李 燁，劉佳星，岳 莉，查曉丹，戚應(yīng)杰

（安徽省立醫(yī)院感染病院檢驗(yàn)科，安徽合肥 230000）

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引發(fā)的慢性感染性疾病，是自2007年來(lái)傳染病致死的主要原因，以肺結(jié)核最為常見，并且明顯有逐年增加之勢(shì)，但是對(duì)于其早期的診斷至今仍較為困難。根據(jù)《肺結(jié)核診斷WS 288-2017》規(guī)定，肺結(jié)核的實(shí)驗(yàn)室檢查有病原學(xué)檢查（包括微生物學(xué)和分子生物學(xué)檢查）、結(jié)核病病理學(xué)檢查、免疫學(xué)檢查及支氣管鏡檢查，但均有一定的局限性，如結(jié)核菌素試驗(yàn)不能排除接種卡介苗的影響，γ-干擾素釋放實(shí)驗(yàn)在活動(dòng)性肺結(jié)核（ATB）、潛伏性結(jié)核（LTBI）的診斷中特異度不高等[1]。故對(duì)其優(yōu)化和改良是目前TB檢測(cè)研究的重要方向。近些年隨著蛋白質(zhì)組學(xué)和基因組學(xué)的發(fā)展，一些新的結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷項(xiàng)目也逐步應(yīng)用于臨床。熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）是一種健康狀態(tài)下，在原核和真核生物中廣泛分布的蛋白質(zhì)。根據(jù)已有的研究報(bào)告顯示，在特定的生理及病理狀態(tài)下，比如細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的變化—胞內(nèi)細(xì)菌感染如結(jié)核分枝桿菌感染[2]，胞內(nèi)寄生蟲感染如惡性瘧原蟲感染等情況下，均可誘發(fā)熱休克蛋白基因的表達(dá)[3]。根據(jù)其相對(duì)分子質(zhì)量的不同可分為五大類，其中，HSP90在細(xì)胞中含量豐富，分布于大部分細(xì)菌中；根據(jù)來(lái)源和亞細(xì)胞定位HSP90可分為四種異構(gòu)體，其中位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的Hsp90α主要參與快速反應(yīng)，如應(yīng)激等[4-7]。本文旨在研究Hsp90α在ATB患者和LTBI患者血液中的表達(dá)差異及其是否能夠作為一種區(qū)別二者的新的生物標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2021年1月至6月在安徽省立醫(yī)院感染病院就診的結(jié)核分枝桿菌感染患者146例為觀察組，其中ATB組81例記為活動(dòng)組，LTIB組65例記為潛伏組。其中，活動(dòng)組男性50例，女性31例；年齡18～86歲，平均年齡（54.47±4.61）歲。 潛伏組男性37例，女性28例，年齡17～87歲，平均年齡（53.38±5.06）歲。兩組各項(xiàng)一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。所有參與研究的患者均簽署知情同意書并獲得安徽省立醫(yī)院感染病院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。診斷標(biāo)準(zhǔn)：ATB診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]：活動(dòng)性肺結(jié)核診斷參考《肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)（WS288—2017）》，具有典型的胸部影像學(xué)特征和臨床表現(xiàn)，同時(shí)經(jīng)病原學(xué)（包括細(xì)菌學(xué)和分子生物學(xué)）或者組織病理學(xué)證實(shí)。LTBI診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]：感染者無(wú)ATB感染的臨床表現(xiàn)也無(wú)胸部影像學(xué)特征,結(jié)核菌素皮試（tuberculin skin test，TST）及γ-干擾素釋放試驗(yàn)（interferon-γ release assay，IGRA）呈陽(yáng)性反應(yīng)判斷者。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合上述診斷標(biāo)準(zhǔn)者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并腫瘤；②妊娠期患者；③合并自身免疫性疾病。

1.2 檢驗(yàn)方法儀器與試劑：Hsp90儀定量檢測(cè)試劑盒（煙臺(tái)普羅吉生物科技發(fā)展有限公司），EDTA-K2抗凝管；肝素抗凝管；結(jié)核分枝桿菌特異度細(xì)胞免疫反應(yīng)檢測(cè)試劑盒（廣東希格生物科技有限公司）

試驗(yàn)：所有試驗(yàn)按照說(shuō)明書進(jìn)行。結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)：Hsp90α定量檢測(cè)：Hsp90α正常值＜82 ng/mL。 T細(xì)胞酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)（T-spot.TB）結(jié)果判讀：陰性對(duì)照測(cè)孔斑點(diǎn)數(shù)＜10個(gè)，且實(shí)驗(yàn)孔斑點(diǎn)數(shù)減去陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)≥11，結(jié)果判讀為陽(yáng)性；陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)為11～20個(gè)時(shí)，測(cè)試孔斑點(diǎn)數(shù)減去陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)＞陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)，結(jié)果判讀為陽(yáng)性。若上述標(biāo)準(zhǔn)不符合且陽(yáng)性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)正常時(shí)，結(jié)果為陰性。無(wú)效結(jié)果：當(dāng)陰性對(duì)照空斑點(diǎn)數(shù)＞20時(shí)，結(jié)果無(wú)效。

1.3 觀察指標(biāo)①兩組Hsp90α、T-spot斑點(diǎn)數(shù)比較。②血漿Hsp90α和T-spot斑點(diǎn)數(shù)在輔助診斷ATB中的價(jià)值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)分析及ROC曲線均采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料為非正態(tài)分布，ATB組、LTBI組及非結(jié)核類肺疾病組的Hsp90α水平和T-spots斑點(diǎn)數(shù)用以中位數(shù)（上下四分位數(shù)）[M（P25，P75）]表示，數(shù)據(jù)分析前先以 Kolmogorov-Smimov 檢驗(yàn)判斷各組數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布規(guī)律，兩組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者的Hsp90α、T-spot斑點(diǎn)數(shù)比較兩組Hsp90α水平和T-spot斑點(diǎn)數(shù)分別比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。其斑點(diǎn)圖比較見圖1、 圖2。

圖1 活動(dòng)性肺結(jié)核、潛伏型肺結(jié)核患者Hsp90α水平比較

圖2 活動(dòng)性肺結(jié)核、潛伏性肺結(jié)核患者T-spot.TB細(xì)斑點(diǎn)點(diǎn)數(shù)比較

表1 三組Hsp90α、T-spot斑點(diǎn)數(shù)比較

2.2 血漿Hsp90α和T-spot斑點(diǎn)數(shù)在輔助診斷ATB中的價(jià)值根據(jù)ROC曲線可得，Hsp90α輔助診斷ATB的臨界值為81.5 ng/mL，在此處對(duì)應(yīng)的敏感度為74.1%，特異度為81.8%，ROC曲線下面積為0.745（95%CI：66.4%～82.6%），見圖3。而T-spot.TB輔助診斷ATB的臨界值為43.5，在此處所對(duì)應(yīng)的敏感度為40.7%，特異度為84.4%，ROC曲線下面積為0.624（95%CI：0.536～0.712），見圖4。

圖3 活動(dòng)組和潛伏組的Hsp90αROC曲線圖

圖4 活動(dòng)組和潛伏組的T-spot斑點(diǎn)數(shù)ROC曲線圖

3 討論

WHO《2020年全球結(jié)核病報(bào)告》[10]中通報(bào)了2019年全球結(jié)核病新發(fā)病例996萬(wàn)例，死亡病例110萬(wàn)例，其中中國(guó)約83.3萬(wàn)例，占全球結(jié)核病例數(shù)的8.4%，居全球第三位。新發(fā)肺結(jié)核病例主要由LTBI患者發(fā)展而來(lái)，其中5%～10%的LTBI進(jìn)展為ATB。T-spot.TB是目前結(jié)核特異度刺激抗原的T細(xì)胞IFN-γ釋放分析診斷結(jié)核感染的最主要方法，但研究顯示，T-spot.TB雖然在檢測(cè)肺結(jié)核方面有很大的價(jià)值，但它不能區(qū)分肺結(jié)核是活動(dòng)性的、陳舊性的還是潛伏性的，它的陰性結(jié)果相對(duì)而言在排除結(jié)核病方面意義更大[11]。此外，T-spot.TB結(jié)果的解釋受多種因素影響，包括診斷標(biāo)準(zhǔn)、既往結(jié)核病史、非結(jié)核分枝桿菌感染、年齡和病灶位置。其診斷結(jié)核病的敏感度及特異度在不同的研究中結(jié)果差異也較大[12]。而從本次研究結(jié)果可以看出，Hsp90α定量檢測(cè)在區(qū)分ATB和LTBI的敏感度上要遠(yuǎn)高于T-spot.TB而特異度略低，說(shuō)明當(dāng)Hsp90α值升高時(shí)對(duì)輔助診斷ATB的意義更大。

本次研究著重在于分析Hsp90α在ATB患者血液中的表達(dá)，從上述結(jié)果可以看出，外周血血漿中Hsp90α在ATB患者中的表達(dá)水平要遠(yuǎn)高于LTBI患者患者，其中位數(shù)及整體分布水平相差較大，且在活動(dòng)期水平較高；而T-spot.TB斑點(diǎn)數(shù)從分布可以看出，TB雖然中位數(shù)水平要高于LTBI，但是兩組有大量重疊的部分，僅依靠斑點(diǎn)數(shù)的高低來(lái)區(qū)分ATB和LTBI仍然較為困難；進(jìn)一步的ROC曲線分析顯示，以Hsp90α在血液中的表達(dá)水平來(lái)診斷ATB具有較高的敏感度和特異度。國(guó)外研究者發(fā)現(xiàn)宿主（Hsp25、Hsp60、Hsp70和Hsp90）和結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）Hsp(s)（Hsp16、Hsp65和Hsp71）是人類TB患者肺內(nèi)外臨床樣本中MTB 感染的單核細(xì)胞中免疫反應(yīng)的重要特征。值得注意的是，宿主（Hsp25、Hsp70和Hsp90）和MTB（Hsp16、Hsp65和Hsp71）Hsp(s)在 臨床樣本和TB感染后的細(xì)胞系模型中顯著增加[13]。Shekhawat等發(fā)現(xiàn)，Hsp90在診斷結(jié)核性腦膜炎上的敏感度和特異度達(dá)到88%和89%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為89.36%（76.88-96.41），陰性預(yù)測(cè)值為91.36%（82.99～96.44）[14]。在86%的結(jié)核性腦膜炎（TBM）患者血液中的Hsp90都被發(fā)現(xiàn)為陽(yáng)性。Hsp90顯示出良好的敏感度和特異度，并具有診斷TBM疾病的潛力。與高風(fēng)險(xiǎn)暴露組、低風(fēng)險(xiǎn)暴露組和低風(fēng)險(xiǎn)暴露組相比，活動(dòng)性結(jié)核病組中宿主Hsp90水平顯著升高（P＜0.05）[15]，這也與本次研究結(jié)果較為一致。從實(shí)驗(yàn)方法上來(lái)說(shuō)，檢測(cè)Hsp90α所使用的酶聯(lián)免疫法（ELISA）法簡(jiǎn)單快速，價(jià)格也較為低廉，較容易普及；而與傳統(tǒng)的T-spot.TB相比，Hsp90α診斷ATB具有更高的敏感度。本研究所納入的患者數(shù)量有限，且未對(duì)患者進(jìn)行跟蹤研究，因此數(shù)據(jù)具有一定的局限性，所得結(jié)論仍需要在更大樣本中進(jìn)行驗(yàn)證。在后續(xù)研究中還需要繼續(xù)探討Hsp90α與T-spot.TB聯(lián)合應(yīng)用對(duì)于診斷結(jié)核病及區(qū)分ATB和LTBI的意義及Hsp90α隨著病程發(fā)展在血液中的動(dòng)態(tài)變化，以便更好地監(jiān)測(cè)ATB的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，結(jié)核分枝桿菌所導(dǎo)致的肺結(jié)核會(huì)引起機(jī)體Hsp90α表達(dá)上調(diào)，Hsp90α在輔助診斷ATB和排除已知誘導(dǎo)其產(chǎn)生的疾病因素（如腫瘤和癌癥）方面具有相當(dāng)大的價(jià)值。臨床檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌感染期間外周血中 Hsp90α水平的變化對(duì)于進(jìn)一步分析、討論以及制定ATB和LTBI患者預(yù)防和治療策略有較為重要的意義。