趙婷婷 ， 郭子群 ， 高云航，2 ， 徐鳳宇，2 ， 趙傳芳

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 ， 吉林 長(zhǎng)春 130118 ； 2.動(dòng)物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ， 吉林 長(zhǎng)春 130118 ； 3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所 ， 吉林 長(zhǎng)春 130112)

噬菌體作為地球上數(shù)量最豐富的生物，能特異地拮抗宿主菌，在保護(hù)人類和動(dòng)物免受耐藥菌感染等方面具有潛在優(yōu)勢(shì)[1-2]。但體內(nèi)外抗菌試驗(yàn)結(jié)果表明，噬菌體并不能完全殺滅宿主菌[3-4]，說(shuō)明細(xì)菌具有一定的防御噬菌體的能力。事實(shí)上，數(shù)十億年來(lái)，細(xì)菌已進(jìn)化出復(fù)雜的防御體系，其中的限制性內(nèi)切酶、CRISPR/Cas系統(tǒng)等已應(yīng)用于生物技術(shù)領(lǐng)域。近年來(lái)，揭示細(xì)菌防御噬菌體機(jī)制的進(jìn)程加快，本文對(duì)此進(jìn)行綜述，希望為其在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考。

1 抑制噬菌體吸附

噬菌體吸附于細(xì)菌表面的受體是其復(fù)制的開(kāi)始(圖1A)，抑制吸附是細(xì)菌防止噬菌體感染最安全的方法。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌可通過(guò)以下方式抑制噬菌體吸附。

1.1 以外膜泡結(jié)合噬菌體 Reyes-Robles等[5]研究顯示，霍亂弧菌分泌的天然誘餌外膜泡(Outer membrane vesicles，OMVs)可結(jié)合烈性噬菌體，無(wú)脂多糖O1(噬菌體ICP1的受體)的E7946ΔwbeL及O139株霍亂弧菌分泌的OMVs不能抑制ICP1(宿主菌為E7946)感染，而E7946株分泌的OMVs可以(圖1B)；由OMVs介導(dǎo)的對(duì)噬菌體ICP2的抑制作用依賴于ICP2的受體OmpU(圖1C)，表明此抑制作用具有OMVs所含噬菌體受體依賴性。

1.2 受體突變和表面修飾阻斷吸附 韓生義[6]篩選到耐噬菌體SP1的QHM株沙門(mén)菌，并發(fā)現(xiàn)該菌株參與脂多糖(LPS)合成的rfaJ基因發(fā)生了G721T突變，使編碼谷氨酸的GAG突變?yōu)榻K止密碼子，影響糖基轉(zhuǎn)移酶的合成，導(dǎo)致LPS結(jié)構(gòu)不完整，阻斷了噬菌體SP1吸附(圖1D)，并通過(guò)構(gòu)建缺失株QHΔrfaJ證實(shí)了該結(jié)果。Harvey等[7]提出了利用糖基化掩蔽以IV型菌毛蛋白(T4P)為受體的銅綠假單胞菌噬菌體潛在結(jié)合位點(diǎn)的觀點(diǎn)；作者研究發(fā)現(xiàn)，O抗原和D-阿拉伯呋喃糖聚合物糖基化可保護(hù)銅綠假單胞菌免受某些菌毛特異性噬菌體侵染，改變菌毛蛋白序列可阻止吸附(圖1E)。

圖1 細(xì)菌抑制噬菌體吸附的機(jī)制示意圖A：噬菌體正常吸附于敏感菌表面受體； B：細(xì)菌釋放的外膜泡上的脂多糖結(jié)合噬菌體，阻斷噬菌體對(duì)菌體表面脂多糖受體吸附；C：細(xì)菌釋放的外膜泡上的外膜蛋白結(jié)合噬菌體，阻斷噬菌體對(duì)菌體表面相應(yīng)外膜蛋白受體吸附； D：細(xì)菌脂多糖受體結(jié)構(gòu)不完整阻斷噬菌體吸附； E：細(xì)菌改變菌毛蛋白，阻止噬菌體對(duì)菌毛受體吸附

2 切割噬菌體核酸

噬菌體抗性菌利用先天或獲得性防御系統(tǒng)切割噬菌體核酸，其中獲得性防御系統(tǒng)規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列-CRISPR-相關(guān)蛋白(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats-CRISPR-associated proteins，CRISPR-Cas)是近幾十年中最重要的科學(xué)進(jìn)展之一。這里介紹近幾年報(bào)道的先天性防御系統(tǒng)，其發(fā)現(xiàn)于75%的原核生物中[8]。

2.1 與限制修飾有關(guān)的防御島系統(tǒng) Ofir等[9]報(bào)道，在細(xì)菌和古生菌中廣泛的存在防御噬菌體系統(tǒng)-與限制修飾有關(guān)的防御島系統(tǒng) (Defence island system associated with restriction modification，DISARM)，該系統(tǒng)由5個(gè)基因組成，包括編碼甲基化酶的基因(drmMII)、解旋酶基因(drmA)、含有磷脂酶D(Phospholipase D，PLD)的基因(drmC)、含有解旋酶相關(guān)結(jié)構(gòu)域(DUF1998)的基因(drmB)和功能未知基因(drmE)；轉(zhuǎn)移有副水楊芽胞桿菌9945A株DISARM的枯草芽胞桿菌能抵御3株有尾雙鏈DNA噬菌體；其甲基化酶修飾CCWGG基序，作為自身DNA的標(biāo)記，而限制侵染的噬菌體DNA(封二圖2A)。

2.2 噬菌體排斥系統(tǒng) 2021年，Picton等[10]證明了費(fèi)格森埃希菌的多重耐藥質(zhì)粒具有多而強(qiáng)大的防御噬菌體功能：表達(dá)Ⅰ型細(xì)菌排斥(Bacteriophage exclusion，BREX)防御系統(tǒng)、GmrSD家族的IV型DNA修飾依賴限制酶BrxU；BREX的效應(yīng)物能識(shí)別噬菌體的非甲基化非回文BREX基序GCTAAT，防止噬菌體增殖，BrxU可切割經(jīng)胞嘧啶修飾的DNAs，PglX使宿主DNA的GCTAAT序列在第5位被甲基化而獲得保護(hù)(封二圖2B)。

2.3 SspABCD-SspE及SspABCD-SspFGH硫代磷酸酯限制修飾系統(tǒng) 2020年，Xiong等[11]描述了在環(huán)磷弧菌、大腸埃希菌和Streptomycesyokosukanensis中存在的SspABCD-SspE硫代磷酸酯(Phosphorothioates，PTs)系統(tǒng)，它具有獨(dú)特的遺傳結(jié)構(gòu)、生化功能和表型；本系統(tǒng)中SspB為切口酶(Nickase)，可引入缺口以促進(jìn)硫的摻入；系統(tǒng)中的SspABCD與SspE聯(lián)合抵抗噬菌體：(1)SspE借助PTs激發(fā)的核苷三磷酸水解酶(Nucleoside triphosphate hydrolase，NTPase)活性感知序列特異性PTs發(fā)揮抗噬菌體活性；(2)SspE通過(guò)引入切口損傷削弱噬菌體DNA復(fù)制而抑制噬菌體增殖。2021年，Wang等[12]鑒定了SspABCD-SspFGH防御系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)SspFGH可破壞非PTs修飾的DNA，抑制噬菌體DNA復(fù)制，雖與SspABCD-SspE不同，但二者共存于36個(gè)細(xì)菌基因組中，共同保護(hù)細(xì)菌防御噬菌體(封二圖2C)。

2.4 Ago的DNA干擾作用 細(xì)菌和古細(xì)菌中的Argonaute核酸酶(Ago)通過(guò)小DNA引導(dǎo)切割DNA的過(guò)程稱為DNA干擾。Kuzmenko等[13]分析了丁酸梭菌Ago(CbAgo)的體內(nèi)活性，表明CbAgo靶向多拷貝遺傳元件，抑制質(zhì)粒傳播和噬菌體感染；CbAgo在同源序列間誘導(dǎo)DNA干擾，觸發(fā)目標(biāo)DNA降解，與位點(diǎn)特異性小DNA向?qū)У募虞d依賴于其固有的核酸內(nèi)切酶活性和細(xì)胞雙鏈斷裂修復(fù)機(jī)制；Ago含有氨基端(Amino-terminal，N)、PAZ(PIWI Argonaute Zwille)、MID(Middle)、PIWI(含有RNase-H樣活性位點(diǎn))結(jié)構(gòu)域及L1、L2連接蛋白(封二圖2D)。

3 抑制噬菌體核酸合成

Yasui等[14]描述了含有abpA和abpB基因質(zhì)粒的大腸埃希菌可阻止T4、T2、T7和λ家族噬菌體復(fù)制，與野生株相比，缺失其一都會(huì)導(dǎo)致噬菌體后代增加20%；作者分離到7株T4噬菌體的抑制突變株，它們?cè)谶^(guò)表達(dá)abpA和abpB的細(xì)菌中繁殖能力微弱，突變均位于編碼對(duì)DNA復(fù)制起重要作用的DNA解旋酶基因41中；作者還證明abpA和abpB抑制T4噬菌體的DNA復(fù)制和晚期基因表達(dá)，也能抑制T7和λ噬菌體的DNA復(fù)制。

Viperin作為動(dòng)物的一種干擾素誘導(dǎo)蛋白，可催化RNA聚合酶終止劑3′-脫氧-3′,4′-雙脫氫-三磷酸胞苷(ddhCTP)產(chǎn)生而抑制多種病毒復(fù)制。Bernheim等[15]研究表明，與Viperin相似，原核生物的Viperins會(huì)促進(jìn)ddhCTP、雙脫氫-三磷酸鳥(niǎo)苷(ddhGTP)和雙脫氫-三磷酸尿苷(ddhUTP)產(chǎn)生，抑制T7噬菌體轉(zhuǎn)錄。

4 流產(chǎn)感染

流產(chǎn)感染(Abortive infection，Abi)，即感染噬菌體的細(xì)菌在噬菌體復(fù)制周期完成前通過(guò)“利他性”自殺阻止噬菌體傳播，從而保護(hù)周圍的細(xì)菌[16]。

4.1 激活宿主菌自體磷酸化致流產(chǎn)感染 Depardieu等[17]發(fā)現(xiàn)，葡萄球菌中存在一種激酶介導(dǎo)的Abi機(jī)制，噬菌體感染時(shí)，其蛋白PacK觸發(fā)葡萄球菌的真核生物樣絲氨酸/蘇氨酸激酶Stk2自體磷酸化，導(dǎo)致翻譯、轉(zhuǎn)錄控制、細(xì)胞周期控制和應(yīng)激反應(yīng)等過(guò)程被抑制，使細(xì)菌死亡，防止噬菌體感染其他細(xì)菌(封二圖3A)。

4.2 逆轉(zhuǎn)錄子致流產(chǎn)感染 Millman等[18]報(bào)道細(xì)菌的逆轉(zhuǎn)錄子Retrons 通過(guò)流產(chǎn)感染發(fā)揮廣泛的防御噬菌體作用，此防御單元由三部分組成：逆轉(zhuǎn)錄酶(Reverse transcriptase，RT)、非編碼RNA(Non-coding RNA，ncRNA)和效應(yīng)蛋白；作者證明了Ec48(大腸埃希菌的Retron)可“守護(hù)”細(xì)菌的RecBCD復(fù)合物(降解噬菌體線性DNA及幫助細(xì)菌獲得CRISPR的新間隔序列)，噬菌體蛋白抑制RecBCD但激活Ec48，導(dǎo)致感染失敗、細(xì)菌停止生長(zhǎng)(封二圖3B)，形成了保衛(wèi)周圍細(xì)菌的防線。

4.3 激活環(huán)寡核苷酸為基礎(chǔ)的抗噬菌體信號(hào)系統(tǒng)致流產(chǎn)感染 一些細(xì)菌中存在環(huán)寡核苷酸為基礎(chǔ)的抗噬菌體信號(hào)(Cyclic oligonucleotide-based anti-phage signaling，CBAS)系統(tǒng)，此系統(tǒng)包括寡核苷酸環(huán)化酶(Oligonucleotide cyclase,cGAS)、信號(hào)分子、殺傷細(xì)菌的效應(yīng)物和輔助基因。

Cohen等[19]研究表明，細(xì)菌的環(huán)GMP-AMP(Cyclic GMP-AMP，cGAMP)信號(hào)系統(tǒng)可感應(yīng)噬菌體的感染，產(chǎn)生cGAMP，進(jìn)而激活磷脂酶(Phospholipase)，導(dǎo)致細(xì)胞膜完整性喪失。

Lau等[20]研究表明，細(xì)菌CBAS系統(tǒng)的效應(yīng)物NucC與限制性核酸內(nèi)切酶(Endonuclease)有關(guān)，NucC可獨(dú)特地組裝成同源三聚體，此三聚體與環(huán)三腺苷酸第二信使結(jié)合，促進(jìn)NucC同源六聚體組裝，從而有助于非特異性雙鏈DNA斷裂；在感染菌中，NucC的激活使細(xì)菌染色體完全破壞，導(dǎo)致細(xì)菌在噬菌體復(fù)制完成前死亡。

Ka等[21]報(bào)道，Thoeris防御結(jié)構(gòu)由ThsA和ThsB組成；ThsA具有強(qiáng)大的NAD+降解活性，含有Sirtuin樣和SLOG樣雙結(jié)構(gòu)域；突變分析表明，NAD+降解與Thoeris抗噬菌體有關(guān)；ThsB的結(jié)構(gòu)與Toll/IL-1受體(Toll/interleukin-1 receptor，TIR)結(jié)構(gòu)域相似。2021年，Ofir等[22]研究表明，噬菌體感染觸發(fā)TIR結(jié)構(gòu)域產(chǎn)生環(huán)ADP-核糖異構(gòu)體，激活 ThsA，耗盡細(xì)胞的NAD+，導(dǎo)致流產(chǎn)感染及細(xì)胞死亡。

2021年，Millman等[23]根據(jù)操縱子結(jié)構(gòu)、信號(hào)分子和效應(yīng)物對(duì)CBAS系統(tǒng)進(jìn)行分類，確定了4種主要類型；效應(yīng)物包括磷脂酶、跨膜螺旋(Transmembrane helices)、內(nèi)切核酸酶、TIR結(jié)構(gòu)域、磷酸化酶/ 核苷酶超家族(Phosphorylase/nucleosidase superfamily)、肽酶(Peptidase)，分別通過(guò)降解細(xì)胞膜的磷脂、使細(xì)胞膜上成孔、降解DNA等方式使細(xì)菌自殺(封二圖3C)。

5 干擾噬菌體裝配

噬菌體可誘導(dǎo)染色體島(Phage inducible chromosomal island，PICI)是整合于細(xì)菌染色體上的基因簇，可通過(guò)限制噬菌體增殖和攜帶重要毒力基因，為宿主菌提供適應(yīng)優(yōu)勢(shì)[24]。在革蘭陽(yáng)性菌中，PICI的表達(dá)被轉(zhuǎn)錄抑制物抑制，而輔助噬菌體可產(chǎn)生一種抗阻遏物，導(dǎo)致從宿主染色體上切下PICI，PICI基因簇復(fù)制，并表達(dá)出可抑制輔助噬菌體晚期基因表達(dá)的蛋白，改變噬菌體衣殼大小，使PICI基因簇優(yōu)先被包裝，防止形成輔助噬菌體病毒子[25]。

霍亂弧菌具有可移動(dòng)的PICI樣元件 (Phage inducible chromosomal island-like element，PLE)，在噬菌體ICP1感染期間通過(guò)從染色體上被切割而啟動(dòng)宿主抗噬菌體反應(yīng)，保護(hù)霍亂弧菌免受ICP1感染，此過(guò)程依賴于PLE編碼的Int[26]。McKitterick等[27]報(bào)道PICI樣元件中的PLE1編碼大絲氨酸重組酶，產(chǎn)物Int為重組方向性因子(Recombination directionality factor，RDF)，是針對(duì)ICP1的特異蛋白，在噬菌體感染時(shí)切下PLE。

6 展望

在細(xì)菌與噬菌體的長(zhǎng)期軍備競(jìng)賽中，雙方均獲得相應(yīng)的動(dòng)力而共同進(jìn)化，這其中也包括前噬菌體為保護(hù)宿主免受異型病毒攻擊的貢獻(xiàn)[28-29]，使得他們相互拮抗[30]，保持自身種群穩(wěn)定。噬菌體抗性的進(jìn)化對(duì)噬菌體的應(yīng)用效果構(gòu)成了不可避免的威脅，在應(yīng)用噬菌體療法過(guò)程中，需充分了解其使用范圍及作用[1]，考慮噬菌體與藥物或噬菌體等的組合，以避免耐多噬菌體菌株的出現(xiàn)及蔓延。另一方面，對(duì)細(xì)菌防御噬菌體機(jī)制的深入研究可使人們充分了解抗噬菌體菌株特性，利于工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中定向篩選更具優(yōu)勢(shì)的商品化菌株；同時(shí)為生物技術(shù)領(lǐng)域開(kāi)發(fā)更多的可應(yīng)用工具；也希望為進(jìn)一步挖掘真核生物抗病毒的機(jī)制提供啟示。