022，38(9)：784-789.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.119