昌家宇,丁清穎,肖轉(zhuǎn)泉,張 驥,陳尚钘,王宗德,范國榮*

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院,國家林業(yè)草原木本香料(華東)工程技術(shù)研究中心,國家林業(yè)草原/江西省樟樹工程技術(shù)研究中心,江西 南昌 330045;2.江西師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,江西 南昌 330027)

0 引言

油茶(Camelliaoleiferaabel.),別名茶子樹、茶油樹，是世界四大木本油料植物之一.它生長在中國南方(浙江省、江西省、湖南省和廣西壯族自治區(qū))亞熱帶地區(qū)，是一種純天然高級油料植物，其食用油在中國被稱為“東方橄欖油”.其種子(茶子)可榨油，出油率達30%，其油(茶油)主要由油酸和亞油酸等不飽和脂肪酸組成，并含有山茶甙等特定生理活性物質(zhì)，具有提高抗氧化能力、保護肝臟等功效.油茶籽餅是油茶籽榨油后產(chǎn)生的一種食用副產(chǎn)品，其中含有多種生物活性化合物(如多糖、皂苷、黃酮和多酚),是化工、輕工和食品等工業(yè)產(chǎn)品的原料.油茶的果殼可生產(chǎn)糠醛、單寧和活性炭等高附加值產(chǎn)品.因為油茶優(yōu)良的品質(zhì)和廣泛的綜合利用價值，所以科學(xué)經(jīng)營油茶林既有生態(tài)效益，又能帶來良好的經(jīng)濟效益.

然而，油茶也會遭到不利自然條件的影響與侵襲，最為嚴(yán)重的是油茶炭疽病,該病是由膠孢炭疽菌引起的,油茶的果、葉、枝梢和花蕾等部位均可被危害，并導(dǎo)致落果、落蕾、落葉、枝梢枯死、枝干潰瘍，甚至整株衰亡[1].患油茶炭疽病的油茶落果率通常在20%左右，在嚴(yán)重時可達40%以上.晚期病果雖然可以采收，但種子含油量不高，約為健康油茶種子的1/2，甚至更低[2].防治油茶炭疽病，除了各種科學(xué)的管理措施外，就是使用藥劑.在發(fā)病初期，用50%托布津可濕性粉劑500～800倍液、50%多菌靈500倍液或50%退菌特可濕性粉劑800倍液連續(xù)噴灑3～4次均有一定效果[3].但這些傳統(tǒng)農(nóng)藥的長期使用或使用不當(dāng)會造成植物的抗藥性，且會對環(huán)境造成污染.為尋求高效低毒的新型抑菌劑，本研究團隊以松節(jié)油的主要成分之一的β-蒎烯為起始原料，通過化學(xué)修飾合成得到了多個系列的衍生物，有諾卜醇及其醚類[4]和羧酸酯類[5],氫化諾卜醇及其烷基醚[6]、羧酸酯[7]、鹵代物[8],含氫化諾卜基的叔胺[9]、氫化諾卜醛及其縮醛類[10]、氫化諾卜酸及其酰胺類[11],氫化諾卜基甲酸及其酯類[12]、酰胺類[13],β-羥乙基氫化諾卜基醚及其烷基醚[14]、羧酸酯類[15],含氫化諾卜基的季銨鹽類化合物等.并對部分化合物的生物活性進行了測試，發(fā)現(xiàn)有些化合物對蚊蟲、螞蟻、蟑螂等具有驅(qū)避作用，對某些植物病原真菌(如辣椒菌核病菌、辣椒疫霉病菌、層出鐮刀菌、梨鏈格孢菌、萵苣菌核病菌等)具有良好的抑菌性能.在抑菌活性測試中發(fā)現(xiàn):含2個氫化諾卜基的單季銨鹽與含氫化諾卜基的對稱型雙子季銨鹽對植物病原真菌的抑制活性優(yōu)于其他類型的氫化諾卜基衍生物.故本文采用菌絲生長速率法[16]對含氫化諾卜基的對稱型雙子季銨鹽和雙氫化諾卜基單季銨鹽共26個化合物對油茶炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides)進行抑制活性測試，選出對油茶炭疽病菌抑制效果較好的化合物做深入研究.

1 實驗部分

1.1 儀器設(shè)備和菌種

儀器設(shè)備:立式壓力蒸汽滅菌鍋LDZX-50KBS，上海申安醫(yī)療器械廠;無菌超凈工作臺SW-CJ-10，蘇州凈化設(shè)備有限公司;智能培養(yǎng)箱CHP-250，上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司.

菌種為油茶炭疽病真菌(Colletotrichumgloeosporioides),其由江西農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院森林保護教研室提供.

1.2 季銨鹽化合物

實驗所用季銨鹽化合物如表1所示,其中R代表氫化諾卜基.

表1 季銨鹽化合物

1.3 抑菌活性測試方法

采用菌絲生長速率法測定季銨鹽化合物對10種植物病原菌的抑菌活性，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%的百菌清作為陽性對照，以無任何化合物的PDA培養(yǎng)基平板作為空白對照.稱取馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基干粉(PDA),按說明與蒸餾水混合攪拌均勻加熱煮沸，塑封好后放入高壓蒸汽滅菌鍋中殺菌消毒.采用2倍稀釋法將產(chǎn)物和陽性對照百菌清配置成質(zhì)量濃度分別為200.0、100.0、50.0、25.0和12.5 mg·L-1的藥液，再與已滅菌的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基溶液(PDA)混合均勻并冷卻至室溫，然后傾倒至已貼好標(biāo)簽的滅菌培養(yǎng)皿中.空白對照采用同等量的無菌水與培養(yǎng)基混合倒入培養(yǎng)皿中.自然冷卻,待其凝固后將準(zhǔn)備好的菌種接入，放入25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)數(shù)天，每組重復(fù)3次.待空白對照組的菌落直徑生長至6 cm以上，采用十字交叉法測量其直徑.菌絲生長抑制率=(對照組菌絲凈生長量-實驗組菌絲凈生長量)/對照組菌絲凈生長量×100%.

采用SPSS軟件建立毒力回歸方程，以化合物質(zhì)量濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)(x)、抑制率轉(zhuǎn)換的概率值為縱坐標(biāo)(y),得毒力回歸方程為y=a+bx;當(dāng)y=50%時，求出其抑菌的半數(shù)有效質(zhì)量濃度(cIC50),當(dāng)y=90%時，求出其抑菌的有效質(zhì)量濃度(cIC90).

2 結(jié)果與討論

2.1 抑菌率

26個含氫化諾卜基的季銨鹽化合物在5個不同質(zhì)量濃度下對油茶炭疽病菌的抑制率與cIC50、cIC90值均列于表2中.從表2可以看出:當(dāng)陽性對照百菌清的質(zhì)量濃度為200.0 mg·L-1時的抑菌率為59.83%；而26個氫化諾卜基的季銨鹽化合物在質(zhì)量濃度為200.0 mg·L-1時的抑菌率有25個高于百菌清的，其中抑菌率高于90%的有8個，抑菌率為80%～90%的化合物有4個，抑菌菌為70%～80%的化合物有9個.當(dāng)藥液質(zhì)量濃度為100.0 mg·L-1時，有20個季銨鹽化合物的抑菌率高于60%；當(dāng)藥液質(zhì)量濃度為50.0 mg·L-1時，有7個化合物的抑菌率高于60%；當(dāng)藥液質(zhì)量濃度為25 mg·L-1時，有4個季銨鹽的抑菌率高于60%.可見這些含氫化諾卜基的季銨鹽化合物抑制油茶炭疽病菌的能力普遍強于百菌清.

表2 季銨鹽類化合物對油茶炭瘟病菌的抑制率、cIC50、cIC90以及毒力回歸方程

2.2 cIC50與cIC90

從表2抑菌率數(shù)據(jù)可以看出:隨著藥液被稀釋，藥液質(zhì)量濃度降低，各種被測物質(zhì)的抑菌率都會降低，有的樣品(如8-3CC、1-6-1BB)抑菌率下降得比較緩慢,由此計算出來的cIC50值就比較小(8-3CCcIC50為7.41、1-6-1BBcIC50為3.99)；有的化合物(如γ-1)隨著藥液的稀釋，其抑菌率下降得比較快,雖然在質(zhì)量濃度為200.0 mg·L-1時的抑菌率為93.75%，但藥液稀釋后，就依次降低為72.93%、58.75%、32.71%、17.50%，由此計算得到的cIC50值為40.48.對照樣百菌清，雖然抑菌率在60.00%以下，但其抑菌率隨藥液的稀釋下降得非常緩慢,其cIC50值為19.89.在26個化合物中只有5個化合物的cIC50值比百菌清的cIC50值更低.若單從樣品的cIC50值來評比，則只有4個化合物的抑菌活性好于百菌清.

本文還計算出了各化合物的cIC90值(即在抑菌率達90.00%時試樣藥液的質(zhì)量濃度).從表2可以看出:百菌清的cIC90值非常高(154×104).在26個季銨鹽化合物中，cIC90值小于100的有3個化合物，有6個化合物的cIC90值小于150，即有6個化合物在質(zhì)量濃度為150.0 mg·L-1(20 L水液僅需3.0 g化合物)時的抑菌率達90.00%.cIC90值小于500的季銨鹽有12個，而百菌清在質(zhì)量濃度為500.0 mg·L-1時對油茶炭疽病菌的抑制率不到80.00%[17].

因此，評價某個化合物對某種病菌的抑制活性，只依據(jù)其cIC50數(shù)據(jù)是不足以得出客觀正確的結(jié)果的，應(yīng)當(dāng)再結(jié)合其他一些必要的數(shù)據(jù)進行分析判斷.

2.3 季銨鹽分子結(jié)構(gòu)對抑制油茶炭疽病菌活性的影響

在本文26個化合物中有6個雙氫化諾卜基單季銨鹽,分別為α-Br、β-Br、γ-Br、δ-Br、α-I、γ-I,在質(zhì)量濃度為200.0 mg·L-1下僅α-I的抑菌率為86.70%，其他5個雙氫化諾卜基單季銨鹽的抑菌率都高于90.00%.質(zhì)量濃度降低，抑菌率下降，其中β-Br和γ-Br的抑菌制率下降較緩，其cIC50值分別為24.43、14.45 mg·L-1，cIC90值分別為82.20、79.73 mg·L-1，它們是在全部季銨鹽中cIC90值最低的化合物.比較α-Br與α-I、γ-Br與γ-I的抑菌測試數(shù)據(jù)可以看出:在雙氫化諾卜基單季銨鹽化合物分子中，陰離子為溴負(fù)離子的抑菌活性比碘負(fù)離子的抑菌活性更強.

在20個含氫化諾卜基的對稱型雙子季銨鹽的化合物中，抑菌效果最好的是1-10-1BB和1-6-1BB，在5個不同質(zhì)量濃度下它們的抑菌率比其他雙子季銨鹽的更高，而cIC50值與cIC90值比其他雙子季銨鹽化合物的更低.因此,在分子中2個氮正離子中心間的聯(lián)結(jié)基團的碳鏈增長能使其抑菌活性增強.1-4-1CC、1-5-1CC與1-6-1CC的cIC50值、cIC90值也存在類似的情況.

3 結(jié)論

本文采用菌絲生長速率法測定了20個含氫化諾卜基的對稱型雙子季銨鹽化合物和6個雙氫化諾卜基單季銨鹽化合物對油茶炭疽病菌的抑菌活性.實驗結(jié)果表明:含2個氫化諾卜基的季銨鹽化合物對油茶炭疽病菌均有一定的抑制作用，在藥液質(zhì)量濃度為100.0 mg·L-1時，有20個化合物的抑菌率在60.00%以上，高于陽性對照百菌清在質(zhì)量濃度為200.0 mg·L-1時的抑菌率(59.83%)；其中有3個化合物(1-10-1BB、α-Br和γ-Br)抑菌率高于90%，它們的cIC50值分別為20.31、14.45、12.25 mg·L-1，低于或接近于百菌清的(19.09 mg·L-1)，而cIC90值均低于90 mg·L-1，這3個化合物對油茶炭疽病菌具有較高的抑菌活性.六亞甲基-1,6-雙(氫化諾卜基二甲基溴化銨)(1-6-1BB)的抑菌活性也較高，其cIC90值為104.70 mg·L-1，cIC50值為3.99 mg·L-1.

下一步的工作是合成雙季銨鹽中間聯(lián)結(jié)基團為8、12、14、16個CH2的化合物，進一步探尋對油茶炭疽病菌抑制活性更高的化合物,并進行實體試驗.