劉杰 李小航 李安安 王志勇

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)中最常見(jiàn)的腫瘤之一，絕大多數(shù)膀胱癌在診斷時(shí)屬于非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌(nonmuscle invasive bladder cancer，NMIBC)[1]。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的組織學(xué)分級(jí)、TNM 分期、大小以及中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞比值均有助于預(yù)測(cè)患者的預(yù)后[2-3]。但這些指標(biāo)易受臨床因素干擾，且存在不具備反映腫瘤分子生物學(xué)特性能力的缺陷。

循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell，CTC）是指外周血中的所有腫瘤細(xì)胞的統(tǒng)稱，與腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[4]，傳統(tǒng)的CTC 檢測(cè)技術(shù)主要基于CTC計(jì)數(shù)進(jìn)行預(yù)后分析。研究表明，通過(guò)差相富集和免疫熒光染色-染色體熒光原位雜交（SE-iFISH）技術(shù)分析CTC 核型中特異性的CTC 亞群，有助于精確預(yù)測(cè)患者的預(yù)后[5]。Yao 等[6]研究發(fā)現(xiàn)，CTC 的非整倍性與肺癌患者的預(yù)后相關(guān)。目前，CTC 核型對(duì)預(yù)測(cè)NMIBC患者預(yù)后的價(jià)值有待進(jìn)一步證實(shí)。本研究旨在通過(guò)分析NMIBC 患者外周血中CTC 和CTC 核型與預(yù)后之間的關(guān)系，為臨床預(yù)測(cè)患者預(yù)后提供參考。

1 材料和方法

1.1 臨床資料

選取2018 年5 月至2019 年5 月于承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院首次診治的109 例患者臨床資料，分為NMIBC 組(Tis、Ta、T1)58 例，良性病變組51 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：1）年齡為18～90 歲；2）入組前未行任何輔助抗癌治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：1）無(wú)法耐受手術(shù)或失訪者；2）既往合并惡性腫瘤病史；3）CTC 檢測(cè)樣本不合格。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并獲得患者的知情同意。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑及儀器 人外周血CTC 差相富集試劑盒購(gòu)自美國(guó)Cytelligen 公司，CD45 單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abbkine 公司。G1-8023 微型臺(tái)式真空泵購(gòu)自中國(guó)Kylin-Bell 公司，S500-24 熒光原位雜交儀購(gòu)自德國(guó)Leica 公司，DS-Fi1c 顯微鏡相機(jī)購(gòu)自日本Nikon公司。

1.2.2 SE-iFISH 技術(shù) 術(shù)前1 周和術(shù)后第3 個(gè)月分別采集患者的外周靜脈血7.5 mL。根據(jù)Lin 等[5]研究采用SE-iFISH 技術(shù)富集及識(shí)別CTC 和CTC 核型。樣本離心去除上清液得到富含血細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的下層液體，再加入Cytelligen 細(xì)胞分離液在離心機(jī)中離心后得到上清液，后加入免疫磁珠并在磁性機(jī)架的磁場(chǎng)作用下去除白細(xì)胞。得到富含CTC 的細(xì)胞懸液，行SE-iFISH，取細(xì)胞懸液依次加入CEP8、CD31、CD45、DAPI，并進(jìn)行固定、干燥、封片，由2 位檢驗(yàn)科醫(yī)生在熒光顯微鏡下鑒定CTC 并分析其核型。CTC標(biāo)準(zhǔn)定義：DAPI 陽(yáng)性、CD45 陰性、CD31 陰性、CEP8 陽(yáng)性≥三倍體。根據(jù)本課題組前期的研究，以每7.5 mL 外周靜脈血中CTC 數(shù)目≥1 個(gè)判定為CTC陽(yáng)性[7]。通過(guò)CTC 核內(nèi)8 號(hào)染色體數(shù)量定義核型，分為CTC 三倍體、四倍體、五倍體和多倍體。依據(jù)既往文獻(xiàn)報(bào)道將患者的核型進(jìn)行分組，患者CTC 三倍體數(shù)目≥60%為三倍體組，數(shù)目＜60%為非三倍體組[8]。

1.2.3 隨訪 門診行膀胱鏡和B 超、CT 檢查，NMIBC組患者均完成隨訪?；颊咝g(shù)后少于2 年，每隔3 個(gè)月復(fù)查1 次；超過(guò)2 年每隔6 個(gè)月復(fù)查1 次。終點(diǎn)事件無(wú)病生存（disease-free survival，DFS）期定義為從血液樣本采集至術(shù)后患者出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)或死亡的間隔。截止至2021 年2 月。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism7.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）描述，計(jì)數(shù)資料采用Chi-square 檢驗(yàn)。采用 Kaplan-Meier 法和Log-rank法進(jìn)行生存分析，采用Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行多因素分析。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CTC 核型的形態(tài)特征

SE-iFISH 檢測(cè)結(jié)果顯示出CTC 的異質(zhì)性。CTC標(biāo)準(zhǔn)定義為DAPI 陽(yáng)性（藍(lán)色）、CD45 陰性（紅色）、CD31 陰性（無(wú)色）、CEP8 陽(yáng)性（橙色）≥三倍體，熒光顯微鏡下CTC 核型見(jiàn)圖1。

圖1 熒光鏡下不同CTC 核型形態(tài)特征

NMIBC 組患者的術(shù)前外周血中CTC 陽(yáng)性率為81.0%（47/58），術(shù)前CTC 數(shù)目為327 個(gè)，其中三倍體118 個(gè)、四倍體53 個(gè)、五倍體及多倍體156 個(gè)；術(shù)后CTC 陽(yáng)性率為60.3%（35/58），術(shù)后CTC 數(shù)目為356個(gè)，其中三倍體103 個(gè)、四倍體35 個(gè)、五倍體及多倍體218。58 例NMIBC 組患者中，術(shù)前三倍體為19例、非三倍體為39 例，術(shù)后三倍體為15 例、非三倍體為43 例。良性病變組患者的CTC 陽(yáng)性率為9.8%（5/51），與NMIBC 組患者的術(shù)前CTC 陽(yáng)性率比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)?；颊咝g(shù)前、術(shù)后CTC陽(yáng)性率比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.014）。

2.2 CTC 與患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

NMIBC 組患者的腫瘤最大徑≥3 cm 的CTC 陽(yáng)性率為95.5%（21/22），最大徑＜3 cm 為72.2%（26/36），兩者比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.029）；血尿患者的CTC 陽(yáng)性率為90.7%（39/43），無(wú)血尿?yàn)?53.3%（8/15），兩者比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001）；其他臨床病理特征的CTC 陽(yáng)性率比較均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 NMIBC 組患者的臨床特征與術(shù)前CTC 檢測(cè)情況比較

2.3 CTC 核型和CTC 與患者DFS 的關(guān)系

NMIBC 組患者的中位DFS 為18（2～29）個(gè)月，58 例中10 例復(fù)發(fā)，2 例死亡。術(shù)前三倍體組患者的中位DFS 為13 個(gè)月，非三倍體組的中位DFS 為19個(gè)月，兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=19.00，P＜0.001，圖2A）；術(shù)后三倍體組患者的中位DFS 為10 個(gè)月，少于非三倍體組的21 個(gè)月，兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=25.920，P＜0.001，圖2B)。

圖2 Kaplan-Meier 法分析CTC 核型對(duì)NMIBC 患者術(shù)后DFS 的影響。

術(shù)前CTC 陽(yáng)性患者的中位DFS 為16（2～29）個(gè)月，少于CTC 陰性的26（12～29）個(gè)月，兩者比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.603，P=0.205，圖3A)；術(shù)后CTC陽(yáng)性患者的中位DFS 為15（2～26）個(gè)月，顯著少于CTC 陰性患者的24（9～29）個(gè)月，兩者比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.444，P=0.006，圖3B)。

圖3 Kaplan-Meier 法分析CTC 對(duì)NMIBC 患者術(shù)后DFS 的影響。

2.4 患者的預(yù)后分析

單因素分析顯示，術(shù)前、術(shù)后CTC 核型、術(shù)后CTC與DFS 具有顯著性相關(guān)，納入Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型多因素分析顯示，術(shù)前、術(shù)后CTC 核型是NMIBC患者DFS 的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（表2）。

表2 NMIBC 患者DFS 的單因素和多因素分析

3 討論

本研究采用差相富集法獲得CTC 后，通過(guò)SEiFISH 技術(shù)對(duì)CTC 進(jìn)行染色和鑒定，并在熒光顯微鏡下分析其核型，SE-iFISH 技術(shù)對(duì)MNIBC 患者表現(xiàn)出良好診斷性能，結(jié)果顯示術(shù)前CTC 陽(yáng)性率為81.0%（47/58），優(yōu)于基于葉酸受體α（FRα）技術(shù)的61.9%和CellSearch 技術(shù)的27.3%[9-10]，可能與SE-iFISH 技術(shù)不受腫瘤細(xì)胞大小、血滲透壓和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化等因素限制相關(guān)[5]。本研究還發(fā)現(xiàn)，患者外周血中的CTC 陽(yáng)性率，術(shù)后較術(shù)前明顯降低，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，CTC 陽(yáng)性率降低可能與手術(shù)切除病灶密切相關(guān)。腫瘤的復(fù)發(fā)、進(jìn)展以及轉(zhuǎn)移與“種子”CTC 的出現(xiàn)有關(guān)[4]，Rink 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，術(shù)后100 例膀胱癌共24例患者復(fù)發(fā)，其中CTC 陽(yáng)性復(fù)發(fā)者為14 例、CTC陰性為10 例，預(yù)后生存分析顯示CTC 陽(yáng)性與腫瘤復(fù)發(fā)相關(guān)。本研究同時(shí)對(duì)NMIBC 患者進(jìn)行術(shù)前和術(shù)后CTC 檢測(cè)，結(jié)果顯示無(wú)論術(shù)前還是術(shù)后CTC 陽(yáng)性患者的中位DFS 均少于CTC 陰性者，生存分析顯示相比術(shù)后CTC 陰性患者，CTC 陽(yáng)性者的預(yù)后更差，但術(shù)前CTC未出現(xiàn)類似結(jié)果，與上述的研究結(jié)果[11]不一致。本研究采用新型的SE-iFISH 技術(shù)，CTC 陽(yáng)性率顯著高于Flaig 等[10]所采用的CellSearch 技術(shù)，這可能是造成研究結(jié)果差異的主要原因，此外還與腫瘤TNM 分期、術(shù)式等方面的差異密切相關(guān)。未來(lái)還需長(zhǎng)時(shí)間隨訪、擴(kuò)大樣本量來(lái)評(píng)估術(shù)前CTC 在NMIBC患者中臨床價(jià)值。

基于CTC 的8 號(hào)染色體非整倍體核型，可更好地確定患者的療效和預(yù)后。研究發(fā)現(xiàn)，CTC 三倍體與患者不良的預(yù)后密切相關(guān)[8，12]，可能與CTC 三倍體內(nèi)源性耐藥有關(guān)，而CTC 數(shù)目≥四倍體與獲得性耐藥有關(guān)[13]。Lee 等[14]研究證實(shí)，CTC 非整倍體與結(jié)直腸癌患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。非整倍體細(xì)胞中自發(fā)的染色體錯(cuò)誤分離事件促進(jìn)染色體的不穩(wěn)定性，從而增加腫瘤復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。Wang 等[12]研究表明，患者外周血中的CTC 三倍體存在與較差的無(wú)進(jìn)展生存期具有顯著性相關(guān)。Chen 等[8]研究發(fā)現(xiàn)，79 例食管癌患者中63 例CTC 非三倍體（數(shù)目≥四倍體）者中多達(dá)54 例受益，而16 例CTC 三倍體患者中只有4 例受益，CTC 非三倍體患者對(duì)化療的敏感性高于CTC 三倍體者，而CTC 三倍體者對(duì)化療具有一定的抵抗力，預(yù)后更差，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)CTC 核型將有助于預(yù)測(cè)患者的預(yù)后。本研究顯示，術(shù)前和術(shù)后CTC 核型三倍體組患者的DFS 期均明顯低于非三倍體組。本研究的多因素分析顯示，術(shù)前和術(shù)后CTC 三倍體核型是影響術(shù)后NMIBC 患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，可能是因CTC 中不同的非整倍體性在預(yù)后中發(fā)揮不同的作用，而CTC 三倍體患者的預(yù)后較差，考慮與CTC 三倍體核型的內(nèi)源性腫瘤耐藥相關(guān)，CTC 三倍體的內(nèi)源性耐藥機(jī)制更有可能導(dǎo)致腫瘤患者的復(fù)發(fā)或死亡[13]。因此，CTC 三倍體可能屬于一種特殊類型的CTC，是影響患者不良預(yù)后的關(guān)鍵預(yù)測(cè)因子。相比傳統(tǒng)的影像學(xué)檢查和有創(chuàng)的膀胱鏡檢查，通過(guò)對(duì)CTC 核型和CTC 進(jìn)行分析可更早、更精準(zhǔn)地預(yù)測(cè)預(yù)后[15]。根據(jù)SEiFISH 檢測(cè)結(jié)果，對(duì)復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)高或灌注化療藥物療效較差的患者，建議縮短復(fù)查時(shí)間和調(diào)整化療藥物，以改善患者的預(yù)后。未來(lái)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)CTC 核型有可能成為NMIBC 患者預(yù)后的有力預(yù)測(cè)指標(biāo)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)不同的CTC 非整倍體核型對(duì)NMIBC 患者預(yù)后的影響意義不同，CTC 三倍體與患者較差的預(yù)后相關(guān)，術(shù)前、術(shù)后的CTC 三倍體是影響NMIBC 患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，而術(shù)前CTC對(duì)預(yù)測(cè)預(yù)后的價(jià)值還需進(jìn)一步證實(shí)。本研究為回顧性研究、隨訪時(shí)間短，存在信息和選擇偏倚，未來(lái)還需前瞻性、大樣本、長(zhǎng)時(shí)間隨訪來(lái)進(jìn)一步完善。