張婧越 吳開良 呂鑒可 付麗

浸潤性微乳頭狀癌（invasive micropapillary carcinoma，IMPC）是一種特殊的病理組織學(xué)類型。IMPC 細(xì)胞呈桑葚樣、集團性排列、生長，上皮標(biāo)志物EMA 著色于IMPC 細(xì)胞團的外表面[1]。IMPC 具有高淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、高脈管侵犯等特征，且高復(fù)發(fā)、高轉(zhuǎn)移[2]。本課題組前期行空間轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果顯示，與浸潤性導(dǎo)管癌-非特殊類型（invasive ductal carcinoma,no special type,IDC-NOS）相比，脂質(zhì)合成的關(guān)鍵基因脂肪酸合成酶（fatty acid synthase,FASN）在IMPC 中表達顯著上調(diào)[3]。國內(nèi)外多項研究表明，F(xiàn)ASN 在多種惡性腫瘤中表達升高，與癌癥的不良預(yù)后相關(guān)[4-6]。本研究旨在通過分析FASN 在IMPC 中的表達與功能，為乳腺IMPC 的預(yù)后評估提供新的生物學(xué)標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床資料 選取2010 年1 月至2015 年12 月天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院收治的171 例IMPC 及159例IDC-NOS 乳腺癌手術(shù)病例，所有患者術(shù)前均未行新輔助化療及放療。采用傾向性評分匹配法（PSM）以1∶1 對IMPC 與IDC-NOS 行最近鄰匹配（容差值為0.02），以分類變量是否年齡＞50 歲，TNM 分期中的T、N 分期為預(yù)測變量，標(biāo)準(zhǔn)化差異法評價兩組基線資料的均衡性，匹配后分為105 例IMPC 組和105例IDC-NOS 組。

1.1.2 細(xì)胞和試劑 乳腺癌T47D 細(xì)胞株購自中國PROCELL 公司。慢病毒載體構(gòu)建和包裝由上海生工生物公司完成。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)法 所有組織標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，4 μm 厚度切片，檢測組織中的FASN 表達[7]。結(jié)果判定由兩名經(jīng)驗豐富的病理醫(yī)師采用雙盲法獨立判讀。FASN 蛋白主要表達在腫瘤細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中，免疫組織化學(xué)法染色強度可分為0（無可檢測的染色）、1+（弱染色）、2+（中度染色）和3+（強染色）。陽性細(xì)胞＜5% 計為0，6%～25% 計為1+，26%～50%計為2+，51%～75%計為3+，76%～100%計為4+。計算H 分?jǐn)?shù)=Pi（i+1），其中i 代表腫瘤細(xì)胞的著色強度（0～3+），Pi 代表腫瘤細(xì)胞染色陽性的百分比。截斷值設(shè)置為150%，截斷值≥150%為FASN高表達，截斷值＜150%為FASN 低表達。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中對T47D 細(xì)胞進行培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達到70%左右時進行轉(zhuǎn)染。構(gòu)建干擾FASN 表達的慢病毒PLKO.1-FASN-sh1、sh2 實驗組和轉(zhuǎn)染空載體PLKO.1-shGFP 陰性對照組。

1.2.3 CCK8 細(xì)胞增殖實驗 將細(xì)胞重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104/mL，取0.5 mL 細(xì)胞懸液接種于24 孔板中。從第0 天開始，每日向待測孔中加入10 μLCCK8試劑，孵育3～4 h，檢測450 nm 處吸光度（OD）值。

1.2.4 劃痕實驗 待單層貼壁細(xì)胞長滿后，使用10 μL無菌槍頭在每孔平行劃3 條直線，分別于0、12、24 h鏡下觀察各組劃痕并拍照。采用Image J 軟件分析統(tǒng)計各時期劃痕的平均寬度值。

1.2.5 蛋白免疫印跡實驗 提取細(xì)胞總蛋白，SDSPAGE 電泳、封閉、加一抗（稀釋濃度1∶1 000），4℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，ECL 化學(xué)發(fā)光法檢測蛋白表達。

1.2.6 隨訪 通過查詢電子病歷、復(fù)查影像學(xué)信息及致電詢問的途徑對患者隨訪，截止2022 年3 月。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 24.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計數(shù)資料采用t檢驗法，計量資料采用非參數(shù)檢驗法。采用Kaplan-Meier 法進行生存曲線分析，采用Cox 比例風(fēng)險回歸模型分析法進行單因素和多因素分析。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PSM 后乳腺 IMPC 與IDC-NOS 臨床病理學(xué)特征的對比

所有IMPC 患者均經(jīng)EMA 染色驗證（圖1，2）。PSM 后105 例患者的分析結(jié)果顯示，IMPC 組的淋巴管癌栓和人表皮生長因子受體-2（human epidermal growth factor receptor-2，HER-2）陽性率顯著高于IDCNOS 組（P＜0.05）；FASN 在IMPC中的高表達為61.0%（64/105），顯著高于IDC-NOS 的31.4%(33/105)，兩者比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001，表1）。FASN在IMPC 和IDC-NOS 腫瘤組織中均定位于細(xì)胞質(zhì)，在IMPC 組織中FASN 多呈棕褐色，尤其在IMPC 腫瘤細(xì)胞團近間質(zhì)側(cè)相對深著色，而在IDC-NOS 組織中多為較淺著色（圖3）。

圖3 免疫組織化學(xué)法檢測FASN 在IMPC 及IDC-NOS 中的表達（SP×400）

表1 PSM 后IMPC 組和IDC-NOS 組基線情況比較

圖1 鏡下檢查IMPC 形態(tài)特征（H&E×400）

圖2 免疫組織化學(xué)法檢測EMA 表達（SP×400）

2.2 FASN 在IMPC 中的表達及與臨床病理學(xué)特征的相關(guān)性

IMPC 中FASN 的表達與患者脈管癌栓、N 分期及Ki-67 表達呈正相關(guān)（P＜0.05，表2）。

表2 FASN 表達與IMPC 臨床病理學(xué)特征的相關(guān)性

2.3 乳腺IMPC 患者預(yù)后分析

Kaplan-Meier 生存曲線分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ASN 高表達的IMPC 患者無病生存（disease-free survival,DFS）期和總生存（overall survival,OS）期顯著短于FASN 低表達者（P=0.004 和P=0.007，圖4）。單因素和多因素分析顯示，F(xiàn)ASN 高表達是IMPC 患者OS、DFS 降低的獨立危險因素（P＜0.05，表3,4）。

表3 IMPC 患者DFS 的單因素及多因素分析

圖4 FASN 對IMPC 患者的預(yù)后影響

表4 IMPC 患者OS 的單因素及多因素分析

2.4 FASN 誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進乳腺癌細(xì)胞系增殖、遷移

利用慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)T47D 細(xì)胞構(gòu)建shFASN 細(xì)胞模型（圖5A），shRNA 引物序列見表5。實驗組（sh1、sh2）細(xì)胞增殖、遷移能力均顯著下降（P＜0.001，圖5B～D），其上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）相關(guān)蛋白E-cadherin 表達上調(diào)，N-cadherin 表達下調(diào)，Wnt/β-catenin 信號通路的主要信號分子Cyclin D1、C-myc 蛋白表達下調(diào)（圖5E）。

圖5 FASN 對乳腺癌T47D 細(xì)胞增殖遷移能力的影響

表5 shRNA 引物序列

3 討論

乳腺癌是女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，是除肺癌外死亡率最高的惡性腫瘤，造成腫瘤患者死亡的主要原因是腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移[8]。乳腺IMPC 具有高淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、高淋巴管浸潤等不良生物學(xué)行為，且預(yù)后極差[1,9]。FASN 是長鏈脂肪酸從頭合成的關(guān)鍵酶，是癌細(xì)胞獲得脂肪酸的重要來源[10]。本研究顯示，F(xiàn)ASN 在IMPC 表達顯著高于IDC-NOS，并具有在IMPC 腫瘤細(xì)胞團中靠近間質(zhì)側(cè)的FASN 表達相對較高，而在內(nèi)側(cè)表達相對低的特點，提示FASN 在IMPC “集團性”侵襲、轉(zhuǎn)移過程中可能發(fā)揮重要作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ASN 表達與IMPC 患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和脈管癌栓陽性率呈正相關(guān)，提示FASN 是否與IMPC 細(xì)胞的嗜淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、嗜脈管侵襲密切相關(guān)，其潛在機制還有待進一步研究。

本研究提示，F(xiàn)ASN 高表達可作為預(yù)測IMPC 患者DFS 和OS 的獨立危險因素。精準(zhǔn)的診療是改善IMPC 患者預(yù)后的必要前提[11]，而IMPC 的精準(zhǔn)診治需要有效治療靶點的發(fā)現(xiàn)。近年來，已有大量研究發(fā)現(xiàn)FASN 與多種癌癥的預(yù)后相關(guān)，包括前列腺癌[5]、膽管癌[12]、腎透明細(xì)胞癌[6]。本研究中的部分細(xì)胞實驗的意義，在于發(fā)現(xiàn)IMPC 組織中FASN 高表達可能是腫瘤發(fā)生、發(fā)展和影響預(yù)后的重要參與機制，提示FASN可作為IMPC 的潛在治療靶點。

EMT 與腫瘤的發(fā)生有關(guān)、并賦予癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移特性[13]。EMT 的調(diào)控與多種信號通路密切相關(guān)，包括Wnt/β-catenin、表皮生長因子受體、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）和Notch 通路[14]。研究表明，F(xiàn)ASN 介導(dǎo)了卵巢癌細(xì)胞的EMT 過程，影響腫瘤的惡性進展[15]。但FASN 對乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其調(diào)控機制還尚未明確。本研究證明FASN 能增強乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移能力，并發(fā)現(xiàn)shFASN 組細(xì)胞的上皮標(biāo)志物E-cadherin 表達上調(diào)，間充質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin 表達下調(diào)，提示FASN 在乳腺癌中誘導(dǎo)EMT，且Wnt/β-catenin 信號通路可能是FASN 調(diào)控乳腺癌EMT 進而促進乳腺癌增殖、遷移的潛在機制。

綜上所述，F(xiàn)ASN 可能通過Wnt/β-catenin 通路誘導(dǎo)EMT 發(fā)生，參與IMPC 的集團性侵襲、轉(zhuǎn)移和淋巴管侵犯，其高表達是影響IMPC 患者預(yù)后的獨立危險因素，可作為評估IMPC 臨床預(yù)后的重要生物學(xué)標(biāo)志物，為IMPC 診斷、靶向治療和預(yù)后預(yù)測提供重要參考。但FASN 調(diào)控乳腺癌增殖、遷移的具體作用機制，還有待更為系統(tǒng)的深入研究。