范增光，袁 野

（江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 南昌 330006）

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種以動脈血管壁白細(xì)胞浸潤為特征表現(xiàn)的慢性炎性疾病，以脂質(zhì)沉積，血管硬化，彈性下降，內(nèi)膜斑塊形成及管腔狹窄為主要病理變化，是心腦血管疾病發(fā)生發(fā)展的重要原因[1-3]。近年來，AS發(fā)病率呈逐年上升狀態(tài)，根據(jù)WHO最新統(tǒng)計的數(shù)據(jù)可以看出，全球每年大約有1790萬人死于AS相關(guān)的心腦血管疾病，占全球總死亡率的31%，已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅人們健康的慢性疾病之一，因此，深入研究AS的發(fā)病機(jī)制，并以此為靶點延緩，甚至逆轉(zhuǎn)AS進(jìn)程，是降低心腦血管疾病的關(guān)鍵[4-5]。越來越多的研究表明，炎癥反應(yīng)在AS的各個階段均起到關(guān)鍵的作用[6-7]。并且關(guān)于炎癥因子及C反應(yīng)蛋白的研究已取得初步成效，研究表明，直接靶向炎癥因子治療AS成為目前的研究熱點[8]。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路廣泛存在于細(xì)胞中，可調(diào)節(jié)多種生物過程，如細(xì)胞生長、趨化及增殖等，對多種心血管疾病進(jìn)展均發(fā)揮著重要作用，而p38MAPK是MAPKs信號通路家族成員之一，與AS的形成具有密切的關(guān)系，p38MAPK在受到外界刺激后發(fā)生磷酸化而被激活，從而引發(fā)多種生物學(xué)反應(yīng)，可促進(jìn)VSMCs增殖信號傳入細(xì)胞核，使其從中膜遷至內(nèi)膜，并發(fā)生增殖，促使機(jī)體內(nèi)發(fā)生炎癥性瀑布反應(yīng)，進(jìn)而促進(jìn)了AS的發(fā)生和發(fā)展[9-12]。核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）是p38MAPK的下游信號通路，NF-κB是炎癥最重要的調(diào)節(jié)因子之一，其主要形式為p50和p65組成的二聚體，參與AS病理過程的各個階段[13-15]。研究表明，當(dāng)NFκB被激活后，NF-κB可以從IκBα釋放，使得NF-κB由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，并在其中介導(dǎo)炎性因子及趨化因子如IL-6、TNF-α和ICAM-1的產(chǎn)生和分泌，進(jìn)而誘發(fā)或促進(jìn)AS的發(fā)生[16]。

本課題組前期研究證實了蘇木是一種具有抗炎、免疫抑制、抗心臟移植排斥反應(yīng)、保護(hù)血管、抗腫瘤、抗氧化等多方面的作用的藥物[17]。近年來，關(guān)于蘇木的實驗及現(xiàn)代藥理研究大多圍繞在抗炎、免疫抑制等方面，其中蘇木抗動脈粥樣硬化的作用雖然已得到證實，但是具體的機(jī)制尚未完全闡述清楚，故深入研究其抗動脈粥樣硬化的作用機(jī)制顯得尤為重要。因此，本研究擬從p38MAPK/NF-κB信號通路入手，探討蘇木提取物是否通過該途徑調(diào)節(jié)AS模型小鼠的炎癥因子、粘附分子及血脂水平，為進(jìn)一步探討蘇木提取物治療AS的具體機(jī)制提供可靠的實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

8周齡雄性ApoE-/-小鼠40只和相同基因背景的8周齡雄性C57BL/6J小鼠10只，體質(zhì)量約18-21 g，許可證號SCXK（京）2016-0006，均購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。飼養(yǎng)于清潔級動物實驗室，調(diào)節(jié)溫度（20-25）℃，濕度（55±15）%，風(fēng)速（0.1-0.2）m·s-1，12 h循環(huán)照明。

1.2 實驗藥物

蘇木提取物制備：取蘇木生藥，產(chǎn)地為云南，購于黑龍江省藥材公司，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院提取和制備。具體方法：經(jīng)生藥鑒定制成40目蘇木粗粉并浸泡濃度為75%乙醇溶液中4 h，經(jīng)重復(fù)回流2次，去渣，加熱至85℃，水浴蒸干制成干粉，將提取的干粉加入雙蒸水中充分混勻得到混懸液，然后使用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，即得到蘇木提取物。

1.3 實驗試劑與儀器

蘇木伊紅染液（碧云天生物）、4%多聚甲醛（武漢塞維爾公司）、ELISA試劑盒（碧云天生物）、p38MAPK及NF-κB抗體（德國CST公司）。顯微鏡（廣州明美光電技術(shù)有限公司）、4℃冰箱（青島海爾股份有限公司）、-80℃超低溫冰箱（中科美菱）、石蠟切片機(jī)（德國Leica公司）、石蠟包埋機(jī)（德國Leica公司）、液氮罐（中國四川樂山東亞公司）、離心機(jī)（常州崢嶸儀器有限公司）、移液槍（德國Eppendorf公司）、全自動生化分析儀（深圳雷杜生命科技）等。

1.4 動物分組

所有小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后，將10只C57BL/6J小鼠設(shè)為空白組（Control）；40只ApoE-/-小鼠隨機(jī)分為，模型組（Model）、蘇木提取物低劑量組（Low-dose SEAE），蘇木提取物中劑量組（Medium-dose SEAE），蘇木提取物高劑量組（High-dose SEAE），每組10只。

1.5 模型制備

本實驗采用高脂飲食喂養(yǎng)復(fù)制動脈粥樣硬化模型：小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后，C57BL/6J小鼠繼續(xù)給予普通飼料喂養(yǎng)；ApoE-/-小鼠給予高脂飼料（含15%可可脂、2.5%膽固醇）喂養(yǎng)8周建立動脈粥樣硬化模型。

1.6 動物給藥

配制成為5‰的羧甲基纖維素鈉溶液（CMCNa）。根據(jù)課題組前期實驗結(jié)果及人小鼠換算公式給藥，小鼠的給藥劑量=人的劑量（mg·kg-1）×人的體重（kg）×換算系數(shù)（0.0026）/所求動物的體重（kg）。于實驗的第9周對各組小鼠進(jìn)行灌胃，時間為4周。具體方法如下：①空白組：等體積的5‰ CMC-Na（0.1 mL/10 g）灌胃；②模型組：等體積的5‰ CMC-Na（0.1 mL/10 g）灌胃；③蘇木提取物低劑量組：蘇木混懸劑（0.1 mL/10 g）灌胃，相當(dāng)于生藥量0.83 g/（kg·d）；④蘇木提取物中劑量組：蘇木混懸劑（0.1 mL/10 g）灌胃，相當(dāng)于生藥量1.66 g/（kg·d）；⑤蘇木提取物高劑量組：蘇木混懸劑（0.1 mL/10 g）灌胃，相當(dāng)于生藥量3.32 g/（kg·d）。

1.7 標(biāo)本取材與指標(biāo)檢測

于實驗的第12周末，小鼠禁食12 h，不禁水，10%水合氯醛（0.1 mL/10 g）腹腔注射麻醉，摘取眼球取血，3000 r·min-1，離心10 min，分離血清；剝離主動脈，并將周圍的組織剔除干凈，取主動脈根部，用4%多聚甲醛溶液固定，用石蠟包埋標(biāo)本，切片備用。

1.8 HE染色觀察主動脈竇病理形態(tài)

取固定好的主動脈根部，制備石蠟標(biāo)本、切片，蘇木素溶液中染色5 min，清水沖洗1 min，1%鹽酸乙醇溶液分化10 s，清水沖洗3 min，用0.5%伊紅染色2 min，清水沖洗1 min，依次放入不同濃度的乙醇溶液中脫水，再放入二甲苯中透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察各組小鼠主動脈竇部病理形態(tài)改變，并拍照。

1.9 ELISA檢測血清IL-1β、TNF-α、ICAM-1、VCAM-1水平

按ELISA試劑盒說明書的步驟，檢測IL-1β、TNF-α、ICAM-1、VCAM-1的含量。

1.10 全自動生化儀測定TC、TG、LDL-C、HDL-C水平

應(yīng)用全自動生化儀測定TC、TG、LDL-C、HDL-C水平。

1.11 Western Blot法檢測p38MAPK、NF-κB蛋白表達(dá)

取小鼠主動脈組織勻漿，進(jìn)行總蛋白的提取。根據(jù)BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒說明書測定樣品蛋白濃度。取40μg蛋白，在SDS/PAGE中以分離膠電壓按120 V、濃縮膠電壓按50 V進(jìn)行恒壓電泳。100 V恒壓轉(zhuǎn)膜，并根據(jù)靶蛋白的分子量大小調(diào)整。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，取下支架，將轉(zhuǎn)好的膜放入封閉液中，室溫下封閉1 h；棄去封閉液，加入已稀釋的一抗緩沖液中，4℃過夜；回收已稀釋好的一抗，室溫下TBST漂洗3次，每次5 min；加入稀釋好的二抗，室溫下培養(yǎng)30 min，室溫下TBST在搖床漂洗4次，每次5 min。在NC膜的蛋白面?zhèn)鹊渭映鬍CL顯色液，暗室中操作；將膠片依次顯影、定影后，用Image J軟件計算各條帶的密度值，以目的條帶密度值與內(nèi)參（GAPDH）密度值的比值，作為其相對表達(dá)量。

1.12 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS23.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，統(tǒng)計方法采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），方差齊者行LSD檢驗，方差不齊者行Dunnett’s T3檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.01為差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義，P＞0.05為差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對病理形態(tài)的影響

空白組小鼠主動脈內(nèi)膜各層結(jié)構(gòu)及層次清晰，內(nèi)膜光滑，血管內(nèi)皮完整連續(xù)，未見明顯的脂質(zhì)沉積及斑塊形成；中膜可見梭型排列整齊的血管平滑肌細(xì)胞；外膜為疏松的結(jié)締組織；模型組小鼠主動脈內(nèi)膜排列紊亂，內(nèi)皮增厚；中膜可見排列不整齊的平滑肌細(xì)胞，局部可見炎癥細(xì)胞浸潤，并有脂質(zhì)斑塊形成，呈AS病理形態(tài)學(xué)改變；蘇木提取物低劑量組、蘇木提取物中劑量組、蘇木提取物高劑量小鼠主動脈竇AS病理形態(tài)學(xué)改變均較模型組有一定的改善，表現(xiàn)為小鼠主動脈竇部血管壁三層結(jié)果基本完整，內(nèi)皮細(xì)胞表面排列不規(guī)整，可見少量脫落的內(nèi)皮細(xì)胞（圖1）。

圖1 各組小鼠主動脈竇HE染色結(jié)果（×200）

2.2 對小鼠血清IL-1β、TNF-α、ICAM-1、VCAM-1的影響

2.2.1 對IL-1β、TNF-α的的影響

如表1所示：與空白組比較，模型組小鼠血清IL-1β、TNF-α水平升高，差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，蘇木提取物低劑量組、蘇木提取物中劑量組、蘇木提取物高劑量組IL-1β、TNF-α水平降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）（圖2）。

表1 各組小鼠血清IL-1β、TNF-α水平比較（±s，pg·mL-1，n=10）

表1 各組小鼠血清IL-1β、TNF-α水平比較（±s，pg·mL-1，n=10）

注：**P＜0.01 vs Control group；#P＜0.05 vs Model group；##P＜0.01 vs Model group。

Group Control Model Low-dose SEAE Medium-dose SEAE High-dose SEAE IL-1β 43.72±1.95 80.59±1.88**77.73±2.60#63.43±3.09##60.13±2.48##TNF-α 44.29±1.84 81.72±2.64**79.52±1.43#66.88±2.01##64.07±1.74##

圖2 各組小鼠血清IL-1β、TNF-α水平比較

2.2.2 對ICAM-1、VCAM-1的影響

如表2所示：與空白組比較，模型組小鼠血清ICAM-1、VCAM-1水平升高，差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，蘇木提取物低劑量組、蘇木提取物中劑量組、蘇木提取物高劑量組ICAM-1、VCAM-1水平降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05、P＜0.01）（圖3）。

表2 各組小鼠血清ICAM-1、VCAM-1水平比較（±s，ng·mL-1，n=10）

表2 各組小鼠血清ICAM-1、VCAM-1水平比較（±s，ng·mL-1，n=10）

注：**P＜0.01 vs Control group；#P＜0.05 vs Model group；##P＜0.01 vs Model group。

Group Control Model Low-dose SEAE Medium-dose SEAE High-dose SEAE ICAM-1 1.32±0.12 4.44±0.33**4.01±0.17#3.13±0.29##2.76±0.19##VCAM-1 1.18±0.10 2.71±0.42**2.18±0.14#1.95±0.13##1.73±0.14##

圖3 各組小鼠血清ICAM-1、VCAM-1水平比較

2.3 對小鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C的影響

如表3所示：與空白組比較，模型組小鼠血清TC、TG、LDL-C升高，差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，蘇木提取物低劑量組、蘇木提取物中劑量組、蘇木提取物高劑量組TC、TG、LDL-C降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）（圖4）。

圖4 各組小鼠血清TC、TG、LDL-C水平比較

表3 各組小鼠血清TC、TG、LDL-C水平比較（±s，mmol·L-1，n=10）

表3 各組小鼠血清TC、TG、LDL-C水平比較（±s，mmol·L-1，n=10）

注：**P＜0.01 vs Control group；#P＜0.05 vs Model group；##P＜0.01 vs Model group。

Group Control Model Low-dose SEAE Medium-dose SEAE High-dose SEAE TC 8.46±0.33 17.54±0.42**17.15±0.25#15.64±0.31##15.35±0.33##TG 1.31±0.10 3.85±0.15**3.69±0.14#3.37±0.16##3.32±0.16##LDL-C 6.74±0.17 13.60±0.28**13.44±0.39 13.30±0.20#13.29±0.22#HDL-C 1.21±0.06 1.16±0.10 1.17±0.09 1.19±0.09 1.19±0.08

2.4 對小鼠主動脈p38MAPK、NF-κB蛋白表達(dá)的影響

如表4所示：與空白組比較，模型組p38MAPK、NF-κB蛋白表達(dá)水平升高，差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與模型比較，蘇木提取物低劑量組、蘇木提取物中劑量組、蘇木提取物高劑量組p38MAPK、NF-κB蛋白表達(dá)水平降低，差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）（圖5）。

圖5 各組小小鼠主動脈p38MAPK、NF-κB蛋白表達(dá)比較

表4 各組小鼠主動脈p38MAPK、NF-κB蛋白表達(dá)比較（±s，n=10）

表4 各組小鼠主動脈p38MAPK、NF-κB蛋白表達(dá)比較（±s，n=10）

注：**P＜0.01 vs Control group；#P＜0.05 vs Model group；##P＜0.01 vs Model group。

Group Control Model Low-dose SEAE Medium-dose SEAE High-dose SEAE p38MAPK/GAPDH 0.316±0.012 0.900±0.013**0.819±0.013##0.722±0.014##0.702±0.011##NF-κB/GAPDH 0.346±0.014 0.972±0.029**0.949±0.014#0.862±0.018##0.715±0.018##

3 討論

建立動物模型目的是用于疾病的防治，為了更好地服務(wù)臨床，進(jìn)而為人類健康保駕護(hù)航。而AS模型的合理建立有利于深入研究其發(fā)病機(jī)制，可以豐富我們對這一類疾病的認(rèn)識，以便發(fā)掘更好的治療方案。常用的動物模型主要包括大鼠、家兔、靈長類動物、豬及基因敲除小鼠等，但由于動物模型是模擬原型，所以優(yōu)化動物模型對于進(jìn)一步深入探討AS的發(fā)生發(fā)展具有重要的作用。目前，鼠類依然AS動物模型研究最多的動物，尤其基因敲除小鼠，具有AS模型成模周期短，模型穩(wěn)定等諸多優(yōu)點。載脂蛋白E（ApoE）是極低密度脂蛋白（VLDL）、乳糜微粒（CM）等重要的組成成分，缺乏ApoE會引起膽固醇在血管壁不斷堆積，進(jìn)而使得血管壁增厚硬化，彈性減少，甚至引起管腔狹窄，極易促使AS的發(fā)生，目前，ApoE-/-基因敲除小鼠作為最為經(jīng)典AS動物模型之一，不僅因其可自發(fā)形成動脈粥樣硬化病變，更為重要的是ApoE-/-小鼠病理改變與人類II型高脂血癥極為相似，并且AS斑塊主要好發(fā)于主動脈弓、主動脈瓣、胸主動脈等主動脈及其分支，晚期AS斑塊易出現(xiàn)鈣化等情況，非常符合臨床AS患者病變特征，故被廣泛運(yùn)用于冠心病、高脂血癥等疾病的研究。

中醫(yī)學(xué)多將AS歸屬于“胸痹”的范疇，認(rèn)為動脈斑塊的形成，主要在于血液運(yùn)行不暢、痹阻不通，如《素問》中記載“痹在于脈則血凝而不流”，較為清晰的闡述了血液滯澀不通為脈痹總的病因病機(jī)。并認(rèn)為動脈粥樣硬化是冠心病的病變基礎(chǔ)，所以及時正確的防治對于預(yù)防、甚至延緩冠心病的發(fā)生具有重要的意義，而中醫(yī)藥對于預(yù)防和治療動脈粥樣硬化具有顯著的作用，且安全性較高。蘇木為豆科云實屬植物蘇木的干燥心材，又名赤木、蘇楊、蘇枋，首載于唐代蘇敬等人所著的《新修本草》[18-19]。具有舒經(jīng)活絡(luò)、活血散瘀、消腫止痛等功效，臨床上主要用于治療心腹疼痛、瘀滯腫痛、跌打損傷、癰腫瘡毒、血滯經(jīng)閉、痛經(jīng)及產(chǎn)后瘀阻腹痛等病癥[20]。關(guān)于蘇木的藥物成分國內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了更為深入的研究，但由于蘇木的化學(xué)成分較為復(fù)雜，目前僅僅從蘇木的心材中分離鑒定出大約120個化合物，而其中，又尤以巴西蘇木素含量最高，是蘇木化學(xué)成分的主要類型，也是目前蘇木藥材的質(zhì)控的主要成分[21]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明蘇木具有免疫抑制、抗炎、抗心臟移植排斥反應(yīng)、保護(hù)血管、抑制淋巴細(xì)胞、抗氧化、抗腫瘤等多方面作用[22]。本研究結(jié)果顯示蘇木能夠降低小鼠血清中IL-1β、TNF-α、ICAM-1、VCAM-1及TC、TG、LDL-C水平。綜合上述文獻(xiàn)及本研究結(jié)果再次證實了蘇木具有抗炎、降低血脂等方面的作用，進(jìn)一步為蘇木防治AS提供可靠的理論依據(jù)。

AS是一類慢性炎癥性疾病，最早由Ross提出[23]，并認(rèn)為在AS發(fā)病的全過程各種炎癥細(xì)胞和炎癥介質(zhì)均參與其中。但是，現(xiàn)階段人們對于這種慢性低度的炎癥具體的發(fā)病機(jī)制缺乏認(rèn)識，同樣對于治療也缺乏有效的治療方案，因此，深入研究炎癥相關(guān)機(jī)制將對于AS的防治具有重要的意義。研究表明，MAPKs在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)廣泛存在，被認(rèn)為是炎癥反應(yīng)中一種重要的激酶，在調(diào)控炎癥反應(yīng)周期、調(diào)節(jié)細(xì)胞生長及分化等生理過程中起到關(guān)鍵的作用，其中，p38MAPK是其家族中最重要的成員之一，其活化后可以促使白細(xì)胞不斷地發(fā)生聚集，進(jìn)而引起或放大炎癥反應(yīng)，而一旦阻斷p38MAPK的活化便可以緩解炎癥反應(yīng)[24-25]。NF-κB是真核細(xì)胞內(nèi)一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，研究表明，NF-κB的表達(dá)與MAPK信號通路密切相關(guān)，為p38MAPK的下游通路，活化的p38MAPK能夠引起NF-κBp65磷酸化，而一旦NF-κB活化后便可以多種炎癥因子、黏附分子的釋放，如IL-6、IL-1β、TNF-α、細(xì)胞間黏附分子（ICAM-1）及血管細(xì)胞黏附因子（VCAM-1）等，進(jìn)而引起多種免疫炎癥反應(yīng)[26-28]。IL-1β在AS發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，研究表明，當(dāng)Apo E-/-小鼠敲除IL-1β后可以延緩AS的進(jìn)展，同樣，與正常人比較，冠心病患者體中IL-1β水平明顯升高[29]。TNF-α亦參與了AS的形成，研究表明，TNF-α可通過介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷、促進(jìn)凝血、抑制纖溶等途徑促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增殖、遷移從而引起AS的發(fā)生[30]。ICAM-1屬于免疫球蛋白家族，通常情況下其很少表達(dá)，而在炎癥因子的刺激下ICAM-1表達(dá)會明顯升高，進(jìn)而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞和單核細(xì)胞兩者的黏附，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，誘發(fā)AS的發(fā)生發(fā)展，研究表明，ICAM-1、VCAM-1與AS早期斑塊的進(jìn)展密切相關(guān)，同時和AS的嚴(yán)重程度成正比[31]。同樣，脂質(zhì)代謝紊亂作為AS獨立的危險因素，是AS的病理基礎(chǔ)，已被證實TC、TG、LDL等水平的升高與AS呈正相關(guān)，而HDL水平與AS發(fā)病呈負(fù)相關(guān)[32-33]。

本研究在體內(nèi)實驗中，結(jié)果顯示：與空白組比較，模型組小鼠血清中IL-1β、TNF-α、ICAM-1、VCAM-1及TC、TG、LDL-C水 平 升 高，同 樣，主 動 脈 中p38MAPK、NF-κB蛋白表達(dá)亦升高；與模型組比較，蘇木提取物低、中、高組小鼠血清中IL-1β、TNF-α、ICAM-1、VCAM-1及TC、TG、LDL-C水平降低，主動脈中p38MAPK、NF-κB蛋白表達(dá)降低。初步說明了蘇木提取物能夠抑制炎癥因子、黏附分子及血脂的表達(dá)水平，同時下調(diào)p38MAPK/NF-κB信號通路的表達(dá)。即蘇木提取物能夠通過抗炎、降血脂等途徑發(fā)揮抗AS的作用，部分機(jī)制可能與抑制p38MAPK/NF-κB信號通路活化有關(guān)。