劉一鳴 趙云，2 韓梅，2 章雨秋 米方林，2 王冰

1.川北醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)系，南充 637000；2.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院口腔科，南充 637000；3.川北醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院化學(xué)教研室，南充 637000

牙周炎是由牙周致病菌及其毒性產(chǎn)物侵犯牙周組織導(dǎo)致的慢性炎癥性疾病，導(dǎo)致牙周支持組織（如牙齦、牙周膜、牙槽骨和牙骨質(zhì)）的破壞，最終導(dǎo)致牙齒脫落，嚴(yán)重影響患者口腔功能與美觀[1]。牙周炎也是世界上最常見(jiàn)的由微生物引起的疾病之一，嚴(yán)重威脅著全球約7.43 億成年人的口腔健康[2-4]。牙周組織再生是牙周治療最理想的結(jié)果[5]，骨組織再生誘導(dǎo)術(shù)（guided bone regenera‐tion，GBR）是在齦下刮治術(shù)和根面平整術(shù)的基礎(chǔ)上，利用GBR 膜作為屏障，阻擋上皮結(jié)締組織進(jìn)入骨缺損區(qū)并促進(jìn)牙周膜細(xì)胞附著、增殖和分化，進(jìn)而引導(dǎo)牙周支持組織再生[6-7]。理想的GBR 膜應(yīng)具有良好的生物相容性，可降解性以及足夠的機(jī)械強(qiáng)度以維持空間[8]。目前臨床上常用的GBR 膜主要為來(lái)源于動(dòng)物的膠原蛋白膜，其具有良好的骨組織誘導(dǎo)再生功能和生物降解性。謝苗苗等[9]采用海奧膠原膜行GBR 術(shù)修復(fù)骨缺損，結(jié)果顯示骨生長(zhǎng)效果為91.29%±2.37%（P＜0.05）。但膠原膜的不足之處在于其具有免疫原性，降解速度快，且來(lái)源較局限。

近年來(lái)，基于聚乳酸-羥基乙酸共聚物（poly-(lactic acid-co-glycolic acid)，PLGA）的靜電紡絲支架材料在組織工程中得到了廣泛應(yīng)用[10]。靜電紡絲納米纖維膜的結(jié)構(gòu)與細(xì)胞外基質(zhì)（extracellu‐lar matrix，ECM）相似，具有可降解性、可設(shè)計(jì)性、高比表面積等優(yōu)點(diǎn)[11-13]。通過(guò)負(fù)載不同的功能活性物質(zhì)，調(diào)整纖維膜的結(jié)構(gòu)和組成，賦予膜材料除基本功能以外的獨(dú)特功能，如促進(jìn)細(xì)胞黏附、增殖及定向分化[14-15]。小鼠顱頂成骨細(xì)胞前體細(xì)胞（MC3T3-E1）是從C57BL/6 小鼠顱蓋骨細(xì)胞中建株的成骨細(xì)胞，具有堿性磷酸酶（alkaline phos‐phatase，ALP）活性和基質(zhì)鈣化等成骨細(xì)胞的生物學(xué)特性，常作為研究骨代謝的細(xì)胞模型[16]。本實(shí)驗(yàn)利用靜電紡絲技術(shù)將環(huán)狀精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列（cyclo-arginine-glycine-aspartic acid se‐quence，cRGD）、奧硝唑及納米羥磷灰石（nanohydroxyapatite，n-HA）負(fù)載于誘導(dǎo)骨組織再生作用的功能層（guided bone regeneration layer，GBRL）及具有抑制纖維化作用的功能層（anti-fibro‐sis layer，AFL），并與具有支撐作用及隔離不同功能層作用的致密膜層（barrier layer，BL）進(jìn)行復(fù)合，得到PLGA基多功能骨組織再生誘導(dǎo)納米纖維復(fù)合膜（以下簡(jiǎn)稱復(fù)合膜）（圖1）。研究不同功能層對(duì)MC3T3-E1 及小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（L929）細(xì)胞增殖的影響，研究負(fù)載奧硝唑的復(fù)合膜對(duì)牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis，P. gin‐givalis）的抑制作用；構(gòu)建大鼠頜骨骨缺損模型，研究復(fù)合膜誘導(dǎo)骨組織再生的作用并與臨床常用膠原口腔修復(fù)膜進(jìn)行比較，為進(jìn)一步研究其在牙周炎所致骨缺損修復(fù)中的應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

PLGA、聚己內(nèi)酯-丙交酯（poly(ε-lactide-cocaprolactone)，PLCA）、cRGD、奧硝唑、對(duì)氧環(huán)己酮（polydioxanone，PDO）、n-HA（北京伊諾凱科技有限公司），聚(對(duì)氧環(huán)己酮-L-苯丙氨酸)（poly(p-dioxanone-co-L-phenylalanine)，PDPA） 為自行制備[17]，P.gingivalis、腦心浸液培養(yǎng)基（brain heart infusion medium，BHI）（寧波明舟生物科技有限公司），L929 細(xì)胞系和MC3T3-E1 細(xì)胞系及其特定培養(yǎng)基（武漢普諾賽生命科技有限公司），細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（cell counting kit 8，CCK-8）（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），鈣鹽染色液（Von Kossa 法）、Masson 三色染色試劑盒及蘇木素伊紅（hematoxylin eosin，HE）染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），膠原口腔修復(fù)膜（煙臺(tái)正海生物科技股份有限公司）。

1.2 復(fù)合膜的制備及其表征檢測(cè)

1.2.1 流延膜的制備 將0.1 g PLGA、0.05 g PLCA溶于20 mL 二氯甲烷后傾入方形模具（15 cm×15 cm），置于通風(fēng)櫥內(nèi)揮發(fā)溶劑，得到PLGA/PL‐CA流延膜，室溫真空干燥24 h。

將0.1 g PLGA、0.05 g PLCA、0.8 g PDPA 溶于15 mL 六氟異丙醇，傾入方形模具（15 cm×15 cm），置于通風(fēng)櫥揮發(fā)溶劑，得到PDPA/PLGA/PLCA流延膜，室溫真空干燥24 h。

1.2.2 GBRL 層的制備 將3 g PDO 置于圓底燒瓶，加入300 mg n-HA，抽出圓底燒瓶?jī)?nèi)空氣，充入氮?dú)夂蠓馄浚?0 ℃超聲30 min使n-HA充分分散于熔融的PDO 中。后置于40 ℃油浴中加入3 mg 辛酸亞錫催化劑，抽空氣充氮?dú)庵貜?fù)置換瓶?jī)?nèi)氣體3次后氮?dú)夥諊路馄?，將油浴溫度升?00 ℃，攪拌下反應(yīng)24 h。打開(kāi)瓶塞，加入20 mL六氟異丙醇后攪拌，使成功接枝聚對(duì)氧環(huán)己酮（poly(p-dioxa‐none)，PPDO）的n-HA 充分穩(wěn)定分散于有機(jī)相，離心除去未接枝的n-HA，上清液加入無(wú)水乙醇50 mL沉降出n-HA-g-PPDO。

將所得n-HA-g-PPDO、0.3 g PLGA 和0.15 g PLCA 溶于9 mL 二氯甲烷和3 mL 二甲基碳酸酯（dimethyl carbonate，DMC）的混合溶液中制得有機(jī)相，將3 mg cRGD 和3 mg 奧硝唑溶于0.6 mL 生理鹽水中制得水相，有機(jī)相加入100 μL 司盤80 乳化劑，35 000 r·min-1速率攪拌下緩慢滴入水相溶液，形成乳液。乳液置入注射器進(jìn)行靜電紡絲，電壓8.5 kV，注射器泵流量3 mL·h-1，流延膜固定于接收裝置接收纖維以形成復(fù)合膜，接收裝置轉(zhuǎn)速100 r·min-1，注射器掃描行程20 mm。

1.2.3 AFL 層的制備 將0.2 g PLGA、0.8 g PDPA溶于10 mL 六氟異丙醇置入注射器進(jìn)行靜電紡絲，電壓8.5 kV，注射器泵流量3 mL·h-1，流延膜固定于接收裝置接收纖維以形成復(fù)合膜，接收裝置轉(zhuǎn)速100 r·min-1，注射器掃描行程20 mm。

1.2.4 復(fù)合膜的形態(tài)表征 所得系列復(fù)合膜列于表1。采用掃描電子顯微鏡（scanning electron micro‐scope，SEM）觀察復(fù)合膜GBRL 層的表面形貌；將復(fù)合膜修剪至5 mm×5 mm 大小浸泡于模擬體液中，1、2、3、4 周后真空干燥，SEM 觀察復(fù)合膜降解后的形貌。

表1 系列復(fù)合膜的構(gòu)成Tab 1 Composition of series of composite membranes

1.3 復(fù)合膜體外抑菌及細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

1.3.1 體外抑菌實(shí)驗(yàn) 稱取3.3 g BHI培養(yǎng)基粉末溶于100 mL 超純水中，攪拌混勻后加熱至沸騰，高壓蒸汽滅菌備用。P. gingivalis復(fù)蘇后接種至BHI試管內(nèi)，用厭氧培養(yǎng)袋密封，搖床140 r·min-1、37 ℃培養(yǎng)48 h。取4 份0.5 麥?zhǔn)蠞舛鹊腜.gingivalis菌液，每份100 μL，均勻涂布于血瓊脂平板上，將直徑為6 mm 的復(fù)合膜圓片M1、M2、M3 和M4分別置于血瓊脂平板中央，在第3、21天后測(cè)量抑菌圈直徑，重復(fù)3次取平均值。

1.3.2 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 將系列復(fù)合膜平鋪于96孔板中，MC3T3-E1 細(xì)胞以每孔1×104個(gè)的密度分別接種至M1、M2、M3、M4 的GBRL 面，對(duì)照組1 將MC3T3-E1 細(xì)胞直接接種在96 孔板上，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，在37 ℃、5%CO2下培養(yǎng)1、4、7 d[18]，避光條件下使用酶標(biāo)儀在450 nm 處檢測(cè)其光密度值（optical density，OD）。

將系列復(fù)合膜平鋪于96 孔板中，L929 細(xì)胞以每孔8×103個(gè)的密度接種于M1、M2、M3、M4 的AFL 面，對(duì)照組2 將L929 細(xì)胞直接接種在96 孔板上，每組設(shè)置6 個(gè)復(fù)孔，在37 ℃、5%CO2下培養(yǎng)1、2、3 d[19]，避光條件下使用酶標(biāo)儀在450 nm 處檢測(cè)其OD值。

1.4 大鼠頜骨缺損模型的構(gòu)建及體內(nèi)抗菌與成骨修復(fù)實(shí)驗(yàn)

選取體重為（200±20）g 雄性SD 大鼠36 只，來(lái)源于川北醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［編號(hào)：SCXK（川）2013-18］，操作在川北醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行［SYXK（川）2013-076］，實(shí)驗(yàn)過(guò)程對(duì)動(dòng)物的處置符合相關(guān)動(dòng)物倫理學(xué)要求。隨機(jī)分成6 組，每組6 只，即M1 組、M2 組、M3 組、M4 組、對(duì)照（NC）組和膠原（COL）組。戊巴比妥鈉麻醉后，將大鼠頭部固定，下頜部剃毛并用碘伏消毒，沿大鼠下頜骨下緣作約1.5 cm 長(zhǎng)切口，鈍性分離各組織，暴露下頜角舌側(cè)骨板。生理鹽水沖洗冷卻下，在距下頜骨下緣5 mm 與下頜角后側(cè)5 mm交叉處使用牙科手機(jī)制備直徑為3 mm 大小的洞穿骨缺損。對(duì)于M1 組、M2 組、M3 組和M4 組，將各復(fù)合膜貼附于骨缺損處的兩側(cè)，其AFL 面貼附于肌肉組織；NC 組不做任何干預(yù)；COL 組將膠原口腔修復(fù)膜貼附于骨損處雙側(cè)。所有分組縫合切口后再次消毒，術(shù)后青霉素（8×104U/只）肌肉注射1 次，預(yù)防切口感染。大鼠獨(dú)立飼養(yǎng)倉(cāng)喂養(yǎng)，自由飲食。在術(shù)后即刻、1周、2周、4周、6周和8周用小動(dòng)物CT 觀察大鼠頜骨缺損的修復(fù)情況，并用Mimics Medical 21.0軟件進(jìn)行三維重建、測(cè)量每只大鼠骨缺損的直徑，并計(jì)算每只大鼠的骨體積重建率，骨體積重建率=［（首日骨損體積-各時(shí)間點(diǎn)骨損體積）/首日骨損體積］×100%。8周后對(duì)大鼠實(shí)施安樂(lè)死，分離下頜骨后4%多聚甲醛固定48 h。固定完成的標(biāo)本制備切片，分別進(jìn)行Von Kossa 染色、HE染色和Masson三色染色，使用光學(xué)顯微鏡觀察并拍照。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組均數(shù)的比較用方差分析，P＜0.05記為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)合膜的表征

復(fù)合膜M1、M2、M3 和M4 的GBRL 表面的SEM 結(jié)果和降解不同時(shí)間后SEM 結(jié)果（圖2）顯示：各組復(fù)合膜的纖維直徑均勻，纖維交叉排列形成類似ECM 的疏松多孔結(jié)構(gòu)；雖然在4 周后纖維出現(xiàn)部分融合，但仍能維持基本的形態(tài)，其中M1 降解后的形態(tài)與降解初期無(wú)明顯差異，這可能是因?yàn)镸1 僅包含多孔GBRL 層，其AFL 層為PD‐PA/PLGA/PLCA 流延膜，導(dǎo)致其吸水率下降降解變慢所致。

2.2 體外抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

抑菌圈實(shí)驗(yàn)用來(lái)評(píng)估復(fù)合膜的體外抗菌效果，結(jié)果如圖3 所示，未負(fù)載奧硝唑的M1 和M2 在第3 天以及第21 天未見(jiàn)明顯抑菌圈，對(duì)P.gingiva‐lis無(wú)抑制作用；M3 在第3 天的抑菌直徑為（34.2±3.3）mm，第21 天抑菌圈直徑為（31.3±4.7）mm；M4 在第3 天的抑菌圈直徑為（36.51±3.9）mm，第21 天為（33.57±4.6）mm；M3 和M4 的抑菌圈直徑從第3 天到第21 天雖稍有下降，但在21 d 后仍能保持一定的抑菌效果。

2.3 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果

MC3T3-E1 細(xì)胞是常見(jiàn)的成骨細(xì)胞前體細(xì)胞，可以進(jìn)一步分化為成骨細(xì)胞。如圖4A 所示，L929細(xì)胞在復(fù)合膜AFL 面上均表現(xiàn)出先緩慢增加后降低的生長(zhǎng)趨勢(shì)，表明M1、M2、M3 和M4 均具有抑制成纖維細(xì)胞增長(zhǎng)的效果，其中M1 的效果最差，是PDPA在流延層而非多孔AFL層，降解緩慢是L-苯丙氨酸釋放不足所致，這與2.1 中觀察到M1 降解速率低于其他各組的結(jié)果是一致的。如圖4B 所示，MC3T3-E1 細(xì)胞在M1、M2、M3 和M4的GBRL 層上均表現(xiàn)出良好的增殖趨勢(shì)，培養(yǎng)于M1的GBRL層上的細(xì)胞增殖速度最快。

2.4 Micro-CT結(jié)果

使用Mimics medical 21.0軟件對(duì)大鼠下頜骨缺損區(qū)域進(jìn)行觀察，通過(guò)分析各組的骨缺損直徑及骨體積重建率來(lái)比較各組的骨修復(fù)能力。從CT 水平面最大缺損直徑影像比較，NC、COL、M1、M2、M3、M4 組在術(shù)后即刻達(dá)到最大缺損直徑（圖5A）；從第2 周開(kāi)始，各組骨缺損直徑均開(kāi)始減小（圖5B），且COL、M1、M2、M3、M4 組的重建速率均大于NC 組，表明膠原口腔修復(fù)膜和各復(fù)合膜均能促進(jìn)骨缺損區(qū)域的修復(fù)重建，其中M3組重建速率最快，M2 組最慢。在第2 周時(shí)可見(jiàn)骨缺損區(qū)邊緣稍不整齊（圖5D），缺損區(qū)中心可見(jiàn)散在高密度影，4周后各復(fù)合膜組缺損區(qū)可見(jiàn)明顯高密度影像，至第8 周時(shí)，M1、M3 與M4 組骨缺損已基本修復(fù)完成。由圖5C 可知，在第2 周，M1、M2、M3 組的骨體積重建率均高于M4 組；在第4至8周，M1、M2、M3和M4組的骨體積重建率均高于NC 和COL 組；在第8 周，NC、COL、M1、M2、M3、M4 組的骨體積重建率均值分別為33.2%、63.4%、82.2%、70.9%、84.8%、75.1%，4種復(fù)合膜的誘導(dǎo)骨重建率均高于臨床應(yīng)用的膠原膜，其中M3組的骨體積重建率最高。

2.5 組織病理學(xué)結(jié)果

術(shù)后8 周，手術(shù)部位未脫鈣Masson 三色染色如圖6A 所示，COL 組和復(fù)合膜組均可見(jiàn)紅藍(lán)相間的新生骨組織，骨組織兩側(cè)可見(jiàn)較多成骨細(xì)胞分布，對(duì)照組骨缺損邊緣較模糊，僅可見(jiàn)少量藍(lán)色膠原纖維。Von kossa 染色結(jié)果如圖6B 所示，鈣鹽沉積區(qū)域呈棕黑色，其中對(duì)照、COL和M4組見(jiàn)不連續(xù)棕黑色鈣鹽沉積，內(nèi)有少量條狀或蜂窩狀未完全鈣化的棕灰色區(qū)域；M1、M2 和M3 組可見(jiàn)大面積棕黑色鈣鹽沉積，鈣化相對(duì)致密。HE 染色結(jié)果見(jiàn)圖6C，對(duì)照組可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，僅可見(jiàn)少量的成骨細(xì)胞；COL 組和復(fù)合膜組見(jiàn)毛細(xì)血管和新骨生成，M1 和M3 組的部分新骨已開(kāi)始成熟并出現(xiàn)骨髓腔樣結(jié)構(gòu)。此外從圖6D 可見(jiàn)，膠原組與復(fù)合膜組頜骨中被染成藍(lán)紅相間的新生骨組織與被染成褐紅色的成熟骨組織有序分布，藍(lán)染的膠原纖維較豐富（箭頭所示），而對(duì)照組中藍(lán)色膠原纖維較少，紅染的結(jié)締組織侵入缺損骨組織。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)利用靜電紡絲技術(shù)制備多功能PLGA基靜電紡絲復(fù)合纖維膜，包含貼附結(jié)締組織的AFL層、BL層和具有誘導(dǎo)骨組織再生作用的GBRL層。AFL 的主要功能成分為PDPA，其在水中降解可釋放L-苯丙氨酸，抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)[20]。BL 具有一定的強(qiáng)度，在骨修復(fù)過(guò)程中能夠支撐空間，阻止成纖維細(xì)胞等透過(guò)屏障膜到達(dá)硬組織層，并隔離AFL 降解過(guò)程中釋放的L-苯丙氨酸，以免對(duì)成骨細(xì)胞產(chǎn)生影響，而GBRL 層則包含了有利于成骨細(xì)胞貼附的cRGD，誘導(dǎo)成骨細(xì)胞增殖及礦化的n-HA，以及抑菌抗生素。如圖2所示，GBRL的表面在SEM 下纖維直徑均勻，纖維交叉排列形成類似ECM 的疏松多孔結(jié)構(gòu)，能夠提供更多的結(jié)合位點(diǎn)，促進(jìn)成骨細(xì)胞的黏附和遷移，并且隨著GBRL的降解，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)抗生素的緩釋[21]。cRGD 為細(xì)胞跨膜蛋白整合素的結(jié)合位點(diǎn)，可通過(guò)整合素介導(dǎo)細(xì)胞黏附并轉(zhuǎn)導(dǎo)生物信號(hào)，具有促進(jìn)成骨相關(guān)細(xì)胞黏附和分化的能力[22]；羥磷灰石是人體牙齒和骨骼的主要無(wú)機(jī)成分，有一定的骨傳導(dǎo)能力，能促進(jìn)缺損骨組織的修復(fù)[23-24]；奧硝唑是一種硝基咪唑類抗生素，對(duì)各種厭氧菌有較好的抑制作用。

4 種復(fù)合膜在模擬體液中浸泡四周仍能維持基本形態(tài)，其中M1降解后形態(tài)與降解初期無(wú)明顯差異，其AFL 層為PDPA/PLGA/PLCA 流延膜，而M2、M3 和M4 的AFL 層為多孔PDPA/PLGA 靜電紡絲膜，M1 比M2、M3、M4 的AFL 層的結(jié)構(gòu)更加致密，導(dǎo)致其吸水率下降降解變慢。Micro-CT影像和組織病理結(jié)果也顯示其應(yīng)用于大鼠體內(nèi)后也可在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)維持骨修復(fù)所需的空間，減少周圍軟組織的壓迫并阻止結(jié)締組織的侵入。隨著降解時(shí)間的延長(zhǎng)，M3 和M4 膜的形態(tài)發(fā)生變化較大，纖維出現(xiàn)融合，這可能是因?yàn)槠渌腜LCA的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度低，在水分子長(zhǎng)時(shí)間的溶脹及塑化作用下分子鏈發(fā)生運(yùn)動(dòng)融合所致，但仍可以維持基本形態(tài)[25]。圖3 中，M3、M4 的抑菌圈較大，這是因?yàn)槠銰BRL 中負(fù)載有奧硝唑，其通過(guò)材料的降解實(shí)現(xiàn)對(duì)奧硝唑的緩釋。奧硝唑的緩釋能夠維持局部環(huán)境較高的有效藥物濃度，抑制牙周炎主要致病菌P. gingivalis的生長(zhǎng)，并且在21 d后仍有較強(qiáng)的抑菌效果，其意義在于避免全身大劑量使用抗生素造成細(xì)菌耐藥性和不良反應(yīng)。

細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖4），接種于M1、M2、M3 和M4 的MC3T3-E1 表現(xiàn)出良好的細(xì)胞增殖趨勢(shì)，其原因可能是靜電紡絲纖維具有與ECM 相似的結(jié)構(gòu)，且比表面積高、孔隙率高，有利于細(xì)胞黏 附、增 殖[26-27]；并 且M1、M2、M3 和M4 的GBRL 均負(fù)載cRGD，可通過(guò)整合素介導(dǎo)細(xì)胞黏附和生物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，可促進(jìn)細(xì)胞黏附增殖[28-29]。在第4 天和第7 天，M1 的MC3T3-E1 細(xì)胞OD 值均高于M2、M3、M4（P＜0.05），這可能是因?yàn)镸1 相較于M2、M3、M4，在4 周之后仍能維持其疏松多孔的結(jié)構(gòu)，具有更大的比表面積，有利于細(xì)胞的黏附；且M3、M4 中含有奧硝唑，其細(xì)胞毒性對(duì)MC3T3-E1 細(xì)胞的增殖有一定的影響。L929 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，M1、M2、M3 和M4 均能抑制成纖維細(xì)胞增殖，其原因?yàn)锳FL 層含有PDPA，PDPA 降解釋放L-苯丙氨酸，抑制成纖維細(xì)胞增殖。其中M1 對(duì)成纖維細(xì)胞增殖能力抑制作用最弱，其原因?yàn)镸1的AFL層為流延膜，降解速度較慢，其PDPA中的L-苯丙氨酸釋放較慢，對(duì)成纖維細(xì)胞增殖抑制程度較低。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用大鼠下頜骨骨缺損模型，驗(yàn)證復(fù)合膜在體內(nèi)的骨修復(fù)作用，應(yīng)用影像學(xué)定量分析M1、M2、M3、M4、COL 組和對(duì)照組在術(shù)后即刻、第2 周、第4 周、第6 周和第8 周的新骨形成情況。如圖5B 所示，在第8 周，M1、M2、M3、M4 及COL 組的最大缺損直徑均小于NC 組，且從圖5C 中同樣可以看出M1、M2、M3、M4 組的骨體積重建率均高于COL 組和NC 組，這是因?yàn)榫哂刑荻冉Y(jié)構(gòu)的復(fù)合膜既能依靠AFL 層的降解釋放L-苯丙氨酸抑制結(jié)締組織異常增生，GBRL層負(fù)載的cRGD 及n-HA 又能促進(jìn)成骨細(xì)胞的黏附增殖。在不同復(fù)合膜中，又以M3修復(fù)效果最佳，這是因?yàn)橄噍^于M1 來(lái)說(shuō)，M3 的GBRL 層中額外負(fù)載了奧硝唑，降低了與植入物相關(guān)感染的可能性[30]，減少其對(duì)骨修復(fù)的影響，而M1 與M3 相比，其AFL 層降解速度較慢，對(duì)成纖維細(xì)胞增殖抑制作用差（圖4B），這一點(diǎn)與圖6D 的結(jié)果相一致；而M2 中同樣不含有奧硝唑，圖6A 中也可以看到其有大量的炎細(xì)胞浸潤(rùn)，這在一定程度上延緩了骨修復(fù)的進(jìn)展；而M4 與M3 相比，其GBRL 中缺少n-HA，羥磷灰石的骨引導(dǎo)作用能夠加速骨缺損組織的修復(fù)。組織切片染色也與影像學(xué)分析一致：M1、M3 和M4 組條帶狀新生骨組織內(nèi)可見(jiàn)大量藍(lán)色膠原纖維，骨組織兩側(cè)可見(jiàn)較多成骨細(xì)胞成片分布，表明其成骨細(xì)胞生長(zhǎng)活躍；M1、M2、M3、M4 組較NC 組與COL 組均未見(jiàn)軟組織侵入骨組織，表明復(fù)合膜起到了良好的屏障作用，有效地阻擋了成纖維細(xì)胞的干擾。綜上，M1、M2、M3和M4 均有良好的促進(jìn)骨組織再生能力，其中M3的骨修復(fù)能力最為突出。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)采用乳液靜電紡絲技術(shù)成功制備負(fù)載cRGD、奧硝唑和n-HA 的PLGA 基多層復(fù)合膜。該復(fù)合膜纖維直徑均勻，具有疏松多孔的三維結(jié)構(gòu)，生物相容性良好，體外抑菌實(shí)驗(yàn)表明其對(duì)P. gingivalis具有一定的抑制作用。大鼠頜骨骨缺損模型結(jié)果表明，其體內(nèi)抗菌及骨修復(fù)能力良好，極有潛力應(yīng)用于誘導(dǎo)牙周疾病所致牙周骨缺損的修復(fù)。

利益沖突聲明：作者聲明本文無(wú)利益沖突。