矯賓賓，丁振山，黃 濤，徐 鑫，張 冠*

（1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院泌尿外科，北京 100020；2.中日友好醫(yī)院泌尿外科，北京 100029）

在我們前期研究中，基于腫瘤微環(huán)境中ROS（活性氧）響應(yīng)型納米載藥體系在膀胱癌的治療中取得了較好的療效[1]，為進(jìn)一步探究提升ROS 的水平是否造成腫瘤組織和正常組織中ROS 水平的差異，通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)我們發(fā)現(xiàn)ROS 的產(chǎn)生與基因NQO1（NAD（P）H quinone oxidoreductase 1）的表達(dá)密切相關(guān)[2～5]。在后期研究中，我們擬通過激活NQO1 提高膀胱癌組織中ROS 水平。NQO1 在膀胱癌中的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系、及其在膀胱癌中的生物學(xué)信息尚未闡明，本文就NQO1在膀胱癌中的詳細(xì)分子生物信息學(xué)特性展開研究，為后續(xù)進(jìn)一步利用其調(diào)控ROS 產(chǎn)生的能力設(shè)計制備級聯(lián)放大效應(yīng)的ROS 響應(yīng)性納米藥物在膀胱癌灌注化療中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)收集獲取

本研究從The Cancer Genome Atlas（TCGA）數(shù)據(jù)庫（https：//cancergenome.nih.ov/，2022-02-03）下載了433 個BLCA 樣本的mRNA 測序數(shù)據(jù)，其中19 個樣本是正常樣本。并同時下載了相關(guān)臨床數(shù)據(jù)。本研究的全過程都遵守了TCGA 數(shù)據(jù)庫的相關(guān)準(zhǔn)則和政策。

1.2 差異表達(dá)和富集分析

通過選取腫瘤組織與正常組織樣本做關(guān)于NQO1的差異表達(dá)，同時通過配對信息，做腫瘤組與正常組的配對差異分析。對比NQO1的表達(dá)差異。

根據(jù)NQO1 的表達(dá)情況，由高到低排列，選取NQO1 表達(dá)的中間值為截斷點，分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。對兩組進(jìn)行差異分析，通過得到的差異基因進(jìn)一步行富集分析。

1.3 相關(guān)分析

Cox 回歸模型log-rank 檢驗比較高、低表達(dá)組膀胱癌患者的總生存期（OS），通過預(yù)測網(wǎng)站對比無疾病進(jìn)展生存期（DFS）有無差異，并計算風(fēng)險比（hazard ratio，HR）。分析NQO1 與臨床相關(guān)信息（年齡、TNM、stage分期）的相關(guān)性等。

通過TIMER 軟件做NQO1與免疫細(xì)胞標(biāo)記物及免疫細(xì)胞的共表達(dá)分析，分析NQO1 在膀胱癌中與免疫浸潤的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用統(tǒng)計軟件R 語言（4.0.3 版本）進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。采用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線并通過Log-rank檢驗分析。

2 結(jié)果

2.1 NQO1基因在正常膀胱及膀胱癌組織中的表達(dá)

通過TCGA 膀胱癌mRNA 的數(shù)據(jù)，我們共得到433個樣本信息。其中腫瘤樣本424個，正常組織樣本19個。通過樣本名稱匹配，我們得到的19個正常樣本為腫瘤樣本中腫瘤的癌旁正常組織，可以行配對差異分析。NQO1 基因在膀胱癌組織中的表達(dá)與對應(yīng)的正常膀胱組織比較，NQO1 基因在膀胱癌組織中的表達(dá)顯著降低，無論是配對對比還是腫瘤樣本與正常組織樣本對比，均差異有統(tǒng)計學(xué)意義，即NQO1 在腫瘤組織樣本中存在過表達(dá)現(xiàn)象。（圖1）。

圖1 A.腫瘤樣本與正常組織對比；B.配對樣本腫瘤組與癌旁正常組織的對比

2.2 差異分析和功能富集結(jié)果

以NQO1的表達(dá)量分為高低表達(dá)，2組進(jìn)一步做差異分析和功能富集，NQO1 編碼蛋白主要定位于細(xì)胞核，分子生物學(xué)功能主要為酶和蛋白結(jié)合，生物學(xué)過程主要為信號調(diào)控。而相關(guān)信號通路主要富集于癌癥相關(guān)信號通路如細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用信號通路等。如圖2所示。

圖2 以NQO1表達(dá)量分為高低2組后，差異基因的功能富集分析

2.3 NQO1的表達(dá)與臨床信息的相關(guān)性分析

我們分別就與年齡、TNM、分期做了進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)NQO1與上述無明顯統(tǒng)計學(xué)相關(guān)。如圖3所示。

圖3 NQO1的表達(dá)與臨床信息的相關(guān)性

在與預(yù)后相關(guān)性的研究中，我們基于TCGA發(fā)現(xiàn)其表達(dá)與總體生存期無明顯相關(guān)性。通過網(wǎng)站分析工具（http：//gepia2.cancer-pku.cn/#index）結(jié)合TCGA 及GTX 數(shù)據(jù)庫，在疾病無進(jìn)展生存期方面，NQO1 與預(yù)后有明顯相關(guān)性，并對相關(guān)臨床因素做了獨立風(fēng)險因素分析，NQO1 非影響膀胱癌總體生存期的獨立風(fēng)險因素。需要額外說明的是，因為此網(wǎng)站分析工具是基于TCGA 及GTX 數(shù)據(jù)庫，所以部分?jǐn)?shù)據(jù)可能與TCGA 實時數(shù)據(jù)庫的信息有少許出入，如圖4所示。

圖4 A.NQO1高低表達(dá)2組在膀胱癌中總體生存期的比較；B.NQO1高低表達(dá)2組在腫瘤無進(jìn)展生存期中的比較

2.4 NQO1在膀胱癌中的表達(dá)與免疫浸潤的關(guān)系

通過線上工具TIMER，我們發(fā)現(xiàn)NQO1 的表達(dá)與部分免疫細(xì)胞存在相關(guān)性，如B 細(xì)胞（正相關(guān)），CD8+T 細(xì)胞（負(fù)相關(guān)），CD4+T 細(xì)胞（負(fù)相關(guān)），與巨噬細(xì)胞以及中性粒細(xì)胞無明顯相關(guān)性；我們進(jìn)一步探究了NQO1 在膀胱癌中的表達(dá)與免疫細(xì)胞標(biāo)記物的共表達(dá)分析，我們發(fā)現(xiàn)NQO1的表達(dá)與大多數(shù)各類免疫細(xì)胞的標(biāo)記物存在共表達(dá)相關(guān)性。具體如下,B 細(xì)胞標(biāo)記物：CD19（負(fù)相關(guān)），CD79A（負(fù)相關(guān)）；CD8+T 細(xì)胞：CD8A（負(fù)相關(guān)），CD8B（負(fù)相關(guān)）；CD4+T 細(xì)胞：CD4（負(fù)相關(guān)）；巨噬細(xì)胞：NOS2（負(fù)相關(guān)），IRF5（正相關(guān)），PTGS2（負(fù)相關(guān)）；中性粒細(xì)胞：CEACAM8（負(fù)相關(guān)），ITGAM（負(fù)相關(guān)），CCR7（負(fù)相關(guān)）。如圖5、圖6所示。

圖5 NQO1表達(dá)與免疫細(xì)胞的關(guān)系

圖6 NQO1表達(dá)與免疫細(xì)胞標(biāo)記物的關(guān)系

3 討論

在我們前期研究中，我們通過設(shè)計ROS 響應(yīng)型的納米載藥體系，在膀胱癌灌注化療中取得了較好的療效，但我們發(fā)現(xiàn)僅僅依靠膀胱癌腫瘤組織中自有的較高的ROS 水平來實現(xiàn)腫瘤組織和正常組織的ROS 水平的差異依然相對不足。所以，我們希望通過進(jìn)一步提高腫瘤組織中的ROS水平擴大與正常組織的差異來實現(xiàn)ROS 響應(yīng)性藥物對腫瘤組織的高選擇性殺傷。通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)，我們發(fā)現(xiàn)NQO1 與ROS 的產(chǎn)生密切相關(guān)。NQO1 是一種黃素蛋白，作為同型二聚體發(fā)揮作用，與FAD 結(jié)合的每個單體都會催化多種醌的強制性雙電子還原為它們的氫醌形式，會消耗細(xì)胞輔助因子NADH或NADPH[6]。這些對氫醌的形式通常非常不穩(wěn)定，會自發(fā)與氧氣反應(yīng)，并轉(zhuǎn)化回母體醌。這種無效循環(huán)會導(dǎo)致顯著的NAD（P）H 氧化并產(chǎn)生ROS，包括最終導(dǎo)致過氧化氫（H2O2）形成的超氧化物。H2O2的產(chǎn)生會產(chǎn)生氧化應(yīng)激并促進(jìn)細(xì)胞死亡[7]?；诖?，我們希望通過選擇合適的方法進(jìn)一步擴大腫瘤組織與正常組織二者之間ROS 水平的差值，增大藥物的治療窗口，實現(xiàn)級聯(lián)放大效應(yīng)。NQO1 底物如蘭雪醌、β-拉帕酮（LAPA）、丹參酮IIA 可通過NQO1 介導(dǎo)的氧化還原循環(huán)觸發(fā)過量的ROS 形成誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，并已成為一種有前途的選擇性抗癌療法[8]。有研究指出，在PEG-PMAN 嵌段共聚物膠束中共包封LAPA 和ROS響應(yīng)前藥BDOX，有效地建立了級聯(lián)放大藥物釋放系統(tǒng)[9]。但LAPA 存在藥代動力學(xué)弱、生物利用度有限、水溶性差、半衰期短、需要給藥系統(tǒng)等障礙[10～12]。仍需尋找更為合適的NQO1底物。

NQO1 是一類通常在真核細(xì)胞中表達(dá)的黃素蛋白酶。它通過電子還原反應(yīng)積極參與各種醌的代謝及其體內(nèi)生物活化[13]。與正常細(xì)胞相比，NQO1 的表達(dá)水平在許多實體瘤細(xì)胞中高度上調(diào)。相對于正常組織樣本，NQO1 水平在多種癌癥類型中表達(dá)水平顯著增加，如肺癌、結(jié)腸直腸癌和乳腺癌等[14～16]。NQO1 因其在腫瘤中的過表達(dá)和生物活性而被認(rèn)為是候選分子靶標(biāo)。但NQO1在膀胱癌中的表達(dá)情況及生物信息學(xué)特性尚未有過較為全面的探究，本文的研究結(jié)果為后續(xù)實驗奠定理論基礎(chǔ)。

目前對腫瘤微環(huán)境相對于正常組織的成分差異目前已成為智能納米藥物的介入點。所以，目標(biāo)成分在腫瘤組織和正常組織中的顯著差異是產(chǎn)生響應(yīng)以提高靶向性的前提基礎(chǔ)。在本研究中，通過TCGA 下載的膀胱癌的表達(dá)矩陣，無論從腫瘤樣本與正常樣本的常規(guī)對比，還是配對對比，均發(fā)現(xiàn)NQO1 在腫瘤標(biāo)本與正常標(biāo)本之間存在差異性表達(dá)，這為ROS 響應(yīng)性納米藥物基于NQO1 的差異表達(dá)在膀胱癌中的應(yīng)用提供了前提條件，也是本研究關(guān)注的主要研究結(jié)果。但目前的腫瘤微環(huán)境和正常組織中的差異是否足以產(chǎn)生有效的刺激響應(yīng)有待于進(jìn)一步實驗探究。

在臨床及預(yù)后的相關(guān)性研究中，我們發(fā)現(xiàn)NQO1 的表達(dá)與疾病無進(jìn)展生存期存在相關(guān)性，但與總體生存期無顯著相關(guān)性。同時，對于與臨床信息如TNM 分期及分級相關(guān)性方面，NQO1 的表達(dá)與其無明顯相關(guān)性。這可能對設(shè)計的納米藥物提出挑戰(zhàn)，是否注重應(yīng)用NQO1 本身的對膀胱癌細(xì)胞的殺傷作用，還是著重對NQO1 本身產(chǎn)生ROS 進(jìn)行重點設(shè)計，需要進(jìn)一步權(quán)衡。NQO1 對疾病的進(jìn)展相關(guān)，且NQO1 的高表達(dá)對應(yīng)更差的疾病進(jìn)展，基于此，是否可以設(shè)計一款針對NQO1的納米藥物，抑制NQO1 的表達(dá)，延緩疾病進(jìn)展，提高預(yù)后效果。

目前腫瘤微環(huán)境的概念逐漸成為研究熱點，免疫浸潤和腫瘤微環(huán)境對各種腫瘤發(fā)生、發(fā)展起重要作用，腫瘤分子特征和免疫微環(huán)境的動態(tài)相互作用可產(chǎn)生不同臨床結(jié)果。本研究顯示，NQO1與膀胱癌浸潤B細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞顯著相關(guān)，即NQO1 的表達(dá)水平與免疫標(biāo)志物CD19、CD79A、CD8A、CD8B、CD4、NOS2、IRF5、PTGS2、CEACAM8、ITGAM、CCR7 等顯著相關(guān)，表明NQO1 在腫瘤免疫浸潤細(xì)胞中具有重要調(diào)節(jié)作用，可能與腫瘤免疫逃逸有關(guān)。這為后續(xù)我們制備納米載藥體系是否可以聯(lián)合免疫治療提供一個新思路。

雖然我們在本研究中，對NQO1 在膀胱癌中的生物信息學(xué)作用做了比較詳細(xì)的研究，但在應(yīng)用實際臨床樣本進(jìn)行驗證尚缺部分?jǐn)?shù)據(jù)，其次，對于NQO1 與腫瘤的重要預(yù)后指標(biāo)理論上無明顯相關(guān)性，這對后期的納米藥物設(shè)計的功能偏重方向提出挑戰(zhàn)。

綜上所述，本研究對于NQO1 在膀胱癌中的生物信息學(xué)作用進(jìn)行了較為詳細(xì)的闡述，基于NQO1 導(dǎo)致ROS 水平在腫瘤和正常組織的差異，設(shè)計制備ROS響應(yīng)性的納米藥物可行性較高。