劉雨彤，宋 囡，王 奡，張 新，戴夢竹，楊 瑩，陳文娜

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)研究生學(xué)院 沈陽 110847）

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，占所有癌癥發(fā)病率的首位[1]。在我國，盡管對乳腺癌的宣傳預(yù)防和篩查工作不斷開展，但乳腺癌的發(fā)病率和死亡率仍逐年上升，已嚴(yán)重危害我國女性健康。因此，仍需要進一步探索乳腺癌的發(fā)生發(fā)展機制，尋找新的抗癌作用靶點。

中醫(yī)認為，乳腺癌的發(fā)病機制多為肝氣郁結(jié)、脾虛痰濁，《靈樞·刺節(jié)真邪篇》有曰“已有所結(jié)，氣歸之，津液留之凝結(jié)日以易甚，連以居，為昔瘤。以手按之堅，有所結(jié)?！币虼?，現(xiàn)階段眾多醫(yī)家治療乳腺癌慣用治療原則為疏肝解郁，健脾化痰，在治療方劑中常選用茯苓[2-3]。茯苓具有化痰、利水、健脾的功效，從多方面發(fā)揮治療乳腺癌的作用。茯苓多糖（Poria cocos polysaccharides）是茯苓最主要的有效成分之一，具有增強機體免疫力、抗病毒、抗腫瘤、抗衰老、抗放化療毒性等作用[4-5]。

目前很多研究發(fā)現(xiàn)糖代謝和脂代謝與乳腺癌患者的病情發(fā)展及預(yù)后有很大相關(guān)性。糖代謝改變稱為Warburg效應(yīng)（Warburg effect）即腫瘤細胞要以更高的效率吸收更多的葡萄糖來產(chǎn)生能量和滿足快速生長的需求[6-7]。也有報道發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境中存在明顯的脂質(zhì)代謝異常，脂質(zhì)加快從頭合成與外部攝取以滿足癌細胞的快速生長。乳腺組織中含有豐富的脂肪組織，脂質(zhì)代謝的異常也使乳腺癌更加容易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。因此，挖掘糖脂代謝上的相關(guān)基因可為乳腺癌的臨床診斷及治療提供新的思路和方法。

當(dāng)前雖然有文獻報道關(guān)于茯苓多糖影響乳腺癌細胞凋亡及遷移機制的研究[8-10]，但國內(nèi)外尚未見從糖脂代謝角度深入探討茯苓多糖治療乳腺癌分子機制的研究。本研究首次將茯苓健脾化痰的藥效原理與改善乳腺癌患者糖脂代謝的現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論相結(jié)合，探討茯苓多糖治療乳腺癌的分子機制，為完善茯苓多糖治療乳腺癌的具體機制上提供了新的靶點和思路。

1 資料與方法

1.1 實驗材料、試劑

1.1.1 細胞株

人乳腺癌細胞MCF-7細胞株購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。

1.1.2 主要藥物試劑

茯苓多糖購自源葉生物有限公司（批號C25F7Y1 0033）；PBS緩沖液購自武漢普諾賽生命科技有限公司（批號WH0621P171）；培養(yǎng)基DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基購自武漢普諾賽生命科技有限公司（批號WH0111201909）；胎牛血清購自天津灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司（批號TBD21HY）；二甲基亞楓（DMSO）購自北京索萊寶生命科技有限公司（批號710N0310）；胰酶購自北京索萊寶生命科技有限公司（批號NO.T1350）；青霉素-鏈霉素溶液（雙抗100×）購自武漢普諾賽生命科技有限公司（批號WH011120191 0SP）；CCK8試劑購自弗德生物（批號FD3788）；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自近岸蛋白質(zhì)科技有限公司（批號0516951 E047-01B）；RT-qPCR試劑購自bimake.com（批號B522102）

1.1.3 儀器

酶標(biāo)儀為NanoQuant infinite M200Pro；超微量紫外分光光度計為ND5000；PCR儀為BIO-RAD T100 Thermal Cycler；PCR擴增儀為QuantStudio3；培養(yǎng)箱為Thermo Fisher科技公司

1.2 實驗方法

1.2.1 數(shù)據(jù)挖掘與篩選

在GEO數(shù)據(jù)庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中輸入檢索詞breast cancer，限定檢索范圍為Homo sapiens，篩選檢索結(jié)果得到目標(biāo)數(shù)據(jù)集。運用GEO自帶分析軟件GEO2R，將乳腺癌組織樣本設(shè)定為BC組，匹配到的癌旁及正常組織樣本設(shè)定為normal組做差異表達基因的分析。將分析出的差異基因按|log2FC|＞2，P＜0.05再次進行篩選，取兩個數(shù)據(jù)集交集。FC（fold change）表示差異表達基因的差值倍數(shù)。

1.2.2 差異基因生物學(xué)功能分析和處理

利用DAVID數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/）對篩選后的差異基因進行GO功能分析，對交集基因可能參與的生物學(xué)過程（biological process,BP）、細胞組分（cell component,CC）、分子功能（molecular function,MF）及信號通路進行注釋和分析，并重點關(guān)注BP中關(guān)于糖脂代謝的基因。再將基因?qū)隨TRING在線數(shù)據(jù)分析網(wǎng)站（https://string-db.org/），得到PPI網(wǎng)絡(luò)互作圖（Protein-Protein Interaction Networks,PPI）

1.2.3 細胞培養(yǎng)

乳腺癌細胞MCF-7用含10%-20%胎牛血清、青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基，在37°C、CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察并記錄細胞的生長狀態(tài)。

1.2.4 藥品配制

稱取0.04 g茯苓多糖溶于50 μL DMSO，加入10 mL PBS配成濃度為4 mg·mL-1的藥品母液并過細胞濾器。將母液分別配成10，50，100，200，400 μg·mL-1含藥培養(yǎng)基用作茯苓多糖給藥組。

1.2.5 CCK8給藥分組及結(jié)果測定

取對數(shù)生長期的MCF-7細胞配成細胞懸液，每孔5000個細胞接種于三塊96孔板，置于培養(yǎng)箱5%CO2，37°C培養(yǎng)24h待細胞長滿至80%-90%，加入5個不同濃度（10，50，100，200，400 μg·mL-1）茯苓多糖含藥培養(yǎng)基，每孔100μL，分別培養(yǎng)24 h，48 h，72 h。對應(yīng)時間取出孔板，棄去舊培養(yǎng)基，每孔加入新鮮培養(yǎng)基100μL后，加入CCK8溶液10μL，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h，酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處吸光度OD值。根據(jù)公式計算細胞增殖抑制率。細胞相對活力：細胞存活率=(藥物處理組平均OD-空白對照平均OD)/(正常組平均OD-空白對照平均OD)×100%；增殖抑制率（inhibition rate，IR%）=1-細胞存活率。

1.2.6 血清總RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

將細胞設(shè)對照組和給藥組，適應(yīng)性培養(yǎng)1天。待細胞長滿至80%-90%時，給藥組加入根據(jù)CCK8篩選出最佳藥物有效濃度的含藥培養(yǎng)基并培養(yǎng)對應(yīng)時間。根據(jù)RNA提取試劑盒提取兩組細胞的總RNA。超微量紫外分光光度計檢測總RNA濃度和純度。根據(jù)總RNA檢測濃度進行稀釋，并用反轉(zhuǎn)試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.2.7 RT-qPCR檢測細胞基因表達情況

PCR引物由上海生工生物工程有限公司設(shè)計合成生產(chǎn)，各基因引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系為20μL，分別加入2×SYBR Green qPCR Master Mix、上下游引物、ROX Reference Dye、去離子水及cDNA模板，GAPGH為內(nèi)參基因，每個基因設(shè)置分組設(shè)三個復(fù)孔。將反應(yīng)液放入Quantstudio3實時熒光定量PCR儀中進行基因的PCR擴增，實驗重復(fù)三次。根據(jù)各組CT值，計算基因相對表達量=2-△△CT。

2 結(jié)果

2.1 篩選差異表達基因

篩選檢索內(nèi)容得到數(shù)據(jù)集GSE139038和GSE15852。其中GSE139038包含了41例患者和18個癌旁樣本。GSE15852包含43個癌組織及43個匹配的癌旁組織。GEO2R分析得到兩組差異表達基因和火山圖（校正P值Padj＜0.05），見圖1。將差異基因按|log2FC|＞2，P＜0.05再次進行篩選后，GSE139038得到差異基因526個。GSE15852得到差異基因57個。將二者差異基因用VENNY2.1.0取交集共得到差異基因27個，其中25個基因上調(diào)，2個基因下調(diào)（圖1）。

圖1 差異基因火山圖及交集差異基因

2.2 差異表達基因功能分析

將27個交集差異基因輸入DAVID6.8，BP顯示有關(guān)糖脂代謝的生物學(xué)過程有主要有“糖異生”“糖代謝過程”“脂質(zhì)代謝過程”“脂質(zhì)儲存”“脂肪酸生物合成過程”過程（表2）。參與這些生物學(xué)功能的基因主要有磷酸烯醇丙酮酸羧激酶1（PCK1）、視黃醇結(jié)合蛋白4（RBP4）、清道夫受體白細胞分化抗原36（CD36）、瘦素（LEP）、脂蛋白脂肪酶（LPL）、小窩蛋白-1（CAV1）、乙酰輔酶A羧化酶B（ACACB）。這些基因與糖脂代謝密切相關(guān)，可作為藥物干預(yù)的靶基因。PPI互作圖顯示LPL與LEP兩個節(jié)點之間的相互作用關(guān)系最為顯著，且位于網(wǎng)絡(luò)中心，與其他基因關(guān)聯(lián)度較高（圖2）。

圖2 糖脂代謝基因的PPI網(wǎng)絡(luò)分析

表2 生物學(xué)過程及基因名稱

2.3 CCK8藥物濃度篩選結(jié)果

鋪板后細胞生長狀態(tài)良好。細胞給藥干預(yù)24 h，48 h，72 h三個不同時間后CCK8結(jié)果顯示隨著給藥濃度升高，細胞增殖抑制效果越好。24 h、72 h時間點最高細胞增殖抑制率分別為28.23%、28.73%。48H處理組抑制細胞增殖的效果最為明顯，在400μg·mL-1時達到48.93%（圖3）。

圖3 CCK8細胞增殖抑制率結(jié)果

2.4 RT-qPCR表達結(jié)果

經(jīng)茯苓多糖給藥干預(yù)，處理組7個基因的相對表達量較對照組下調(diào)明顯，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）（圖4）。

圖4 藥物對基因表達的影響

3 討論

乳腺癌在女性好發(fā)的癌癥中極為常見，其特點為侵襲性高、易向周圍組織如淋巴組織、骨組織、肺組織轉(zhuǎn)移，從而使病情難于控制[11]。因此術(shù)后高轉(zhuǎn)移率和復(fù)發(fā)率成為危害女性健康的殺手。研究表明乳腺癌的發(fā)病機制主要與機體長期處于較高雌激素水平下刺激乳腺上皮細胞相關(guān)，家族史中有BRCA1、BRCA2等基因位點突變可明顯增加乳腺癌的發(fā)病機率[12]。研究表明肥胖是導(dǎo)致多種癌癥發(fā)病的重要危險因素，與癌癥的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系[13]。在乳腺癌患者體內(nèi)的腫瘤微環(huán)境中的脂肪組織與癌細胞相互交織[14]，使癌細胞更加利于利用代謝旺盛的營養(yǎng)物質(zhì)，加速供給癌細胞生長。同時，一些癌癥通路的激活進一步引起癌癥中關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子、蛋白水解酶以及信號分子的激活，加速了腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲。糖脂代謝中葡萄糖的代謝異常主要表現(xiàn)為Warburg效應(yīng)，脂質(zhì)的代謝異常包括脂質(zhì)的從頭合成與外部攝取。糖脂代謝異常引起的代謝重編程一直是腫瘤研究的熱點和核心，因此關(guān)注糖脂代謝基因的變化、探討有效藥物治療機制是當(dāng)前探索發(fā)掘乳腺癌治療的關(guān)鍵任務(wù)。

在本研究中，課題組運用GEO數(shù)據(jù)挖掘，使用GEO2R在線工具分析了GEO數(shù)據(jù)庫中的兩個乳腺癌患者的芯片數(shù)據(jù)集。經(jīng)過篩選后取兩數(shù)據(jù)集的交集差異表達基因，目的是為了尋找患者共性的差異基因，使差異基因的探討更具有意義。通過DAVID6.8對差異基因進行GO功能注釋選取生物學(xué)過程中與糖脂代謝相關(guān)的生物學(xué)功能，挖掘到相關(guān)的目的基因。BP中與糖脂代謝相關(guān)的基因主要有7個，在乳腺癌中的表達均上調(diào)，其中PCK1、LEP、LPL、CD36基因參與多個糖脂代謝過程中，說明這些基因從多方面多角度對糖脂代謝進行調(diào)節(jié)。因此抑制這些基因的表達對改善糖脂代謝水平、恢復(fù)細胞內(nèi)正常代謝活動是很有意義的。另外，在PPI結(jié)果中發(fā)現(xiàn)LPL與LEP兩個節(jié)點位于網(wǎng)絡(luò)中心位置，且存在明顯相互作用關(guān)系，可見其在糖脂代謝基因中的地位是非常重要的。

在本研究中發(fā)現(xiàn)基因PCK1是調(diào)節(jié)糖異生的主要控制點，由該基因編碼的胞漿酶與GTP一起催化草酰乙酸生成磷酸烯醇式丙酮酸，并釋放CO2和GTP。最新研究發(fā)現(xiàn)了其在肝癌細胞中參與脂代謝的重要作用[15]，從而將糖代謝與脂代謝聯(lián)系起來。肝癌細胞中的PCK1在Ser90位點磷酸化轉(zhuǎn)位到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，利用GTP作為磷酸供體，進而磷酸化INSIG1/2，破壞INSIG蛋白與固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（SREBPs）與護送蛋白（SCAP）的相互作用，SCAP-SREBPs向高爾基體移位，活化SREBPs并使下游脂肪合成相關(guān)基因發(fā)生轉(zhuǎn)錄，促進腫瘤的增殖。本研究中經(jīng)過茯苓多糖處理后的PCK1表達下降，其機制可能是抑制了PCK1磷酸化，干預(yù)了后續(xù)結(jié)合過程，其在乳腺癌細胞中的具體作用機制有待進一步研究證實?；騆EP是一種脂肪細胞相關(guān)激素，其水平在肥胖中明顯升高，在肥胖介導(dǎo)的癌癥中起關(guān)鍵作用。LEP已被證實它能通過調(diào)節(jié)脂肪組織質(zhì)量影響腫瘤細胞的生長，其表達與乳腺癌的發(fā)病率和生存率密切相關(guān)[16-17]。在脂質(zhì)代謝中LEP起同樣關(guān)鍵的作用，它能通過激活自噬及PI3K/AKT信號通路引起SREBP蛋白的表達增高，促進癌癥的遷移和侵襲[18-19]。LEP還在促進腫瘤細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化上發(fā)揮作用[20]。值得一提的是LEP受體LEPR（leptin receptor）在本研究數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)的乳腺癌組織中表達同樣升高，且有研究報道了其過度表達對乳腺癌的預(yù)后具有預(yù)測價值[21]。在本研究中經(jīng)藥物干預(yù)下調(diào)了LEP表達，在未來的研究中對其受體LEPR的抑制作用有待進一步驗證并探究具體的分子機制。小窩蛋白-1（CAV1）是一種致癌膜蛋白，與癌癥關(guān)系密切[22]。能參與細胞內(nèi)吞、細胞外基質(zhì)組織、膽固醇分布、細胞遷移并和信號傳導(dǎo)有關(guān)[23]。Wang Z等[24]研究發(fā)現(xiàn)樺木酸可通過調(diào)節(jié)Cav-1/NF-κB/c-Myc途徑抑制乳腺癌細胞株MCF-7和MD-MB-231中的有氧糖酵解，抑制乳酸產(chǎn)生、葡萄糖攝取和細胞外酸化率（ECAR），說明CAV1可作為治療有氧糖酵解的靶點。另外，CAV1能通過調(diào)控細胞周期、調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境（TME）等方式影響細胞增殖，還能通過調(diào)節(jié)凋亡途徑蛋白及誘導(dǎo)細胞自噬影響細胞凋亡[25]。脂肪酸受體CD36可運輸脂肪酸進入腫瘤細胞，是外源性脂質(zhì)調(diào)節(jié)的關(guān)鍵靶點，促進腫瘤生長和啟動轉(zhuǎn)移[26]。高脂肪飲食以CD36依賴的方式特異性地提高CD36+轉(zhuǎn)移起始細胞的轉(zhuǎn)移潛能。臨床上，CD36+轉(zhuǎn)移起始細胞的存在與許多類型的癌癥的不良預(yù)后相關(guān)[27]。Kwan Hiu-Yee[28]發(fā)現(xiàn)芹菜素通 過STAT3/CD36軸降 低STAT3磷酸 化、CD36和PPAR-γ的表達并抑制脂肪細胞分化進而抑制脂肪生成，為治療乳腺癌提供了新思路?；騆PL是胞外脂解的關(guān)鍵酶，有調(diào)節(jié)脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)的作用?；謴?fù)LPL的正常水平對改善脂質(zhì)代謝水平密切相關(guān)?；騌BP4在乳腺癌中的表達未見報道，但有研究報道關(guān)于血清中的RBP4參與新診斷2型糖尿病患者的糖脂代謝和胰島素抵抗作用機制[29]，筆者認為從糖脂代謝的角度出發(fā)探討以RBP4為靶點的乳腺癌的機制研究可能成為新的研究方向。有研究證實了基因ACACB與肥胖在糖尿病腎病的關(guān)系[30-31]，另有學(xué)者運用數(shù)據(jù)挖掘發(fā)現(xiàn)該基因與HER2+型乳腺癌腦轉(zhuǎn)移相關(guān)[32]，還將其用于新輔助化療的作用靶點[33]。

乳腺癌在中醫(yī)理論里稱為“乳巖”，在南宋時期的《婦人大全良方》中有關(guān)于此疾病的描述記載。乳腺癌的中醫(yī)病機是由憂郁思慮等情志所傷，肝、脾等臟腑功能失調(diào)，進而寒凝、痰聚、血瘀，久病之下，經(jīng)絡(luò)痞澀，聚結(jié)成核。另外，先天稟賦不足的陽虛體質(zhì)也易發(fā)生痰凝血瘀進而促進乳腺癌發(fā)生進展。人體內(nèi)水谷的運化失常導(dǎo)致的脾虛痰濁在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中表現(xiàn)為脂質(zhì)代謝異常。乳腺癌患者陽虛夾雜痰濕癌毒的情況與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中脂質(zhì)代謝異常引起的腫瘤微環(huán)境變化恰有相似之處[12]。因此，本研究從影響糖脂代謝基因的角度入手，利用溫陽補虛，化痰散結(jié)的治療原理來調(diào)節(jié)恢復(fù)患者體內(nèi)的氣血陰陽平衡。茯苓具有利水化痰、補脾固本的作用，在治療乳腺癌的中醫(yī)名方中極為常見。目前茯苓多糖抗腫瘤的功效已在抑制乳腺癌細胞增殖遷移方面進行了相關(guān)研究，但都只進行了單獨基因及個別通路的驗證，茯苓多糖抗腫瘤的機制研究還不夠完善，且關(guān)于影響代謝方面的研究仍不十分清楚。中藥對腫瘤微環(huán)境中癌細胞的抑制作用是多方面、多角度的[34]。本研究發(fā)掘驗證到的相關(guān)基因?qū)τ谏钊胩接戃蜍叨嗵侵委熑橄侔┑姆肿訖C制具有重要意義。

綜上所述，本研究挖掘GEO數(shù)據(jù)庫中的芯片數(shù)據(jù)，分析并聚焦了7個糖脂代謝差異基因，利用生物信息學(xué)分析工具發(fā)現(xiàn)基因LEP和LPL在糖脂代謝通路上發(fā)揮了重要作用。qPCR的結(jié)果證實經(jīng)茯苓多糖處理后乳腺癌細胞內(nèi)過度表達的糖脂代謝基因明顯下調(diào)。糖脂代謝基因的發(fā)掘驗證進一步完善了茯苓多糖干預(yù)糖脂代謝及疾病治療的分子機制，為更多中藥成分干預(yù)乳腺癌的發(fā)生發(fā)展及新藥靶點的創(chuàng)新研究提供了新的切入點。