梅敦成，黃 恒，楊慶紅

（湖北省第三人民醫(yī)院陽(yáng)邏院區(qū) 武漢 430000）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種受環(huán)境和遺傳因素共同影響的炎癥性關(guān)節(jié)炎癥，其作為自身免疫性系統(tǒng)疾病[1]，關(guān)節(jié)腫脹、疼痛、功能下降、變性是其主要臨床表現(xiàn)，而其主要特征在于慢性炎癥，可刺激關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞增殖，進(jìn)而引發(fā)滑膜炎，而增生組織入侵軟骨或骨組織會(huì)造成患者軟骨、骨骼損傷，甚至殘疾，嚴(yán)重影響患者壽命和生活質(zhì)量[2-4]，由此，抑制滑膜增生對(duì)治療RA具有重要作用[5]。目前甲氨蝶呤及地塞米松等抗風(fēng)濕藥是治療RA的常用藥物，雖然可在一定程度上緩解疾病程度，但該治療方發(fā)并非對(duì)所有患者有效，有許多患者對(duì)該類治療藥物無(wú)反應(yīng)，因此有必要尋找新的治療藥物以提高治療效果[3]。

白花丹是一種天然野生草藥，對(duì)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)疼痛、血瘀閉經(jīng)等疾病具有較好的改善作用，白花丹素（plumbagin，PLB）是其主要有效成分，有抗炎抑菌、抗纖維化等作用[6]。研究表明，PLB能有效促進(jìn)人RA成纖維樣滑膜細(xì)胞（fibroblast-like synoviocyte，F(xiàn)LS）凋亡并抑制炎癥反應(yīng)，從而對(duì)RA具有改善作用[7]。Wnt/β-連環(huán)蛋白（Wnt/β-catenin）信號(hào)通路對(duì)大量與代謝、生長(zhǎng)相關(guān)的基因具有調(diào)控作用，并且與骨質(zhì)疏松、股骨頭壞死、骨關(guān)節(jié)炎等骨相關(guān)疾病的發(fā)生密切相關(guān)[8-10]，除此之外，其已被發(fā)現(xiàn)在RA中具有重要作用，其激活可導(dǎo)致關(guān)節(jié)滑膜增生及滑膜液中大量炎性因子的分泌，造成滑膜炎癥損傷[5]。在人骨肉瘤細(xì)胞中，PLB能夠通過(guò)抑制Wnt/β-catenin通路信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)起到抗骨肉瘤細(xì)胞增殖的作用[11]。

目前關(guān)于PLB對(duì)RA中Wnt/β-catenin通路的影響還未見(jiàn)報(bào)道，并且PLB在RA中的影響機(jī)制是否可能與其調(diào)控Wnt/β-catenin通路有關(guān)也未可知。因此，本研究以期通過(guò)探究PLB對(duì)CIA大鼠Wnt/β-catenin信號(hào)通路的影響，以及其在RA中的可能作用機(jī)制，為RA新治療藥物的尋找提供參考。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

從長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司購(gòu)買60只SPF級(jí)SD大鼠（242-289 g），許可證：SCXK（吉）2016-0004，于正常12 h明暗交替環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，期間保持環(huán)境通風(fēng)，大鼠自由飲水、采食，實(shí)驗(yàn)前禁食12 h。

1.2 主要試劑

白花丹素（貨號(hào)：T2841c）購(gòu)自TargetMol公司；地塞米松（批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20053754）購(gòu)自西安國(guó)康瑞金制藥有限公司；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）酶 聯(lián) 免 疫 吸 附 實(shí) 驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢 測(cè) 試 劑 盒（貨 號(hào)：ER1393、ER0042）購(gòu)自武漢菲恩生物科技有限公司；HE染色試劑盒（貨號(hào)：G1120-100）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；蛋白提取試劑盒（貨號(hào)：CD-13559-ML）購(gòu)自武漢純度生物科技有限公司；蛋白檢測(cè)試劑盒、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗抗體（貨號(hào)：HR0329-ZHV、JN0200-GLH）購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司；兔抗β-actin（貨號(hào)：4970）、β-catenin（貨號(hào)：8480）、糖原合成酶激酶-3（GSK-3β）（貨號(hào)：9315）、Wnt3a抗體（貨號(hào)：2721）購(gòu)自Cell Signaling Technology；基質(zhì)金屬蛋白酶13（matrix metalloproteinase 13，MMP-13）（貨號(hào)：18165-1-AP）購(gòu)自Proteintech。

蛋白凝膠成像儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；Von Frey纖維絲測(cè)痛儀購(gòu)自上海玉研科學(xué)儀器有限公司；熱痛敏刺激儀購(gòu)自天津伯爾尼科技有限公司；SpectraMax iD3多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自美谷分子儀器（上海）有限公司。

2 方法

2.1 分組與模型構(gòu)建

將60只SD大鼠（每組10只）隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、地塞米松組（模型+30 mg·kg-1地塞米松）[12]、PLB-L組（2 mg·kg-1PLB）、PLB-M組（4 mg·kg-1PLB）、PLB-H組（6 mg·kg-1PLB）[13]。關(guān) 節(jié) 炎（collageninduced arthritis，CIA）模型構(gòu)建：10 mg牛II型膠原與0.1 mol·L-1冰醋酸（5 mL）混勻后4℃過(guò)夜，將上述溶液與完全弗氏佐劑等體積混合、乳化（質(zhì)量濃度1 g·L-1）于右后足跖足墊皮下注射0.1 mL，7天后以相同溶液于尾根部注射0.1 mL進(jìn)行加強(qiáng)免疫1周，若大鼠出現(xiàn)四肢甚至尾部出現(xiàn)紅腫即全身多發(fā)性關(guān)節(jié)炎，視為造模成功[12]；將造模成功的大鼠進(jìn)行為期2周的灌胃，地塞米松組、PLB-L組、PLB-M組、PLB-H組大鼠分別每天給予等量的30 mg·kg-1地塞米松及2 mg·kg-1PLB、4 mg·kg-1PLB、6 mg·kg-1PLB，對(duì)照組與模型組大鼠給予等量生理鹽水。

2.3 關(guān)節(jié)炎癥積分評(píng)價(jià)

灌胃結(jié)束后進(jìn)行關(guān)節(jié)炎癥積分評(píng)價(jià)：0分（正常）：無(wú)腫脹，2分（輕度）：皮膚紋理變淺、骨標(biāo)志明顯、觸之柔軟、輕度腫脹，4分（中度）：皮膚紋理消失、骨標(biāo)志不明顯、觸之發(fā)硬、明顯腫脹，6分（重度）：嚴(yán)重腫脹、骨標(biāo)志消失、皮膚緊繃、觸之發(fā)硬[12]。

2.4 大鼠熱刺激縮足反射潛伏期（paw withdrawal thermal latency，PWTL）及機(jī)械性痛閾（paw withdrawal mechanical threshold，PWT）檢測(cè)

使用熱痛敏刺激儀照射各組大鼠后足底掌心，當(dāng)大鼠后足移動(dòng)時(shí)系統(tǒng)記錄反映時(shí)間，即為PWTL；使用von Frey纖維絲測(cè)痛儀中的Von Frey纖維絲刺激各組大鼠后足底中部至輕度彎曲5 s，大鼠后足驟抬即為一次陽(yáng)性反應(yīng)（每次間隔大于60 s），重復(fù)5次，若大于三次出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，則此力度即為PWT[12]。

2.5 HE染色觀察大鼠足關(guān)節(jié)滑膜組織病理學(xué)變化

隨機(jī)取5只大鼠，腹腔注射水合氯醛（10%）進(jìn)行麻醉后于關(guān)節(jié)腔中注射生理鹽水（1 mL），活動(dòng)關(guān)節(jié)，抽取并收集關(guān)節(jié)液后取足關(guān)節(jié)滑膜組織于4%多聚甲醛中固定，24 h后乙醇脫水、石蠟包埋、切片（4 μm）、二甲苯脫蠟及梯度乙醇處理，再進(jìn)行HE染色、脫水、封片、顯微鏡觀察（n=5）。

2.6 ELISA法檢測(cè)大鼠關(guān)節(jié)液中炎癥因子水平

取2.5所得關(guān)節(jié)液，嚴(yán)格根據(jù)TNF-α、IL-6 ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行操作，于酶標(biāo)儀450 nm處檢測(cè)關(guān)節(jié)液中二者的水平。

2.7 免疫應(yīng)跡法檢測(cè)關(guān)節(jié)滑膜組織中蛋白表達(dá)情況

另取5只大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織，在研缽中研磨后通過(guò)苯甲基磺酰氟（Phenylmethanesulfonyl fluoride、PMSF）裂解后提取總蛋白，經(jīng)二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法檢測(cè)總蛋白含量；取上樣緩沖液與蛋白混勻后100℃進(jìn)行5min變性，以每孔40μg的量進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，低溫轉(zhuǎn)移蛋白至聚偏氟乙烯（Poly vinylidene fluoride)，PVDF）膜上，5%的脫脂奶粉封閉（1 h）后，1：1000加入兔抗β-actin、Wnt3a、β-catenin、GSK-3β和MMP-13一抗孵育（4℃）過(guò)夜，PBS清洗3次后HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（1:3000）孵育2 h，添加免疫印跡化學(xué)發(fā)光試劑（ECL Reagent）進(jìn)行顯色，蛋白凝膠成像儀觀察，定量分析各蛋白含量（n=5）。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±s）進(jìn)行描述，多組間行單因素方差分析，采用snk-q檢驗(yàn)進(jìn)行多組間進(jìn)一步兩兩比較；P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)論

3.1 各組大鼠一般情況比較

對(duì)照組大鼠皮毛光亮、關(guān)節(jié)無(wú)腫脹、可靈活運(yùn)動(dòng)；模型組大鼠皮毛無(wú)光澤、關(guān)節(jié)腫脹、跛行、活動(dòng)量與進(jìn)食量減少、精神倦?。坏厝姿山M、PLB-L組、PLB-M組和PLB-H組大鼠皮毛光澤度、脫毛情況、飲食、精神及行動(dòng)以PLB劑量依賴性的方式得到改善。

3.2 PLB對(duì)大鼠PWT、PWTL、關(guān)節(jié)炎癥積分的影響

與對(duì)照組相比，模型組大鼠PWT、PWTL顯著降低，而關(guān)節(jié)炎癥積分顯著增加（P＜0.05）；與模型組相比，地 塞米 松 組、PLB-L組、PLB-M組 和PLB-H組PWT、PWTL顯著增加，而關(guān)節(jié)炎癥積分顯著降低（P＜0.05）；與PLB-L組相比，PLB-M組和PLB-H組PWT、PWTL顯著增加，而關(guān)節(jié)炎癥積分顯著降低（P＜0.05）；與PLB-M組相比，PLB-H組PWT、PWTL顯著增加，而關(guān)節(jié)炎癥積分顯著降低（P＜0.05）。與地塞米松組相比，PLB-L組、PLB-M組PWT、PWTL顯著降低，而關(guān)節(jié) 炎 癥 積 分 顯 著 增 加（P＜0.05），PLB-H組PWT、PWTL、關(guān)節(jié)炎癥積分無(wú)顯著性差異（P＞0.05）（表1）。

表1 PLB對(duì)大鼠PWT、PWTL、關(guān)節(jié)炎癥積分的影響（n=10，xˉ±s）

3.3 PLB對(duì)大鼠足關(guān)節(jié)滑膜結(jié)構(gòu)的影響

對(duì)照組大鼠關(guān)節(jié)滑膜結(jié)構(gòu)正常，無(wú)病理學(xué)現(xiàn)象；模型組出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、滑膜層水腫、增厚明顯；地塞米松組、PLB-L組、PLB-M組和PLB-H組炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、滑膜層水腫增生現(xiàn)象以PLB劑量依賴性的方式逐漸減少（圖1）。

圖1 大鼠足關(guān)節(jié)滑膜結(jié)構(gòu)組織病理學(xué)觀察（HE，200×）

3.4 PLB對(duì)大鼠關(guān)節(jié)液中炎癥因子水平的影響

與對(duì)照組相比，模型組大鼠關(guān)節(jié)液中TNF-α、IL-6水平顯著增加（P＜0.05）；與模型組相比，地塞米松組、PLB-L組、PLB-M組和PLB-H組TNF-α、IL-6水平顯著降低（P＜0.05）；與PLB-L組相比，PLB-M組和PLB-H組TNF-α、IL-6水平顯著降低（P＜0.05）；與PLB-M組相比，PLB-H組TNF-α、IL-6水平顯著降低（P＜0.05）；與地塞米松組相比，PLB-L組、PLB-M組TNF-α、IL-6水平顯著增加（P＜0.05），PLB-H組TNFα、IL-6水平無(wú)顯著性差異（P＞0.05）（表2）。

表2 PLB對(duì)大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織炎癥因子水平的影響（n=5，xˉ±s）

3.5 PLB對(duì)大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白的影響

與對(duì)照組相比，模型組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織Wnt3a、β-catenin、GSK-3β和MMP-13表達(dá)水平顯著增加（P＜0.05）；與模型組相比，地塞米松組、PLB-M組和PLBH組Wnt3a、β-catenin、GSK-3β和MMP-13表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），PLB-L組Wnt3a、β-catenin、GSK-3β和MMP-13表達(dá)無(wú)顯著差異（P＞0.05）；與PLB-L組相比，PLB-M組和PLB-H組Wnt3a、β-catenin、GSK-3β和MMP-13表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；與PLB-M組相比，PLB-H組Wnt3a、β-catenin、GSK-3β和MMP-13表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；與地塞米松組相比，PLB-L組、PLB-M組Wnt3a、β-catenin、GSK-3β和MMP-13表達(dá)水平顯著增加（P＜0.05），PLB-H組上述蛋白表達(dá)無(wú)顯著性差異（P＞0.05）（表3、圖2）。

圖2 PLB對(duì)大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白的影響

表3 PLB對(duì)大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織炎癥因子水平的影響（n=5，xˉ±s）

4 討論

白花丹具有散於、消腫、止痛的功效，可用于治療跌打損傷、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)痛等病癥，大量研究證實(shí)，其在膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎、RA等關(guān)節(jié)疾病中具有明顯改善作用，而PLB是一種從白花丹中提取的具有免疫抑制特性的小分子化合物，在治療骨折、細(xì)菌感染、關(guān)節(jié)腫脹中療效甚佳，研究發(fā)現(xiàn)其在膠原蛋白誘發(fā)的關(guān)節(jié)炎中不僅可有效抑制破骨細(xì)胞增殖，還能通過(guò)調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）/輔助性Th17細(xì)胞失衡，抑制炎癥反應(yīng)[13-16]。PLB不僅能預(yù)防白細(xì)胞介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎模型小鼠軟骨破壞及軟骨下骨增生，還能有效抑制小鼠滑膜炎的發(fā)生，因此可能是骨關(guān)節(jié)炎的潛在治療藥物[17]。隨著關(guān)節(jié)腫脹的發(fā)作，滑膜會(huì)呈現(xiàn)出增生及巨噬細(xì)胞、自然殺傷（NK）細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象[2]。FLS是RA發(fā)生時(shí)的主要效應(yīng)細(xì)胞，其增殖過(guò)度是關(guān)節(jié)炎癥及關(guān)節(jié)破壞的主要原因之一，因此抑制其增殖對(duì)RA的治療十分重要，而PLB能通過(guò)抑制Janus激酶2（Janus kinase 2，JAK2）和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子3（Signal Transducer and Activator of Transcription protein，STAT3）信號(hào)通路來(lái)有效促進(jìn)RA大鼠FLS凋亡、抑制細(xì)胞增殖及炎癥反應(yīng)[6-7]。雖然PLB在多種類型關(guān)節(jié)疾病中具有良好的改善作用，但其在RA中的相關(guān)研究甚少。因此，本研究通過(guò)構(gòu)建CIA大鼠模型探究PLB對(duì)RA的改善機(jī)制發(fā)現(xiàn)，PLB能有效改善CIA大鼠行為學(xué)變化及足關(guān)節(jié)滑膜組織病理學(xué)程度，增加PWT、PWTL，降低關(guān)節(jié)炎癥積分、TNF-α和IL-6水平，與前人研究結(jié)果相一致。PLB可能是通過(guò)某種機(jī)制來(lái)降低CIA大鼠炎癥因子的分泌，以此減輕足關(guān)節(jié)滑膜組織病理?yè)p傷，上述結(jié)果表明，PLB能有效抑制CIA大鼠關(guān)節(jié)滑膜增生及炎癥反應(yīng)，有作為RA潛在治療藥物的可能。

Wnt家族蛋白質(zhì)與骨骼形成、組織修復(fù)、關(guān)節(jié)內(nèi)穩(wěn)態(tài)密切相關(guān)，而β-catenin過(guò)表達(dá)可加劇軟骨細(xì)胞肥大、軟骨變性，促進(jìn)基質(zhì)蛋白酶的表達(dá)[18-20]。Wnt/βcatenin是一個(gè)經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路，其在正常狀態(tài)下處于靜止?fàn)顟B(tài)，可在器官受到損傷時(shí)被激活，研究發(fā)現(xiàn)其在骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨及滑膜中處于激活狀態(tài)，抑制該通路可改善骨關(guān)節(jié)炎小鼠及RA大鼠模型的關(guān)節(jié)炎程度[18,21]。補(bǔ)腎祛寒治尪湯可通過(guò)抑制Wnt/βcatenin通路激活，來(lái)緩解膠原所誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)炎癥狀及骨破壞[22]。Wnt/β-catenin參與滑膜成纖維細(xì)胞中的炎癥反應(yīng)，RA患者滑膜組織中β-catenin表達(dá)水平異常增加，因此抑制其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是治療RA的重要環(huán)節(jié)[5,23]。有研究發(fā)現(xiàn)，抑制Wnt-3α/β-catenin信號(hào)通路可顯著緩解RA患者關(guān)節(jié)疼痛，改善關(guān)節(jié)功能[24]。GSK-3β可與β-catenin相結(jié)合參與細(xì)胞增殖、分化[23]。MMPs能夠降解關(guān)節(jié)軟骨中的膠原、蛋白等大分子，而且來(lái)源于滑膜細(xì)胞的MMPs還能夠?qū)е玛P(guān)節(jié)病理性損傷，抑制其產(chǎn)生對(duì)RA的治療至關(guān)重要，研究發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin通路激活可促進(jìn)MMP-13分泌[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，CIA模型大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中Wnt3a、β-catenin、GSK-3β和MMP-13表達(dá)水平顯著增加，與前人研究結(jié)果相似，該結(jié)果表明，Wnt/βcatenin通路在CIA大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織被顯著激活，其參與RA的發(fā)生，CIA大鼠炎癥反應(yīng)及關(guān)節(jié)滑膜組織病理?yè)p傷的發(fā)生可能與該通路的激活有關(guān)。有報(bào)道稱，PLB能夠通過(guò)抑制Wnt/β-catenin途徑來(lái)抑制乳腺癌細(xì)胞增殖和侵襲，以及血管生成[26]。而PLB是否可能影響CIA大鼠Wnt/β-catenin途徑的激活還未可知，因此本研究通過(guò)對(duì)其探究發(fā)現(xiàn)，PLB能顯著降低CIA大鼠Wnt3a、β-catenin、GSK-3β和MMP-13表達(dá)水平。該結(jié)果表明，PLB能夠有效抑制CIA大鼠Wnt/βcatenin途徑的激活，而PLB對(duì)CIA大鼠潛在的治療作用可能與其抑制該通路有關(guān)。

綜上所述，PLB對(duì)CIA大鼠關(guān)節(jié)滑膜增生及炎癥反應(yīng)的抑制作用，可能與其抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路有關(guān)。本研究不僅為RA新藥的尋找提供參考，還對(duì)其發(fā)病機(jī)制的研究具有重要意義，但由于模型樣本受限，研究未對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的下游詳細(xì)機(jī)制進(jìn)行探討，因此在未來(lái)的研究中還需擴(kuò)大樣本，對(duì)其下游機(jī)制進(jìn)行深入探究。