林平冬，陳麗妃，吳允昆

（福建師范大學，福建 福州 350117）

梔子（Gardenia jasminoides Ellis）又稱黃梔子、山梔子，為茜草科植物梔子的果實，是一種具有較高營養(yǎng)價值以及在多種行業(yè)均有廣泛應用的藥食兩用資源[1]。梔子在食品中的應用主要是以梔子果實為原材料進行梔子油的提取，梔子黃色素等天然色素的開發(fā)以及功能性飲料的加工等。同時，梔子還具有保肝利膽、解熱鎮(zhèn)痛、抗炎、抗氧化、抗腫瘤、降糖降脂和神經(jīng)保護等多種生理功能，具備良好的保健食品開發(fā)和利用價值[2-3]。植物中具有顯著生理活性和藥理作用，并在臨床上有應用價值的化學成分稱為有效成分。目前梔子屬植物中已被分離鑒定的有效成分包括環(huán)烯醚萜類、三萜類化合物、有機酸類、黃酮類、多糖類以及揮發(fā)油等。其中環(huán)烯醚萜類的梔子苷以及梔子黃色素、黃酮、梔子油等物質的研究最為常見。多糖在梔子果實中的含量約為4%～11%，也是梔子重要的有效成分之一，但目前關于梔子多糖的研究并不多。本文對梔子多糖的提取、分離純化及其化學結構、生物活性等方面的研究現(xiàn)狀詳細闡述，以期為梔子多糖的進一步深入研究和開發(fā)利用提供理論參考。

1 梔子多糖的制備方法

1.1 梔子多糖的提取

1.1.1 原材料預處理

多糖的提取是對多糖進行研究和分析的基礎。用于多糖提取的植物原材料通常含有較多的脂類物質，在提取過程中容易隨多糖一起從破碎后的細胞中被提取出來，因此需要對原材料進行脫脂預處理。一般采用乙醇、石油醚等有機溶劑浸泡或者回流提取的方法除去脂質，同時除去部分脂溶性色素。脫脂后的原材料以水、稀酸或稀堿溶液為溶劑進行提取，所得提取液經(jīng)過濾、濃縮、有機溶劑（乙醇、甲醇、丙酮或異丙醇等）沉淀后可得粗多糖樣品。

1.1.2 提取方法研究概況

梔子多糖是一種水溶性多糖，因此一般以水為溶劑進行提取，考察的提取工藝參數(shù)包括料液比、提取溫度、提取時間、提取次數(shù)等。選擇的參數(shù)不同，提取結果差異較大。因此還需通過工藝優(yōu)化來確定最佳提取條件。常用的工藝優(yōu)化方法有正交法、響應面法等。如鄭文誠等[4]通過響應面法優(yōu)化水浸提梔子多糖最佳工藝條件為時間4.5 h、溫度85℃，在此條件下，梔子多糖提取率為3.651%。宋智琴等[5]采用正交試驗法優(yōu)選梔子多糖的水提工藝，確定最佳提取時間為1.5 h，在此條件下，梔子多糖提取率為4.61%。水提法主要是以浸漬、回流的方式進行，此外還可采取微波輔助提取或超聲波輔助提取等方式，以提高多糖提取率。但目前采用這兩種方法制備梔子多糖的研究相對較少。宮江寧等[6]研究表明，采用超聲波輔助提取梔子多糖，并經(jīng)響應面法優(yōu)化后的最佳提取工藝條件為超聲功率120 W、提取時間73 min，在此條件下，梔子多糖的提取率為（6.34±0.09）%?？梢?，與單純水浸漬或回流提取相比，超聲波輔助提取明顯縮短了提取時間同時提高了提取效率。這是由于超聲波的空化效應可增大物質分子運動頻率，增加溶劑穿透率，使得物質成分溶出速度加快、次數(shù)增加，且超聲破碎是一個物理過程，因而不會改變被提取成分的結構和性質。韓東等[7]采用閃式提取工藝提取梔子多糖，響應面法確定最佳提取時間僅為42 s，在此條件下，多糖得率可達6.38%。閃式提取與其他提取方法相比，能夠在短時間內最大限度萃取出有效成分，并具有溶劑用量少、提取效率高的特點，尤其在提取時間上表現(xiàn)出極大的優(yōu)勢。但目前，閃式提取工藝在梔子多糖的提取中應用較少。

1.2 梔子多糖的分離純化

多糖的分離純化是探討多糖結構和生物活性的首要前提。經(jīng)水提醇沉得到的粗多糖通常含有蛋白質、色素和小分子化合物等非多糖組分，需通過一系列純化步驟先將雜質去除，再對多糖組分進行分級純化，以獲得化學組成、聚合度和分子形狀相同的均一多糖。多糖純度越高，其結構越穩(wěn)定，越有利于后續(xù)理化性質的鑒定和結構表征[8]。目前，梔子多糖的純化工藝并無特定標準，通用的流程包括脫蛋白、脫色、除雜的初步純化，以及采用分步沉淀法、金屬絡合物法、離子交換法、柱層析法等進行的分級純化[9]。

1.2.1 多糖的脫蛋白方法

常見的脫蛋白方法有沙維積法、三氟三氯乙烷法、三氯乙酸法以及酶解法等。沙維積法、三氟三氯乙烷法、三氯乙酸法均是利用蛋白質在有機溶劑中變性的原理除去蛋白；蛋白酶法則是利用蛋白質水解酶，使蛋白質大分子降解達到去除目的。每種方法對脫除梔子多糖中蛋白的效果不一。蔡永紅等[10]研究比較了沙維積法、三氯乙酸法和蛋白酶法3種方法對梔子多糖中蛋白的去除效果，結果顯示，三氯乙酸法除蛋白的效果最好。有時單一的除蛋白方法雖去除蛋白多，但也伴隨著多糖的損失大。為了既可以有效地去除蛋白質，又能較好地保留多糖，可以采用兩種方法聯(lián)用。一般認為，可以先使用蛋白質水解酶降解樣品中的部分蛋白質，再采用沙維積法效果更佳。此外，有研究采用冷酚抽提法連續(xù)抽提梔子粗多糖溶液中的蛋白3次，使得雜蛋白的脫除率達到90%以上[11]。為減少有機溶劑的用量，還可以采取將樣品反復凍融離心除蛋白的方法。如王慶奎等[12]將沙維積法和反復凍融法對當歸多糖的脫除效率進行對比，結果表明，反復凍融法除蛋白的效果優(yōu)于沙維積法。從環(huán)保和安全性的角度來講，反復凍融法避免了有機溶劑的使用，可減少對環(huán)境的污染以及目標成分中有機溶劑殘留，但該法對多糖的生物活性是否有影響尚待探討。

1.2.2 多糖的脫色方法

多糖的來源不同以及提取方法的局限導致色素殘留而賦予多糖較深的顏色，植物多糖常呈現(xiàn)為褐色、紅色或黃色。由于色素屬于雜質性物質，會影響多糖的進一步分離純化、定性和定量分析以及結構測定，因此有必要對多糖進行脫色處理。目前，多糖的脫色方法有吸附法（活性炭吸附、大孔吸附樹脂吸附）、離子交換法（弱堿性離子交換樹脂）、過氧化氫（H2O2）氧化法、金屬絡合物法等。脫色前的梔子多糖溶液所含色素主要為梔子黃色素，這是一種以藏紅花素和藏紅花酸為主要成分的水溶性類胡蘿卜素，在水提取梔子多糖時一同被提取溶于水中而使多糖溶液呈黃色或橘黃色。大部分的梔子黃色素在原材料脫脂預處理階段和使用乙醇沉淀多糖的過程中被留在上清液中而除去，剩余的部分可通過吸附樹脂或離子交換樹脂，利用物理吸附和離子交換作用將色素脫除。

植物多糖還可能含有酚類、羥基蒽醌衍生物等大多呈負性離子的色素，以及部分與糖結合的色素，這些色素不適合用活性炭吸附脫色，可選擇二乙氨基乙基（dicthylaminoethyl，DEAE）纖維素或 Duolite A-7等弱堿性離子交換樹脂，或采用H2O2氧化脫色。樹脂與H2O2對多糖均有較高的脫色效率，而且樹脂的脫色效果甚至優(yōu)于H2O2[13-14]。但樹脂處理量小，生產(chǎn)周期長，且容易受污染，因而成本較高。H2O2脫色后不易復色，且脫色劑易于從樣品中清除，較樹脂脫色過程更為簡單。不過相較于物理吸附，化學氧化過程可能造成多糖結構的破壞，降低多糖活性，因而使用此法必須結合多糖保留率指標來篩選出合適的H2O2水平[15]。

1.2.3 多糖的除雜方法

除了蛋白質和色素，粗提的植物多糖還含有無機鹽及單糖、低聚糖等一些醇不溶性的小分子有機物，影響多糖純度和質量，必須分別去除。目前，去除小分子雜質多采用透析法。多糖中的小分子雜質去除主要通過蒸餾水透析，利用透析袋的半透性使溶質中的小分子物質從高濃度溶液擴散到低濃度溶液中，直至滲透壓達到平衡。通過不同截留分子量的透析袋可使目標分子與雜質得以分離。梔子多糖的分子量為10 kDa～50 kDa，10 kDa以下的透析袋并不會使多糖分子透過流失。因此，針對梔子多糖的透析，可采用3 kDa～4 kDa的透析袋透析24 h～72 h，除去小分子雜質，由此可獲得初步純化的梔子多糖。

1.2.4 多糖的分級純化方法

多糖不是一種純粹的化學物質，而是聚合程度不同的物質混合物。提取、除雜后的多糖在單糖組成、相對分子質量分布、結構等方面仍有不均一性。還需通過分級純化將多糖混合物分離為均一的多糖，以適用于后續(xù)多糖的化學結構和生物功能的研究。常用的分級純化方法有沉淀法、色譜分離法以及膜分離法等。

根據(jù)不同組分多糖的分子量大小差異以及在有機溶劑或鹽析劑中的溶解度不同的特性，可采用有機溶劑沉淀法和鹽析法。其中最常用的是乙醇分步沉淀法，通過增加乙醇濃度使多糖組分按照分子量由大到小逐級沉淀而出[16]。鹽析法則是向多糖溶液中加入中性鹽（如氯化鈉、氯化鉀、硫酸銨等），使各多糖組分按溶解度差異而在鹽溶液中逐步析出。另有季銨鹽沉淀法，是指以季銨鹽及其氧化物為乳化劑，與酸性多糖形成不溶性沉淀，使之得以與中性糖分離。沉淀法適用于物化性質差異較大的多糖組分，對于一些性質較為接近的待分離組分，色譜分離法具有明顯的優(yōu)越性[17]。色譜分離法能夠依靠植物多糖中各組分物化性質的差異，及其在兩相之間分布和流動速度的差異實現(xiàn)分離目的。根據(jù)分離原理不同，色譜分離法可分為凝膠柱色譜法和離子交換柱色譜法。前者常用的層析柱填料為葡聚糖凝膠和瓊脂糖凝膠，并根據(jù)凝膠顆粒間隙小的特點，利用分子篩原理將分子量大小不同的組分進行分離，但此法不適宜分離黏多糖[18]。離子交換柱色譜法則是以DEAE-纖維素和交聯(lián)醇胺-纖維素為交換劑，通過載體表面帶電基團與樣品離子及淋洗離子進行可逆交換、離子偶極作用和離子吸附實現(xiàn)色譜分離。

關于梔子多糖的分級純化目前少有深入研究，僅見孟延發(fā)等[19]將梔子粗多糖GPS1通過DEAE-纖維素（DE-52）柱層析得GPS2和GPS3兩個組分，GPS2和GPS3分別經(jīng)SephadexG-200層析進一步純化得精品GPS4和GPS5，并由電泳分析驗證GPS4和GPS5是均一性多糖。說明凝膠柱對梔子多糖有良好的分級純化效果。由于天然植物成分復雜，僅憑一種色譜分離方法無法很好滿足試驗和生產(chǎn)的需要，多種方法聯(lián)用是促進多糖分離純化發(fā)展的途徑之一。實際過程中常將離子交換層析和凝膠過濾層析聯(lián)合用于多糖純化。

2 梔子多糖的化學結構

2.1 多糖的初級結構及其解析方法

多糖是一種化學結構比蛋白質更為復雜的生物大分子，但它又與蛋白質一樣具有分級結構。多糖的結構可分為初級結構（一級）和高級結構（二、三、四級）。初級結構包括分子量、單糖組成、異頭碳構型、糖苷鍵的類型和連接順序、糖鏈有無分支以及分支的位置與長短、取代度等，這些均是與多糖生物活性相關的重要因素[20]。多糖的高級結構和空間構象對其活性和功能有決定性作用，而初級結構是高級結構的基礎。因此，對多糖初級結構的解析是深入探討其活性和功能的前提。

當前對多糖初級結構的解析技術已相對成熟，包括經(jīng)典的化學方法如水解法、高碘酸氧化法、Smith降解、甲基化、乙?；?；生物學方法如特異性糖苷酶水解、免疫學方法等；還有儀器分析法如色譜法、光譜法、質譜法和核磁共振譜法等。水解法是分析單糖組成及比例的主要手段，通過水解過程將多糖鏈分解成單糖，包括完全酸水解、部分酸水解、乙酰解和甲醇解等。水解后的多糖經(jīng)中和、過濾后可采用薄層色譜法、高效液相色譜法、氣相色譜法和離子色譜法等進行分析[21-23]。高碘酸氧化法和Smith降解主要用于判斷糖苷鍵的位置、直鏈多糖的聚合度和支鏈多糖的分支數(shù)，同時結合甲基化反應、質譜法以及核磁共振譜法可對糖鏈接順序及鏈接位點、取代官能團等進行具體分析[24-25]。光譜法有紅外光譜和拉曼光譜，常用于多糖糖環(huán)形式（吡喃型、呋喃型）和異頭碳構型（α型、β型）的分析[26]。此外，一些現(xiàn)代化新型解析技術如毛細管電泳-質譜聯(lián)用技術、基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜、二維核磁共振等的發(fā)展與應用，使多糖一級結構解析邁入更微量、更高效、更快速和更準確的層次[27]。

2.2 梔子多糖的化學結構研究概況

關于梔子多糖的化學結構，目前僅見分子量、單糖組成以及糖苷鍵類型測定方面的研究報道。如孟延發(fā)等[19]采用SephadexG-150層析法測得多糖組分GPS4和GPS5的分子量分別為14 000和10 000；經(jīng)紅外光譜分析GPS4和GPS5分別含有β-糖苷鍵和呋喃糖苷鍵構型。馬越鳴等[28]的研究顯示，其制備所得梔子多糖的重均相對分子量為10 kDa～20 kDa，其中總糖含量為41%～56%，糖醛酸含量為34%～45%，蛋白質含量為7%～10%；并經(jīng)完全酸水解后分析，梔子多糖的主要單糖組成為鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖。另有研究表明，梔子花多糖組分的主要成分為中性糖（46.83±3.14）%、糖醛酸（35.21±0.17）%、蛋白質（1.63±0.34）%和總酚（9.49±0.08）mgGAE/g；主要單糖為半乳糖醛酸（41.05±0.59）%，其他單糖組成包括半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖、鼠李糖、木糖、甘露糖和葡萄糖醛酸[29]。各研究報道的梔子多糖在單糖組成方面較為接近，而分子量大小有明顯差異，這是因為多糖和低分子量化合物不同，它是不同分子量同系物的混合體系，并無固定的分子量，不同的純化方法和純化程度可獲得不同分子量范圍的均一多糖。上述研究僅僅是對梔子多糖初級結構的解析，目前國內外尚無關于解析梔子多糖高級結構的相關報道，這主要與多糖高級結構解析難度高、解析技術水平相對有限等原因有關。即使現(xiàn)代儀器在多糖高級結構的研究上已大有突破，但總體應用仍較少。

3 梔子多糖的生物活性

3.1 梔子多糖的免疫調節(jié)和抗氧化活性

植物多糖具有廣泛的生物活性，其中免疫調節(jié)和抗氧化是其較為突出也較為普遍的功能。植物多糖可作為免疫調節(jié)劑，通過激活巨噬細胞、激活補體系統(tǒng)、促進細胞因子生成等途徑，進一步活化T淋巴細胞和B淋巴細胞，發(fā)揮免疫調節(jié)作用，增強機體的免疫功能[30]。植物多糖的抗氧化性主要表現(xiàn)在對超氧陰離子自由基（O2-·）、羥基自由基（·OH）、脂質過氧化物等多種活性氧物質具有明顯的抑制和清除作用，該作用可抑制脂質過氧化并提高抗氧化酶活性，形成抗氧化過程[31]。研究表明，梔子多糖具有一定的抗氧化能力，但總還原能力小于維生素C，其清除自由基的強弱順序為·OH＞DPPH·＞ABTS+·＞O2-·[6]。王曉穎等[32]研究發(fā)現(xiàn)，梔子多糖對DPPH·、OH·以及O2-·的清除率分別為21.65%、70.97%、19.26%，且可促進小鼠單核巨噬細胞白血病細胞（RAW264.7）的增殖，在體外表現(xiàn)出良好的抗氧化活性及免疫作用。但該研究結果與石若夫[33]發(fā)現(xiàn)的梔子多糖對O2-·的清除效果最好（清除率83.48%），而對·OH的清除效果不佳（清除率28.14%）有所差異。其影響因素可能有原材料梔子的產(chǎn)地、質量以及不同試驗過程中對梔子多糖的處理方法不同等，而同一梔子多糖對不同自由基的清除效果不同，可能與多糖本身的純度和結構差異有關。

3.2 梔子多糖的抗腫瘤活性

就多糖的抗腫瘤機制而言，可將多糖分為兩大類：一類是能夠直接殺死腫瘤細胞的具有細胞毒性的多糖；另一類是通過阻滯細胞周期或作為生物免疫反應調節(jié)劑，通過提高機體免疫功能而間接發(fā)揮抗腫瘤作用的多糖[34-35]。大部分植物多糖的抗腫瘤作用主要與其免疫調節(jié)作用有關，且從結構上分析，雜多糖的抗腫瘤活性比同多糖更強[36]。此外，多糖的空間構象對其抗腫瘤活性也有影響，其中具有β-（1→3）-D-葡聚糖的三股螺旋結構的多糖抗腫瘤活性顯著[37]。有關梔子多糖的抗腫瘤活性實驗結果顯示，梔子多糖對植物根癌農(nóng)桿菌引起的根瘤、人紅白血病K562細胞和小鼠腹水肝癌Hca-f實體瘤的抑制率分別為68.4%、63.2%、49.0%，說明梔子多糖具有較廣譜的抑瘤效應和良好的抑瘤效果[38]。體外抑制腫瘤細胞實驗研究表明，梔子多糖對S-180肉瘤細胞和腹水肝癌細胞均有一定的抑制作用，抑制率分別達到51%和58%[19]。以上研究結果均表明，梔子多糖具有明顯的抗腫瘤活性，且都顯示對肝癌細胞有50%左右的抑制效果。近年來也有研究報道，梔子多糖對α-異硫氰酸萘酯（1-naphthyl isoth-iocyanate，ANIT）和 3，5-二乙氧基羰基-1，4-二氫-2，4，6-三甲基吡啶（3，5-diethoxycarbonyl-1，4-dihydro-2，4，6-collidine，DDC） 誘導的膽汁淤積性肝損傷以及CCl4誘導的肝纖維化有明顯的改善作用[28]。此結論進一步證明梔子多糖在肝損傷方面的保護作用。由此可見，梔子多糖有開發(fā)成為預防、調節(jié)或改善肝臟疾病癥狀以及具有護肝作用的功能性食品的良好前景。

3.3 梔子多糖的降血糖活性

植物多糖可通過多種途徑發(fā)揮降血糖功能，主要作用機制包括：抑制胰島β細胞凋亡；調節(jié)胰島素與靶細胞特異性結合，增強胰島素敏感性，改善胰島素抵抗；調節(jié)糖代謝酶等關鍵酶活性，促進肝糖原合成，抑制糖異生；通過調控糖原合成、分解及促進血糖利用；通過增強免疫系統(tǒng)功能和抗氧化作用保護及修復胰島β細胞，促進胰島素分泌，拮抗胰高血糖素升高，以此調節(jié)糖代謝[39-40]。目前，有關梔子多糖降血糖活性的研究并不多，僅宮江寧等[6]在提取梔子多糖后對其進行了抑制α-葡萄糖苷酶的活性檢測，結果表明，在梔子多糖濃度為2 000 mg/L～8 000 mg/L，半抑制濃度（IC50）為1 550 mg/L，說明梔子多糖有一定的降血糖活性。雖然不同種屬植物多糖的降血糖機制無明顯差別，但各科屬類之間存在多樣性，因而梔子多糖具體是通過何種途徑發(fā)揮降血糖作用還需進一步研究和探討。

4 總結與展望

梔子多糖來源于梔子果實，具有植物多糖所具有的生物活性廣泛、毒性低、副作用小的特點。且梔子作為一種優(yōu)質的藥食兩用資源，其多糖成分在保健食品領域也具有廣泛的應用前景。因此梔子多糖的制備及其理化性質、活性研究，以及更進一步的構效關系的探討，都具有重要的意義。

多糖是一種結構多樣的生物大分子，相比于蛋白質和核酸等其他生物聚合物，其承載生物信息的能力更高，具有的結構變異潛力更大。對多糖結構和生物功能的研究已成為繼蛋白質、核酸之后探索生命奧秘的第3個里程碑。但由于多糖的研究起步較晚，又因其種類繁多，結構復雜，分離純化難度大等問題，使得目前對多糖的研究仍落后于蛋白質和核酸。就目前的研究工作來看，梔子多糖的相關研究主要集中在國內，研究內容涵蓋梔子多糖的提取、分離純化、基本性質以及生物活性，但各方面內容的研究報道均較少，尤其對梔子多糖結構方面的研究相當缺乏?，F(xiàn)有相關研究僅是測定其分子量、單糖組成和糖苷鍵類型等多糖的基礎性質。

相較于其他植物多糖的研究內容和進展，梔子多糖的研究尚處于滯后階段。而我國擁有豐富的梔子資源，以及目前相對先進的研究手段和技術，研究者應該充分利用這些有利條件，對梔子多糖進行更多、更深入的探討，讓梔子多糖得到合理有效的利用和開發(fā)。