張榮武

(山東省德州市陵城區(qū)畜牧獸醫(yī)服務(wù)中心 ， 山東 德州 253000)

仔豬腹瀉性疾病是豬養(yǎng)殖業(yè)常見的疾病，該病是導(dǎo)致仔豬大量死亡的主要原因之一，臨床中引起仔豬腹瀉的病毒性疾病主要有豬流行性腹瀉(PED)、豬傳染性胃腸炎(TGE)、豬輪狀病毒病(PoR)等，其中PED具有導(dǎo)致仔豬死亡率高、病情傳播快速、群發(fā)性強(qiáng)、難以控制的特點(diǎn)，是引起仔豬腹瀉死亡的主要病毒性疾病[1-2]。PED是由豬流行性腹瀉病毒(PEDV)引起不同階段豬發(fā)病的一種急性傳染性疾病，該病以嘔吐、水樣腹瀉、脫水等為主要臨床特征，也稱為“冬季拉稀病”，其中以哺乳豬發(fā)病率最高，死亡率高達(dá)100%，在我國豬場中廣泛流行，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[3-5]。

PEDV為單股正鏈RNA病毒，屬于套式病毒目冠狀病毒科冠狀病毒屬成員，該病毒基因組長28 kb，基因組中編碼7個開放閱讀框(Open reading frame,ORF)蛋白，主要包括5個結(jié)構(gòu)蛋白和2個非結(jié)構(gòu)蛋白,其中ORF3基因編碼的ORF3蛋白位于S蛋白和E蛋白之間[6]。研究表明，ORF3 蛋白的缺失可以導(dǎo)致PEDV毒力降低或者弱化，但不影響病毒在體內(nèi)的增殖與復(fù)制[7-8]。因此，對PEDVORF3 基因進(jìn)行序列分析，可以間接分析該病毒株毒力的強(qiáng)弱，在臨床中具有重要的意義。

2020年11月，本試驗(yàn)在德州地區(qū)養(yǎng)殖場中采集患腹瀉仔豬的小腸組織內(nèi)容物樣品12份，進(jìn)行PEDV分離鑒定，并對分離的PEDVORF3基因進(jìn)行核苷酸序列分析，為PEDV的進(jìn)一步防控及疫苗研發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 病料來源 2020年11月，在德州地區(qū)養(yǎng)殖場中采集患腹瀉仔豬的小腸組織內(nèi)容物樣品12份。

1.2 主要試劑 Vero傳代細(xì)胞系，由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院傳染病實(shí)驗(yàn)室提供；抗PEDV S 蛋白單克隆抗體(mAb)，購自北京華研世佳質(zhì)檢科技有限公司；FITC標(biāo)記山羊抗鼠抗體，購自北京百奧萊博科技有限公司；DL2 000 Marker、ExTaqDNA聚合酶、病毒RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、膠回收試劑盒，均購自大連TaKaRa公司；pMD-18T載體、細(xì)胞培養(yǎng)板、胎牛血清(FBS)、DMEM培養(yǎng)基、雙抗，均購自美國Gibco公司。

1.3 病毒性疾病的PCR檢測 參照參考文獻(xiàn)[9-12]報道的方法，提取采集的病料組織的基因組，采用PCR/RT-PCR 方法對豬瘟病毒、豬偽狂犬病毒、豬Delta冠狀病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬輪狀病毒等病原進(jìn)行檢測。

1.4 病毒的分離培養(yǎng)和形態(tài)學(xué)觀察 將PEDV檢測陽性的組織加入適量的無菌PBS勻漿，-80 ℃反復(fù)凍融3～5次，12 000 r/min離心10 min，取上清過濾除菌，加入雙抗處理，取病料組織上清液100 μL接種到Vero細(xì)胞中，作為感染組，同時設(shè)不攻毒的對照組，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日觀察細(xì)胞狀態(tài)。盲傳至4～5代，接毒Vero細(xì)胞出現(xiàn)85%的細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)后收毒，-80 ℃低溫冰箱保存?zhèn)溆?。取出現(xiàn)CPE的Vero細(xì)胞進(jìn)行收毒，離心取上清，用20 g/L的磷鎢酸負(fù)染后，將樣品送山東農(nóng)業(yè)大學(xué)電鏡室，通過電鏡觀察病毒形態(tài)。

1.5 病毒的半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)測定 參照參考文獻(xiàn)[9]報道的方法，將分離的PEDV株第5代(F5)病毒用DMEM培養(yǎng)液做10倍倍比稀釋培養(yǎng)，按Reed-Muench法計(jì)算TCID50。

1.6 病毒的RT-PCR鑒定 用病毒RNA提取試劑盒提取Vero細(xì)胞培養(yǎng)物基因組RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDAN進(jìn)行PCR鑒定，用PEDVM基因特異性引物(F:5′-CCTTACCCTAGACTTCAAGA-3′，R:5′-AAACCAGGGAAAAAAAGTACGA-3′)擴(kuò)增，目的片段大小為370 bp?；厥漳康幕蚱危B接到pMD-18T載體上，提取質(zhì)粒進(jìn)行測序。

1.7 病毒的間接免疫熒光(IFA)鑒定 參照參考文獻(xiàn)[13-14]報道的方法，將PCR檢測PEDV為陽性的F5細(xì)胞培養(yǎng)物上清液接種于新鮮培養(yǎng)的Vero細(xì)胞，作為感染組，同時設(shè)立對照組，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后進(jìn)行IFA檢測，于倒置熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.8 病毒的ORF3基因擴(kuò)增與序列分析 參照參考文獻(xiàn)[9]，根據(jù)GenBank(登錄號：AF353511)中PEDV基因序列，設(shè)計(jì)ORF3基因引物(F:5′-CCTAGACTTCAACCTTACGA-3′，R:5′-CCAGGAAAAAAG-AGTACGAAAA-3′)，擴(kuò)增目的片段大小為774 bp。對PEDV分離株的ORF3基因進(jìn)行PCR鑒定，回收目的基因片段，連接到pMD-18T載體上，提取質(zhì)粒進(jìn)行測序。PEDV分離株的測序結(jié)果與GenBank中登錄的PEDV參考株ORF3基因序列進(jìn)行同源比對，利用 DNASTAR 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹，分析遺傳變異特點(diǎn)。

2 結(jié)果

2.1 病毒性疾病的PCR檢測 豬瘟病毒、豬偽狂犬病毒、豬Delta冠狀病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬輪狀病毒的PCR檢測結(jié)果均為陰性，豬流行性腹瀉病毒的RT-PCR檢測結(jié)果為陽性。

2.2 病毒的分離培養(yǎng)和形態(tài)學(xué)觀察 將PEDV檢測陽性樣品處理后，接種于Vero細(xì)胞進(jìn)行病毒分離培養(yǎng)，感染組的Vero細(xì)胞在盲傳第5代(F5)時出現(xiàn)CPE，Vero細(xì)胞出現(xiàn)了萎縮、聚堆、脫落，個別的細(xì)胞出現(xiàn)腫脹、變形等(圖1A)，對照組的Vero細(xì)胞未見明顯的病變(圖1B)。將分離的PEDV病毒株命名為德州株(JIAOZUO101)。在電子顯微鏡下可見，德州株(JIAOZUO101)是直徑大約為100 nm的病毒粒子，具有明顯的囊膜和纖突，呈典型的冠狀病毒粒子形態(tài)(圖2)，與劉暢等[10]報道的PEDV形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)基本一致。經(jīng)測定德州株(JIAOZUO101)傳至第5代時病毒滴度為104.6TCID50/mL。

圖1 德州株(JIAOZUO101) F5的Vero細(xì)胞病變(40×)Fig.1 Vero cell lesion of Dezhou strain (JIAOZUO101) F5 (40×)A:感染組; B：對照組 A:Infected group; B:Control group

圖2 德州株(JIAOZUO101)病毒粒子形態(tài)Fig.2 Morphology of virus particles of Dezhou strain (JIAOZUO101)

2.3 病毒的RT-PCR鑒定 RT-PCR鑒定結(jié)果如圖3所示，德州株(JIAOZUO101)的細(xì)胞培養(yǎng)物擴(kuò)增出大小約370 bp的目的條帶，與預(yù)期大小相符。PEDV分離株測序結(jié)果與GenBank中登錄的PEDV參考株同源性介于97.0%～99.9%。結(jié)果表明，經(jīng)RT-PCR鑒定德州株(JIAOZUO101)為PEDV。

圖3 德州株(JIAOZUO101)RT-PCR鑒定結(jié)果Fig.3 RT-PCR identification results of Dezhou strain (JIAOZUO101)M:DL2 000 DNA 相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 1～2:細(xì)胞培養(yǎng)物； 3:空白對照M:DL2 000 DNA Marker; 1-2:Cell culture; 3:Blank control

2.4 病毒的IFA鑒定 結(jié)果如圖4所示，感染組的Vero細(xì)胞呈現(xiàn)特異性綠色熒光，對照組未見有特異性綠色熒光。

圖4 德州株(JIAOZUO101)IFA檢測結(jié)果(100×)Fig.4 IFA test results of Dezhou strain (JIAOZUO101) (100×)A:感染組； B：對照組A:Infected group; B:Control group

2.5 病毒的ORF3基因擴(kuò)增與序列分析 用RT-PCR方法對PEDV德州株(JIAOZUO101)的ORF3基因進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果如圖5所示，德州株(JIAOZUO101)擴(kuò)增出大小約為774 bp的目的條帶，與預(yù)期大小相符。德州株(JIAOZUO101)的ORF3基因測序結(jié)果與GenBank中登錄的20株P(guān)EDV參考株ORF3基因的核苷酸序列的同源性介于 97.6%～99.9%。利用 DNASTAR軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹，并分析德州株(JIAOZUO101)ORF3基因遺傳變異特點(diǎn)。結(jié)果如圖6所示，德州株(JIAOZUO101)與Jiangxi 2017株、Henan 2015株位于同一支，遺傳距離較近，其同源性介于99.3%～99.9%，與其他18株參考株的遺傳距離較遠(yuǎn)。德州株(JIAOZUO101)的ORF3基因序列中只是個別堿基發(fā)生變化，編碼的氨基酸未發(fā)生缺失，未發(fā)生明顯變異。

圖5 德州株(JIAOZUO101)的ORF 3基因檢測結(jié)果Fig.5 ORF 3 gene detection results of Dezhou strain (JIAOZUO101)M:DL2 000 DNA 相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 1～2:細(xì)胞培養(yǎng)物； 3:空白對照；M:DL2 000 DNA Marker; 1-2:Cell culture; 3:Blank control

圖6 德州株(JIAOZUO101)的ORF 3基因系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.6 Phylogenetic tree of ORF 3 gene of Dezhou strain (JIAOZUO101)▲:本試驗(yàn)分離毒株 ▲:Strain isolated in this study

3 討論

PED是引起仔豬腹瀉病的主要病毒性疾病之一，豬是PEDV的唯一宿主，該病對仔豬極易感，且具有發(fā)病急、傳播快、死亡率高的特點(diǎn)，對豬具有很大的威脅[15]。國內(nèi)外相關(guān)研究表明，PEDV在世界各地區(qū)廣泛分布流行，在我國的多個省區(qū)也廣泛流行[16-18]。PEDV侵害的部位主要在腸道，通過膜融合侵入細(xì)胞，在小腸絨毛上皮細(xì)胞中增殖與復(fù)制，引起腸道病變，同時通過糞便和分泌物排出體外，感染其他動物，仔豬的發(fā)病日齡越小，其死亡率越高[9-11]。因此，加強(qiáng)PED流行病學(xué)監(jiān)測，對減少該病的發(fā)生與流行具有重要意義。本試驗(yàn)從患腹瀉仔豬的小腸組織內(nèi)容物樣品中分離得到1株P(guān)EDV，命名為德州株(JIAOZUO101)。對該毒株的ORF3基因擴(kuò)增并分析其遺傳變異情況，結(jié)果顯示，PEDV德州株(JIAOZUO101)的ORF3基因序列與Jiangxi 2017株、Henan 2015株同源性較近，且未發(fā)生變異情況。臨床中PED的預(yù)防主要通過疫苗免疫，近幾年，PEDV已經(jīng)出現(xiàn)變異情況，導(dǎo)致其疫苗不能有效地保護(hù)豬群免受感染，分析PEDV是否變異，在臨床為該病的流行病學(xué)及綜合防控具有重要的意義[4-6]。因此，在臨床中應(yīng)該注重綜合防控，定期免疫和消毒凈化，才能有效控制PED的發(fā)生與流行。本試驗(yàn)為進(jìn)一步的PED防控及疫苗研發(fā)提供理論參考。