楊 杭,陳佳祺,王首寒,楊洪軍,王 斌

（吉林省腫瘤醫(yī)院腹部腫瘤外科，吉林 長(zhǎng)春 130012）

重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）是一種進(jìn)展迅速、病死率高的致命性全身性疾病，其最重要的致死原因是心臟損傷［1-4］。研究［5］表明：高血壓、心肌缺血再灌注損傷、心肌梗死和心力衰竭等心臟疾病的發(fā)生發(fā)展都與活性氧含量增加有關(guān)。

心血管系統(tǒng)中的活性氧主要由煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶 （nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase，NOX）生 成。在NOX家族中，NOX2和NOX4在心肌中高表達(dá)，介導(dǎo)心臟代償性和失代償性變化［6-7］。研究［8-13］顯示：在膿毒癥、缺血性心肌病和心力衰竭等疾病狀態(tài)下，心功能不全患者的NOX活性均升高，且NOX4升高更明顯，促炎細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、內(nèi) 皮 素1（endothelin 1，ET-1）和內(nèi)毒素等也可激活NOX，促進(jìn)活性氧的生成，通過(guò)激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號(hào)通路促進(jìn)氧化應(yīng)激增加和心肌細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致SAP大鼠心臟損傷。

人參作為一種用于治療和養(yǎng)生的傳統(tǒng)中草藥，對(duì)人體有保護(hù)作用。人參皂苷Rg1，分子式為C42H72O14，是人參屬藥材的重要藥理學(xué)活性成分之一，其具有多靶點(diǎn)效應(yīng)且不良反應(yīng)少。Rg1可通過(guò)增強(qiáng)內(nèi)源性抗氧化活性物質(zhì)，如過(guò)氧化氫酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽等活性，明顯降低心肌細(xì)胞缺氧和復(fù)氧過(guò)程中活性氧的產(chǎn)生，抵制心肌細(xì)胞鈣離子（Ca2+）濃度異常性升高，進(jìn)而抑制左心室肥厚，減少細(xì)胞凋亡并保護(hù)心臟，避免心肌重塑和慢性血栓栓塞性肺動(dòng)脈高壓大鼠心肌細(xì)胞紊亂、右心室肥厚和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等現(xiàn)象的發(fā)生，并抑制膠原沉積［14-16］。然而，人參皂苷Rg1作為抗氧化劑對(duì)SAP相關(guān)心臟損傷的作用尚未完全闡明。本研究探討人參皂苷Rg1對(duì)SAP大鼠導(dǎo)致心臟損傷的保護(hù)作用，并闡明其可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器8周齡健康SD大鼠18只，體質(zhì)量250～300 g，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（遼）2020-0001。人 參 皂 苷Rg1（CAS號(hào)：22427-39-0）購(gòu)自上海源葉生物技術(shù)有限公司，肌酸激酶MB（creatine kinase-MB，CK-MB）和肌鈣蛋白I（cardiac tropnin I，cTnI）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、TNF-α、內(nèi)毒素、ET-1和淀粉酶ELISA試劑盒購(gòu)自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司，全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒和SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購(gòu)自北京索萊寶生物技術(shù)有限公司，NOX4、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（extracellular regulated protein kinase1/2，ERK1/2）、磷 酸 化ERK1/2（phosphorylated ERK1/2，p-ERK1/2）、磷酸化p38（phosphorylated p38，p-p38）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、磷酸化JNK（phosphorylated JNK，p-JNK）、β-actin和羊抗兔IgG（H+L）HRP購(gòu)自常州市祥泰生物技術(shù)有限公司。超聲成像系統(tǒng)購(gòu)自中國(guó)邁瑞公司，ULTRA-TURRAX?組織勻漿器購(gòu)自德國(guó)IKA公司，5415R高速離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Ependorff公司，Powerpac Basic電 泳系統(tǒng)、Mini Trans-Blot?Cell小型轉(zhuǎn)印槽和680酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組和造模18只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和Rg1處理組，每組6只。各組大鼠術(shù)前無(wú)菌消毒準(zhǔn)備后，腹腔注射3%戊巴比妥鈉溶液（3 mL·kg－1體質(zhì)量）麻醉，開(kāi)腹，充分暴露手術(shù)視野。依據(jù)參考文獻(xiàn)［16-17］方法，對(duì)照組大鼠開(kāi)腹后閉腹；模型組大鼠采用2 mL注射器緩慢逆行向大鼠膽胰管內(nèi)注射5%牛磺膽酸鈉（0.15 μL·kg－1體質(zhì)量）制備SAP模型，注射后維持5 min，取出微血管鉗和穿刺針，關(guān)腹；Rg1處理組大鼠于SAP誘導(dǎo)手術(shù)前30 min經(jīng)尾靜脈注射Rg1（4 mg·kg－1體質(zhì)量）。對(duì)照組和模型組大鼠術(shù)前30 min尾靜脈注射等體積生理鹽水。術(shù)后所有大鼠背部皮下注射無(wú)菌生理鹽水（4 μL·kg－1體質(zhì)量）補(bǔ)償預(yù)期失水量，每6 h 1次。

大鼠血清中心肌酶異常超過(guò)正常上限值2倍以上，胰腺炎癥指標(biāo)血清中TNF-α、內(nèi)毒素、ET-1和IL-1β水平升高超正常值2倍以上，可認(rèn)為造模成功［12］。

1.3 ELISA法檢測(cè)大鼠血清中炎癥因子水平和心肌酶及淀粉酶活性收集不抗凝血液，4℃、3 500 r·min－1離 心15 min，取 上 清 液 備 用。采 用ELISA法檢測(cè)各組大鼠血清中炎癥因子TNF-α、內(nèi)毒素、ET-1和IL-1β水平及心肌損傷相關(guān)指標(biāo)CK-MB、cTnI和淀粉酶活性，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，采用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm及405 nm波長(zhǎng)處吸光度（A）值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和A值計(jì)算血清中炎癥因子水平和心肌酶及淀粉酶活性。

1.4 超聲成像系統(tǒng)檢測(cè)各組大鼠超聲心動(dòng)圖各組大鼠術(shù)后麻醉蘇醒24 h后3%戊巴比妥麻醉，采用超聲成像系統(tǒng)以200 mm·s－1的掃描速度觀察和記錄各組大鼠多普勒信號(hào)軌跡，測(cè)量心率（heart rate，HR）、左室收縮末期內(nèi)徑（left ventricular end-systolic diameter，LVDs）和左室舒張 末期內(nèi)徑（left ventricular end-diastolic diameter，LVDd），計(jì)算左室短軸縮短率（factional shortening，F(xiàn)S）。FS=（LVDd－LVDs/LVDd）×100%。所有數(shù)據(jù)均由單盲超聲診斷儀采集和分析，連續(xù)測(cè)量5個(gè)心動(dòng)周期，取平均值。

1.5 Western blotting法檢測(cè)各組大鼠心肌組織中NOX2、NOX4、p-p38、p-ERK1/2和p-JNK蛋白表達(dá)水平冰上剪取適量左心室組織樣本加入蛋白裂解液，組織勻漿器勻漿，4℃、15 000 r·min－1離心25 min，取上清。采用BCA法測(cè)定上清液蛋白濃度，將蛋白濃度用RIPA調(diào)整為40 g·L－1，按4∶1比例與5×SDS-PAGE Loading Buffer充分混勻，置于100℃沸水中7 min，使蛋白質(zhì)變性。10%SDS-PAGE電泳，4℃、100 V轉(zhuǎn) 膜60 min至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。棄封閉液，PBST洗膜后，一抗（1∶1 000）10 h，4℃冰箱孵育，棄一抗，PBST洗膜，二抗（1∶3 000）室溫孵育，棄二抗，PBST洗膜。采用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，ECL發(fā)光劑顯影、成像，以β-actin為內(nèi)參，采用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，計(jì)算目的蛋白表達(dá)水平。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/β-actin蛋白條帶灰度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用GraphPad Prism 9.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組大鼠血清中TNF-α、內(nèi)毒素、ET-1和IL-1β水平及CK-MB、cTnI和淀粉酶活性，心肌組織中NOX2、NOX4、p-p38、p-ERK1/2和p-JNK蛋白表達(dá)水平均符合正態(tài)分布，以±s表示，多組間樣本數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血清中炎癥因子水平和心肌酶及淀粉酶活性ELISA法檢測(cè)結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清中TNF-α、內(nèi)毒素、IL-1β和ET-1水平及CK-MB、cTnI和淀粉酶活性均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，Rg1處理組大鼠血清中TNF-α、內(nèi) 毒 素、IL-1 β和ET-1水 平 及CK-MB、cTnI和淀粉酶活性均明顯降低（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血清中炎癥因子水平和心肌酶及淀粉酶活性Tab.1 Levels of inflammatory factors and activities of myocardial enzymes and amylase in serum of rats in various groups(n=6，±s）

*P＜0.05 vs control group；△P＜0.05 vs model group.

Group Control Model Rg1 treatment TNF-α[ρB/(ng·L－1）]47.08±5.01 150.72±6.72*130.36±2.88*△Endotoxin[ρB/(μg·L－1）]0.54±0.03 1.20±0.02*0.92±0.06*△IL-1β[ρB/(ng·L－1）]55.26±4.25 259.08±5.73*222.53±2.92*△ET-1[ρB/(ng·L－1）]23.15±1.24 52.27±2.02*47.44±1.37*△CK-MB[λB/（U·L－1）]11.33±2.45 32.43±2.74*25.72±3.26△cTnI[ρB/(μg·L－1）]0.68±0.01 1.62±0.09*1.12±0.04△Amylase[λB/（U·L－1）]109.00±45.60 502.33±122.14*385.72±83.26*△

2.2 各組大鼠HR、LVDs、LVDd和FS超聲心動(dòng)圖結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，模型組大鼠HR和LVDs明顯增加（P＜0.05），LVDd差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），F(xiàn)S明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，Rg1處理組大鼠LVDs明顯減?。≒＜0.05），LVDd差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），F(xiàn)S明顯升高（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠HR、FS、LVDd和LVDsTab.2 HR,FS,LVDd and LVDs of rats in various groups (n=6，±s）

*P＜0.05 vs control group；△P＜0.05 vs model group.

Group Control Model Rg1 treatment HR(beat·min－1)256.25±17.60 301.00±11.14*278.72±10.26 LVDs(d/mm)3.28±0.24 4.00±0.32*3.64±0.17*△LVDd(d/mm)5.62±0.13 5.80±0.33 5.72±0.21 FS（η/%）41.63±1.71 31.03±0.03*36.36±0.14*△

2.3 各組大鼠心肌組織中NOX2、NOX4、p-p38、p-ERK1/2和p-JNK蛋白表達(dá)水平Western blotting法檢測(cè)結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，模型組大鼠心肌組織中NOX2和NOX4蛋白表達(dá)水平明 顯 升 高（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組比較，Rg1處理組大鼠心肌組織中NOX2和NOX4蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）。與對(duì)照組比較，模型組大鼠心肌組織中p-p38、p-ERK1/2和p-JNK蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，Rg1處理組大鼠心肌組織中p-p38、p-ERK1/2和p-JNK蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）。見(jiàn)圖1和2。

圖1 各組大鼠心肌組織中NOX2和NOX4蛋白表達(dá)電泳圖（A）和直條圖（B）Fig.1 Electrophoregram（A）and histogram（B）of expressions of NOX2 and NOX4 proteins in myocardium tissue of rats in various groups

圖2 各組大鼠心肌組織中p-p38、p-ERK1/2和p-JNK蛋白表達(dá)電泳圖（A）和直條圖（B）Fig.2 Electrophoregram（A）and histogram（B）of expressions of p-p38,p-ERK1/2 and p-JNK proteins in myocardium tissue of rats in various groups

3 討 論

SAP患者除胰腺壞死和全身炎癥反應(yīng)外，還會(huì)出現(xiàn)肺、腸道、腎和心臟等遠(yuǎn)隔器官損傷［1-3］。研究［12，18-21］報(bào)道：在SAP期間可觀察到心功能和心肌損傷的改變。SAP導(dǎo)致的心臟損傷是該病最重要的死亡原因，也是最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，且SAP大鼠心肌組織中被激活的NOX促進(jìn)活性氧生成作為損傷心臟的基礎(chǔ)，并通過(guò)激活MAPK通路，增加氧化應(yīng)激，同時(shí)增加心肌細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致心臟損傷［22-23］。

本研究結(jié)果顯示：SAP大鼠的心臟損傷模型制備成功；與對(duì)照組比較，SAP大鼠血清中心肌損傷相關(guān)的CK-MB和cTnI蛋白酶活性明顯升高，LVDs和LVDd明顯增加，F(xiàn)S明顯降低，同時(shí)模型組大鼠血清中淀粉酶活性及炎癥相關(guān)因子TNF-α、內(nèi)毒素、IL-1β和ET-1水平均明顯升高，上述指標(biāo)不僅是胰腺炎癥相關(guān)指標(biāo)，同時(shí)也是慢性心力衰竭、心肌缺血再灌注損傷、高血壓、腦出血和肺氣腫等疾病研究中的重要指標(biāo)；與模型組比較，Rg1處理組大鼠血清中CK-MB和cTnI活性降低，表明Rg1處理可明顯減輕SAP引起的心臟損傷，且LVDs明顯減小，F(xiàn)S明顯升高，表明Rg1處理明顯改善了SAP大鼠的心臟功能，同樣證實(shí)Rg1處理減輕了SAP大鼠的心臟損傷。

研究［10-12，17］顯示：氧化還原敏感的MAPK信號(hào)通路通常被認(rèn)為可調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞的炎癥和凋亡，NOX可促進(jìn)活性氧生成，通過(guò)激活MAPK通路促進(jìn)氧化應(yīng)激增加和心肌細(xì)胞凋亡。本文作者推測(cè)Rg1可抑制氧化應(yīng)激并保護(hù)SAP大鼠心臟作用，其作用機(jī)制可能與干預(yù)NOX激活MAPK通路有關(guān)。MAPK家族參與多種調(diào)控過(guò)程，包括對(duì)生長(zhǎng)信號(hào)的反應(yīng)、細(xì)胞凋亡和對(duì)壓力的敏感性，p38、ERK1/2和JNK是MAPK信號(hào)通路的主要亞家族［12，24-26］。結(jié) 果 顯 示：Rg1處 理 使 由SAP引 發(fā) 的NOX2、NOX4、p-ERK1/2、p-p38和p-JNK蛋 白表達(dá)明顯上調(diào)的情況被逆轉(zhuǎn)，表明Rg1對(duì)SAP大鼠心臟的保護(hù)作用與NOX及其下游信號(hào)分子MAPK家族有關(guān)。

盡管NOX對(duì)左室肥厚本身的發(fā)展非必要，但其在壓力超負(fù)荷時(shí)會(huì)導(dǎo)致心臟收縮功能障礙的發(fā)展。NOX作為活性氧生成的重要來(lái)源，使活性氧生成增加，活性氧通過(guò)激活MAPK通路促進(jìn)氧化應(yīng)激增加和心肌細(xì)胞凋亡［10-12］。而人參皂苷Rg1可通過(guò)MAPK信號(hào)通路降低氧化應(yīng)激過(guò)程［27-30］，對(duì)SAP大鼠心臟損傷起到保護(hù)作用。

綜上所述，人參皂苷Rg1對(duì)SAP大鼠心臟損傷具有一定保護(hù)作用，其機(jī)制可能與人參皂苷Rg1抑制NOX介導(dǎo)的由MAPK信號(hào)通路增加心肌組織氧化應(yīng)激有關(guān)。