于 躍 ， 馬天文 ， 趙明超 ， 呂良鈺 ， 賈麗娜 ，宋霄鵬 ， 徐新宇 ， 白 薈 ， 王鑫宇 ， 高 利

(1. 東北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院 ， 黑龍江 哈爾濱 150030 ； 2.黑龍江省普通高等學校動物普通疾病防治重點實驗室 ， 黑龍江 哈爾濱 150030)

骨關節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)是一種退行性關節(jié)疾病[1]?；疾游锍０榘l(fā)不同程度的疼痛反應，同時也造成巨大的經(jīng)濟損失。在動物臨床上，犬、馬和奶?；糘A較為常見[2]，其微觀特征是由于細胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)的合成代謝平衡紊亂，導致關節(jié)軟骨被破壞，關節(jié)發(fā)生重塑[3]，疼痛反應是OA的標志性癥狀。臨床上使用的藥物大多是對癥治療，如非甾體抗炎藥(Non-steroidal antiinflammatory drugs,NSAIDs)緩解疼痛，但NSAIDs的副作用是不可估量的。OA的發(fā)病是多因素引起的，由關節(jié)不穩(wěn)誘發(fā)的OA在動物發(fā)病中較為常見。

誘導型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase，iNOS)是一種可溶性酶，以二聚體形式存在，iNOS催化產(chǎn)生過量的一氧化氮(Nitric oxide，NO)會對細胞產(chǎn)生毒性作用[4]。在OA中，NO介導炎癥因子的表達，抑制膠原和聚蛋白多糖的合成，誘導軟骨細胞凋亡和疼痛[5]。Ⅱ型膠原是維持關節(jié)軟骨拉伸特性、保持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定所必需的部分[6-7]。通過裂解II型膠原分子的三螺旋結(jié)構(gòu)來啟動纖維性膠原變性，初級切割發(fā)生在三螺旋內(nèi)部，產(chǎn)生特異性片段。Ⅱ型膠原3/4片段裂解后羧基末端暴露出的新表位(C2C)[8]和1/4片段的羧基端端肽(CTX-Ⅱ)[9]，都是Ⅱ型膠原裂解后產(chǎn)生的重要的OA標志物[10]。

為了探究在大鼠OA模型中，關節(jié)疼痛反應及iNOS、C2C和CTX-Ⅱ指標的變化情況，為OA的早期診斷和監(jiān)控病情提供理論依據(jù)。本試驗通過前十字韌帶切斷聯(lián)合部分半月板切除手術(Anterior cruciate ligament cut combined with partial meniscus resection，ACLT+PMMx)進行大鼠OA造模，觀察造模30 d內(nèi)大鼠關節(jié)腫脹程度和疼痛行為學改變，Pelletier評分評估關節(jié)損傷程度，ELISA法檢測大鼠血清中iNOS、C2C和CTX-Ⅱ的變化趨勢。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 異氟烷、丙酮，均購自北京友誠盛達生物科技有限公司；大鼠iNOS、C2C、CTX-Ⅱ ELISA試劑盒，均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。手術器械，購自上海醫(yī)療器械有限公司手術器械廠；手術縫線，購自上海浦東金環(huán)醫(yī)療用品股份有限公司；Epoch酶標儀，購自美國BioTek公司；超低溫冰箱，購自青島海爾特種電器有限公司。

1.2 實驗動物 40只SD大鼠，雄性，11～12周齡，平均體重220 g，購自長春市億斯實驗動物技術有限責任公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK(吉)-2018-0007。本試驗所有動物福利和試驗設計均獲得東北農(nóng)業(yè)大學動物倫理委員會批準。大鼠在溫度20～24 ℃，濕度65%的環(huán)境下，進行7 d適應性飼養(yǎng)，期間隨意采食，籠內(nèi)自由活動。

1.3 OA模型的建立 大鼠隨機分為對照組(n=20)和模型組(n=20)，參照參考文獻[11]方法進行造模。試驗前大鼠禁食12 h，維持良好的機體狀態(tài)。模型組大鼠建立異氟烷吸入麻醉通路，仰臥保定，剔除右下肢膝關節(jié)周圍被毛，酒精、碘伏消毒，創(chuàng)巾隔離手術部位。大鼠右膝內(nèi)側(cè)副韌帶前做2～4 cm的切口，打開關節(jié)囊，移位髕骨，暴露脛骨面和股骨髁，修整附近肌肉。切斷前十字韌帶，抽屜試驗判斷是否完全切斷。再次髕骨移位后，以前十字韌帶脛骨起點為圓點外旋45°切除內(nèi)側(cè)半月板的1/3。生理鹽水沖洗關節(jié)腔，歸位髕骨，可吸收縫線常規(guī)縫合，術后給予適量抗生素。對照組進行假手術，只打開關節(jié)腔但不切斷半月板和任何韌帶。

1.4 行為學檢測 OA造模后第0、7、14、21天和第28天進行行為學檢測，評價膝關節(jié)疼痛情況，持續(xù)5周。

1.4.1 膝關節(jié)腫脹檢測 根據(jù)Nirmal等[12]的方法進行膝關節(jié)腫脹檢測。固定大鼠后，伸直右膝關節(jié)，用電子數(shù)顯游標卡尺測定模型組大鼠手術側(cè)(右側(cè))和對側(cè)(左側(cè))膝關節(jié)的直徑，每次測量由同一人完成。計算膝關節(jié)直徑差值進行統(tǒng)計，膝關節(jié)直徑差值/mm = 手術側(cè)膝關節(jié)直徑-對側(cè)膝關節(jié)直徑。

1.4.2 伸膝發(fā)聲檢測 根據(jù)Im等[13]的方法進行伸膝發(fā)聲檢測，通過大鼠發(fā)聲次數(shù)反映膝關節(jié)疼痛情況。從靜止姿勢、膝略微彎曲開始測試。首先保定大鼠，伸展膝關節(jié)，保證膝關節(jié)完全伸展，將膝蓋夾在大拇指和食指之間，在內(nèi)側(cè)方向?qū)οリP節(jié)擠壓，上下左右伸膝。大鼠發(fā)聲記“X”，不發(fā)聲記“O”，每次間隔5 min，共計5次，記錄發(fā)聲次數(shù)。

1.4.3 冷敏感性檢測 根據(jù)Katri等[14]的方法進行冷敏感性檢測，將大鼠放置在鐵絲網(wǎng)上靜置15 min，待安靜后開始測試。使用丙酮從鐵絲網(wǎng)底部涂抹大鼠右后爪評估冷敏感性，觀察丙酮作用20 s內(nèi)的行為學變化，并進行評分。評分標準：0=無反應；1=快速撤回，甩動腳掌(總反應時間<1 s)；2=長時間撤回或重復甩動(總反應時間1～3 s)；3=重復拍打，舔爪腹側(cè)(總反應時間3～10 s)；4=長時間舔爪(總反應時間>10 s)。每爪進行3次測試，2次測試至少間隔10 min，記錄3次評分，3次評分之和最高12分。

1.5 樣品采集與處理 OA造模后第0、10、20天和第30天各組選取5只大鼠收集關節(jié)樣本和血清。通過尾靜脈采血法取血，置于無菌EP管中，室溫下1 000 g離心20 min，收集血清，-80 ℃保存待用。之后將大鼠安樂死，解剖右膝關節(jié)并分離股骨和脛骨周圍軟組織，對股骨和脛骨面進行眼觀觀察和Pelletier評分，并對脛骨進行病理學觀察。

1.6 形態(tài)學觀察與Pelletier評分 使用Nikon單反相機對脛骨和股骨面進行拍照，并進行Pelletier評分[15]。Pelletier評分標準：0=關節(jié)表面正常；1=關節(jié)表面輕微損傷和變色；2=侵蝕至關節(jié)淺層或中層；3=侵蝕至深層；4=侵蝕至軟骨下骨。

1.7 組織病理學檢查 10%福爾馬林緩沖液固定大鼠股骨、脛骨72 h，10%EDTA溶液脫鈣3周，包埋并切成5 μm厚的切片。進行甲苯胺藍染色，顯微鏡下拍攝脛骨甲苯胺藍染色圖像。

1.8 ELISA檢測iNOS、C2C和CTX-Ⅱ水平 采用ELISA方法測定各組大鼠血清iNOS、C2C和CTX-Ⅱ水平，嚴格按照試劑盒說明書進行。使用ELISA Calc軟件繪制iNOS、C2C和CTX-Ⅱ標準線性回歸曲線，將OD值納入方程，計算各樣品的濃度。

1.9 統(tǒng)計學處理 使用GraphPad Prism 8軟件進行統(tǒng)計分析，各組數(shù)據(jù)表示為平均數(shù)±標準差(Mean±SD)，組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 行為學檢測

2.1.1 膝關節(jié)腫脹檢測 如圖1所示，與對照組相比，第7、14、21天和第28天模型組大鼠膝關節(jié)直徑差均保持增加趨勢，并呈極顯著增加(P<0.01)。結(jié)果表明，OA模型中大鼠關節(jié)腫脹顯著增加，并呈時間依賴性。

圖1 膝關節(jié)腫脹程度變化Fig.1 Changes in the degree of swelling of knee joint與對照組比較，*：P<0.05，**：P<0.01；下同Compared with the control group,*：P<0.05，**：P<0.01.The same as below

2.1.2 伸膝發(fā)聲檢測 如圖2所示，伸膝發(fā)聲行為學檢測顯示，與對照組相比，OA造模后第7、14天和第21天發(fā)聲次數(shù)極顯著增加(P<0.01)；造模后第28天發(fā)聲次數(shù)與第21天相比呈下降趨勢，但與對照組相比仍顯著增加(P<0.05)。造模后發(fā)聲次數(shù)總體呈升高趨勢，說明大鼠疼痛反應敏感，OA伴發(fā)疼痛反應。

圖2 伸膝發(fā)聲次數(shù)變化Fig.2 Changes in the number of vocalizations at knee extension

2.1.3 冷敏感性檢測 如圖3所示，與對照組比較，大鼠OA模型第7、14、21天和第28天，冷敏感性評分極顯著升高(P<0.01)。

圖3 冷敏感性測試評分變化Fig.3 Changes in cold sensitivity test scores

2.2 形態(tài)學觀察及Pelletier評分 對大鼠膝關節(jié)脛骨和股骨面進行形態(tài)學觀察，結(jié)果顯示，對照組(第0天)脛骨和股骨軟骨表面光滑，顏色正常(圖4A和4E)；造模后第10天股骨內(nèi)側(cè)潰瘍程度逐漸增加(圖4B黑框)，脛骨表面輕微失去光澤，軟骨層變薄(圖4F箭頭)；造模后第20天股骨表面粗糙不平，潰瘍程度增加(圖4C黑框)，脛骨表面嚴重磨損甚至部分暴露軟骨下骨(圖4G黑框)；造模后第30天股骨表面呈深紅色，凹陷(圖4D黑框)，脛骨軟骨表面嚴重磨損甚至變形(圖4H箭頭)。如圖5所示，與對照組相比，大鼠OA造模30 d 內(nèi)Pelletier評分呈升高趨勢，且第20天和第30天時均極顯著升高(P<0.01)。

圖4 大鼠股骨和脛骨面形態(tài)學觀察Fig.4 Macroscopic observation of rat femur and tibial plateauA:對照組股骨; B:造模10 d模型組股骨；C:造模20 d模型組股骨; D:造模30 d模型組股骨; E:對照組脛骨; F:造模10 d模型組脛骨；G:造模20 d模型組脛骨; H:造模30 d模型組脛骨A:Femur of control group; B:Femur in model group after modeling for 10 d; C:Femur in model group after modeling for 20 d; D:Femur in model group after modeling for 30 d; E:Tibia of control group; F:Tibia in model group after modeling for 10 d; G:Tibia in model group after modeling for 20 d; H:Tibia in model group after modeling for 30 d

圖5 Pelletier評分Fig.5 Pelletier scoring

2.3 組織病理學觀察 結(jié)果顯示，對照組(第0天)軟骨表層光滑，染色均勻顏色較深(圖6A和6E);造模后第10天股骨軟骨淺層有裂縫(圖6B)，脛骨軟骨細胞排列不均勻，聚集在軟骨表層(圖6F);造模后第20天軟骨淺層破損、凹凸不平，裂縫至軟骨下層，染色較淺(圖6C和6G);造模后第30天軟骨表層染色不均，顏色變淺，軟骨細胞減少，潮線不完整，損傷嚴重(圖6D和6H)。

圖6 軟骨組織染色觀察(甲苯胺藍染色，100×)Fig.6 Observation of cartilage tissue by staining (Toluidine blue staining,100×)A:對照組股骨; B:造模10 d模型組股骨；C:造模20 d模型組股骨; D:造模30 d模型組股骨; E:對照組脛骨; F:造模10 d模型組脛骨；G:造模20 d模型組脛骨; H:造模30 d模型組脛骨A:Femur of control group; B:Femur in model group after modeling for 10 d; C:Femur in model group after modeling for 20 d; D:Femur in model group after modeling for 30 d; E:Tibia of control group; F:Tibia in model group after modeling for 10 d; G:Tibia in model group after modeling for 20 d; H:Tibia in model group after modeling for 30 d

2.4 血清中iNOS、C2C、CTX-Ⅱ濃度變化 與對照組相比，造模后第10天和第30天大鼠血清中iNOS濃度顯著升高(P<0.05)(圖7A)；模型組血清中C2C、CTX-Ⅱ濃度在建立模型后30 d內(nèi)呈升高趨勢，且在第30天濃度顯著升高(P<0.05)(圖7B和7C)。對照組在30 d內(nèi)血清iNOS、C2C、CTX-Ⅱ濃度無明顯變化。

圖7 大鼠血清中iNOS(A)、C2C(B)、CTX-Ⅱ(C)濃度Fig.7 Concentration of iNOS(A),C2C(B) and CTX-Ⅱ(C) in rat serum

3 討論

傳統(tǒng)上OA被認為是一種關節(jié)“磨損”疾病，隨著研究的不斷深入，OA現(xiàn)被認為是由炎癥和代謝因子作用的復雜過程[16]。慢性超負荷和關節(jié)生物力學受損使關節(jié)軟骨遭到破壞，關節(jié)內(nèi)發(fā)生炎癥反應。臨床上OA多以關節(jié)疼痛為主要表現(xiàn)，伴發(fā)關節(jié)僵硬、腫脹和活動性喪失，從而導致動物跛行和殘疾[17]。獸醫(yī)臨床針對OA的治療，通常采用非甾體類藥物[18]，這些藥物僅限于緩解疼痛，且副作用較大。

OA機制的研究需要相應病理模型的支持。近年來，ACLT+PMMx手術建立OA的方法廣泛應用于OA的研究[19]。ACLT屬于關節(jié)不穩(wěn)定性模型，產(chǎn)生異常關節(jié)生物力學。這種類型的模型誘導軟骨細胞產(chǎn)生生理變化，ECM被破壞，4周左右軟骨細胞發(fā)生退變，8～12周軟骨降解，并形成骨贅[20]。PMMx屬于負荷異常分布模型，是最常用的半月板損傷模型。PMMx模型在4周出現(xiàn)第1次異常，8周和12周時OA明顯進展[21]。Hamilton 等采用ACLT+PMMx造模方法研究OA不同時期的行為學變化[22]。Rudnik-Jansen 等采用ACLT+PMMx造模方法研究皮質(zhì)類固醇作用的最佳條件[23]。不同模型類型決定了OA的等級和程度，本研究采用的ACLT+PMMx聯(lián)合造?？s短了OA病程。由于關節(jié)穩(wěn)定性降低，導致關節(jié)間磨損加速，短時間內(nèi)產(chǎn)生疼痛反應。在造模前后每周進行疼痛行為學檢測發(fā)現(xiàn)，OA模型在造模后第1周即伴隨明顯的疼痛反應，并一直持續(xù)到試驗結(jié)束。選取第0、10、20天和第30天4個時間點收集血清和關節(jié)樣品進行關節(jié)損傷評估以及iNOS、C2C和CTX-Ⅱ指標檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在造模30 d內(nèi)脛骨和股骨軟骨損傷逐漸加重，OA程度逐漸增加，尤其在第20天后損傷程度明顯增加，提示創(chuàng)傷性OA模型建立成功。

研究表明，iNOS產(chǎn)生的NO與OA的發(fā)病機制密切相關，它通過調(diào)節(jié)ECM的穩(wěn)態(tài)和細胞因子的表達，導致氧化損傷和軟骨細胞凋亡，增強基質(zhì)金屬蛋白酶活性，下調(diào)聚集素和膠原的生物合成，導致軟骨損傷[24]。許多iNOS抑制劑有望開發(fā)成為新的OA緩解制劑。本研究OA主要炎癥介質(zhì)iNOS在造模后第10天和第30天血清中濃度都顯著升高，說明炎癥參與了OA病變過程，與以往的研究結(jié)果相吻合[25]。軟骨由軟骨細胞和ECM組成，Ⅱ型膠原是ECM重要的組成成分[26]。Ⅱ型膠原是關節(jié)軟骨抗張強度的核心組分，由于軟骨內(nèi)膠原的周轉(zhuǎn)速度非常慢[27]，因此主要由Ⅱ型膠原組成的纖維網(wǎng)損傷，是許多關節(jié)疾病中的不可逆病理改變。在OA中，關節(jié)軟骨的破壞將導致ECM降解，Ⅱ型膠原被降解成C2C和CTX-Ⅱ等標志物。分析關節(jié)損傷和恢復期間Ⅱ型膠原轉(zhuǎn)換的標志物有助于理解OA損傷的病變程度[28]。研究表明，血清中CTX-Ⅱ的水平能夠在OA無癥狀期間被檢測到[29]。在馬OA模型9周內(nèi)，C2C濃度隨OA病程增加而升高[30]。在犬OA模型第3周后，C2C和CTX-Ⅱ濃度顯著增加[31]。本試驗在造模后30 d內(nèi)，大鼠血清中C2C和CTX-Ⅱ的濃度呈升高趨勢，說明隨著OA病程的進展，Ⅱ型膠原被降解導致ECM退變，從而加速關節(jié)軟骨損傷。

綜上所述，本研究通過ACLT+PMMx手術建立大鼠OA模型，在建立模型30 d內(nèi)關節(jié)疼痛反應劇烈，關節(jié)損傷增加，血清中炎癥因子iNOS和Ⅱ型膠原降解產(chǎn)物C2C、CTX-Ⅱ分泌增加，為OA治療和監(jiān)測提供潛在的指標及理論依據(jù)。該模型可以有效模仿OA病理過程，為深入研究OA的發(fā)病機制、治療靶點、藥物評價等研究提供模型選擇。