王開喜，楊耀國，王永新，馬 春，張亞慧

（山西農(nóng)業(yè)大學 草業(yè)學院，山西 太谷 030801）

達烏里胡枝子是豆科多年生灌木，營養(yǎng)成分高，可制作青干草和優(yōu)質(zhì)青貯飼草料，是良好的水土保持植物和固沙植物[1]。達烏里胡枝子廣泛分布在我國的華北、東北和西北等地區(qū)，但這些地區(qū)往往是一些土壤鹽漬化地區(qū)[2]，因此，達烏里胡枝子生長時往往會遭受到鹽分等逆境脅迫。有研究表明，達烏里胡枝子在種子萌發(fā)和苗木早期生長發(fā)育階段均對鹽分脅迫敏感[3]，在高鹽脅迫下，達烏里胡枝子種子萌發(fā)率、發(fā)芽勢、種子強度和發(fā)芽指數(shù)都有明顯的下降；胚芽和胚根的高度和長度普遍變短[4]。所以，在鹽分脅迫下，胡枝子種子能否正常發(fā)芽是判斷植株在鹽堿環(huán)境能否正常生長的重要前提條件[5]。為了增加種子的抗逆性，人們通常對種子進行預處理[6]。所以，通過研究鹽脅迫條件下增高達烏里胡枝子種子活力的適宜浸種劑及其適宜的濃度，對達烏里胡枝子生產(chǎn)具有重要的實踐意義。

硫化氫（H2S）是近年來在野生動植物體中發(fā)現(xiàn)的第3種氣體信息分子，它不僅參與植物生長發(fā)育和生理代謝的調(diào)節(jié)，還可以提高植株對鹽脅迫[7-8]、干旱脅迫[9]等各種逆境的抵抗[10]。有研究表明，NaHS浸種預處理能顯著緩解NaCl脅迫（100 mmol/L）對苜蓿種子萌發(fā)和幼苗生長的抑制作用，并且可以提高根部K+/Na+的值，從而增強苜蓿對鹽脅迫的適應能力[11]。還有研究發(fā)現(xiàn)，硫氫化鈉能夠有效緩解鹽脅迫造成的水稻生長抑制，包括能緩解鹽脅迫對水稻根長、株高的抑制影響以及鹽脅迫下水稻生物量的減少，并且對水稻根系的形態(tài)建成有一定影響[12]。劉銳鋒等[13]研究表明，經(jīng)H2S加工過的麥類種子，在萌芽早期促使細胞分裂，可以有效促進種子的萌發(fā)。李東波等[14]研究表明，經(jīng)0～40 μmol/L濃度的NaHS水溶液浸種過的豌豆種子進行播種，能夠提高其胚根的生長發(fā)育，同時根尖邊緣細胞的存活率也明顯提高。王燕琴[15]研究表明，利用H2S促使內(nèi)源一氧化氮（NO）的生成來減緩鹽脅迫對紫花苜蓿種子萌發(fā)的抑制作用。鮑敬等[16]研究表明，相當含量的外源H2S可以減少NaCl脅迫對小麥種子萌發(fā)和幼苗生長發(fā)育的控制。對于外源H2S緩解鹽脅迫下達烏里胡枝子種子萌發(fā)的研究未見文獻報道。

本試驗以達烏里胡枝子為供試材料，通過直接用NaCl模擬鹽分脅迫抑制種子萌發(fā)，深入探究各種H2S濃度處理對鹽脅迫下達烏里胡枝子種子萌發(fā)和幼苗生長的影響，旨在為研究外源H2S在達烏里胡枝子耐逆培育中的合理使用提供幫助。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料為晉農(nóng)1號達烏里胡枝子，現(xiàn)儲存在山西農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院的種質(zhì)資源庫中。H2S的供體是硫氫化鈉。

1.2 試驗方法

試驗于2021年6月在山西農(nóng)業(yè)大學牧站草學實驗室內(nèi)完成。

1.2.1 鹽分脅迫的半致死濃度 選取籽粒飽滿、圓潤均一且整齊健壯的達烏里胡枝子種子，用1%的次氯酸鈉消毒滅菌10 min，蒸餾水清洗3遍后干燥備用。以NaCl水溶液模擬鹽分的脅迫，把種子擺放在墊有2層濾紙的培養(yǎng)皿中，分別加0、25、50、75、100、125、150、175、200 mmol/L NaCl溶 液4 mL（分別標記為Y0、Y25、Y50、Y75、Y100、Y125、Y150、Y175和Y200）。將培養(yǎng)皿放置于人工氣候箱（RCL-P1000）中，發(fā)芽溫度要求（25±2）℃，光/暗（16 h/8 h）交替培育，并且每天定量補充水分，保持培養(yǎng)皿中鹽含量的相對穩(wěn)定。每個處理50粒種子，每個處理4次重復。

1.2.2 NaHS處理達烏里胡枝子種子 種子的萌發(fā)試驗采用紙上發(fā)芽法完成。胡枝子種子消毒滅菌10 min，蒸餾水沖洗3遍，干燥后備用。設7個NaHS處理即0、25、50、100、200、400、800 μmol/L NaHS溶液（分別記為CKP（進行鹽脅迫）、T25、T50、T100、T200、T400和T800），在常溫及黑暗條件下浸種18 h，對照組（CKT，不進行鹽脅迫）用蒸餾水浸種18 h。分別選籽粒飽滿、圓潤均一且用不同濃度NaHS溶液浸種過的達烏里胡枝子種子50粒，擺入150 mmol/L NaCl溶液完全浸透的墊有2層濾紙的培養(yǎng)皿中，置于培養(yǎng)箱溫度（25±2）℃，光/暗（16 h/8 h）交替培育，進行發(fā)芽試驗10 d，每天定量補充水分。

1.3 測定指標及方法

發(fā)芽期間每天記錄種子的萌發(fā)數(shù)量，以胚根突破2 mm為標準；試驗進行第5天開始計算發(fā)芽勢，第10天統(tǒng)計并計算發(fā)芽率，共記錄10 d[17]。第10天完成發(fā)芽試驗后，在每個培養(yǎng)皿中隨機選取有代表性幼苗10株，用游標卡尺測量根長和苗高，然后分別算平均高度；再從每個培養(yǎng)皿中隨機選取代表性幼苗10株，用電子天平稱量新鮮質(zhì)量，然后完全浸入蒸餾水中6 h，稱量飽和鮮質(zhì)量，后在電熱恒溫干燥箱中105℃殺青30 min，在65℃下烘干至恒質(zhì)量，用電子天平稱量干質(zhì)量。

式中，Dn為發(fā)芽天數(shù)；n為每天新發(fā)芽的相應數(shù)量。

相對含水量=（鮮質(zhì)量—干質(zhì)量）/飽和鮮質(zhì)

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2007應用軟件開展大數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，用SPSS 22.0應用軟件進行單因素方差分析（ANOVA），用Origin 2021作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 達烏里胡枝子種子鹽脅迫的半致死濃度分析

由圖1可知，由于NaCl含量的增加，達烏里胡枝子種子的發(fā)芽率呈先升高后降低的趨勢。當NaCl濃度上升到25 mmol/L時，相比于Y0，有上升的態(tài)勢，表明了在0～25 mmol/L NaCl濃度處理下，能促進達烏里胡枝子種子的萌發(fā)。當NaCl濃度超過25 mmol/L時，種子萌發(fā)速率呈減少趨勢。150 mmol/L NaCl處理下的達烏里胡枝子種子發(fā)芽率約為Y0的1/2。因此，鹽脅迫半致死濃度150 mmol/L NaCl作為達烏里胡枝子種子萌發(fā)的鹽脅迫濃度。

圖1 鹽脅迫對達烏里胡枝子種子發(fā)芽率的影響Fig.1 Effects of salt stress on germination percentage of seeds of Lespedeza davurica

2.2 外源NaHS浸種對鹽脅迫下達烏里胡枝子種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢的影響

不同濃度NaHS浸種預處理對鹽脅迫下達烏里胡枝子種子的萌發(fā)具有不同程度的影響。從圖2可以看出，用NaHS浸種后達烏里胡枝子種子的發(fā)芽率相對于CKP均有所提高。在150 mmol/L NaCl脅迫下，50 μmol/L的NaHS可使達烏里胡枝子種子發(fā)芽率達到最高，為78.87%；而高濃度（800 μmol/L）NaHS的處理效果最差，發(fā)芽率僅為46.43%，略高于CKP，且差別不明顯。與CKP相比，同等施用濃度的NaHS處理均能提高種子的發(fā)芽率，大部分處理組合的發(fā)芽率顯著升高（P＜0.05），以50 μmol/L NaHS處理效果最佳。

圖2 外源H2S對鹽脅迫下達烏里胡枝子種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率的影響Fig.2 Effect of exogenous H2S on germination potential and germination percentage of seeds of Lespedeza davurica under salt stress

在150 mmol/L NaCl脅迫下達烏里胡枝子種子發(fā)芽勢顯著降低，是沒有鹽脅迫CKT處理的50.23%（P＜0.05）。不同濃度NaHS處理減緩了鹽脅迫對種子發(fā)芽勢的影響；且隨NaHS濃度的增加，達烏里胡枝子種子發(fā)芽勢呈先升高后降低的趨勢。50 μmol/L NaHS處理的種子發(fā)芽勢最高，和CKT最為相近。25、50、100、200、400 μmol/L NaHS處理都顯著緩解了鹽脅迫對種子發(fā)芽勢的影響，都與CKP之 間 差 異 顯 著（P＜0.05），800 μmol/L NaHS處理的發(fā)芽勢最低，且與CKP相比沒有顯著差異（P＞0.05）?？梢钥闯觯?0 μmol/L NaHS處理顯著緩解了鹽脅迫對達烏里胡枝子種子發(fā)芽勢的影響（P＜0.05），較CKP增加了34.07%。

2.3 外源NaHS浸種對鹽脅迫下達烏里胡枝子種子發(fā)芽指數(shù)和平均發(fā)芽時間的影響

由圖3可知，經(jīng)適宜濃度NaHS浸種后的達烏里胡枝子種子發(fā)芽指數(shù)均顯著高于對照組CKP（P＜0.05）。在脅迫條件下，50 μmol/L NaHS處理的種子發(fā)芽指數(shù)達到最高，比對照組CKP提高了37.54%；當NaHS濃度為400～800 μmol/L時，各處理間發(fā)芽指數(shù)與CKT相比差異不顯著。在強脅迫條件下，隨著NaHS濃度增加，種子發(fā)芽指數(shù)呈前升高后降低的趨勢，且均超過了對照組CKP，當NaHS濃度為50 μmol/L時，其發(fā)芽指數(shù)與對照組CKP差異最突出（P＜0.05），當NaHS濃度為25、100、200 μmol/L時，其發(fā)芽指數(shù)與對照CKP差別顯著（P＜0.05）。400、800 μmol/L NaHS處理的發(fā)芽指數(shù)與對照CKP差異不顯著。說明25、50、100、200 μmol/L NaHS均能不同程度地增高種子的發(fā)芽指數(shù)，且50 μmol/L NaHS處理效果最好。

圖3 外源H2S對鹽脅迫下達烏里胡枝子種子發(fā)芽指數(shù)和平均發(fā)芽時間的影響Fig.3 Effects of exogenous H2S on germination index and average germination time of seeds of Lespedeza davurica under salt stress

在鹽脅迫條件下，經(jīng)不同濃度NaHS處理后，達烏里胡枝子種子平均發(fā)芽時間與對照組CKP相比均縮短，與CKP差異顯著（P＜0.05），在25～800 μmol/L NaHS處理下，T25～T800處理間差異不顯著，說明在不同濃度NaHS處理下達烏里胡枝子的發(fā)芽時間基本一致；與CKP相比，NaHS處理的濃度范圍內(nèi)均縮短了發(fā)芽時間。

2.4 外源NaHS浸種對鹽脅迫下達烏里胡枝子幼苗相對含水量的影響

鹽分脅迫下，添加NaHS可提高達烏里胡枝子幼苗的相對含水量。從圖4可以看出，在150 mmol/L鹽脅迫下50 μmol/L NaHS處理下的相對含水量最高，為78.56%，與對照組（CKP）差異顯著（P＜0.05），800 μmol/L NaHS處理下效果最差。不同濃度NaHS處理下，其相對含水量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢；T25和T100～T400處理下與對照組CKP相比差異顯著（P＜0.05）；T800處理與對照組CKP間差異不顯著，說明在25～400 μmol/L NaHS濃度內(nèi)都顯著提高了達烏里胡枝子相對含水量，且以50 μmol/L NaHS處理效果最好。

圖4 外源H2S對鹽脅迫下達烏里胡枝子幼苗相對含水量的影響Fig.4 Effects of exogenous H2S on relative water content of Lespedeza davurica seedlings under salt stress

2.5 外源NaHS浸種對鹽脅迫下達烏里胡枝子幼苗苗高和根長的影響

由圖5可知，一定濃度NaHS可以提高達烏里胡枝子在鹽脅迫下的苗高和根長。在鹽脅迫條件下，經(jīng)25、50、100 μmol/L NaHS處理后，達烏里胡枝子幼苗高度和根長與對照組CKP相比均差異顯著（P＜0.05）；當NaHS濃度為25～100 μmol/L，幼苗高度比對照組CKP分別提高了15.24%、23.16%和16.37%（P＜0.05），幼苗根長比對照組CKP分別提高了11.64%、15.80%和13.17%；當NaHS濃度為200～800 μmol/L時，幼苗高度和根長與對照組CKP差異不顯著。因此，200～800 μmol/L NaHS浸種效果不佳；25～100 μmol/L NaHS浸種效果較明顯，且50 μmol/L NaHS效果最明顯。

圖5 外源H2S對鹽脅迫下達烏里胡枝子幼苗苗高和根長的影響Fig.5 Effects of exogenous H2S on seedling height and root length of Lespedeza davurica seedlings under salt stress

3 結(jié)論與討論

鹽分脅迫會不斷轉(zhuǎn)變?yōu)闈B透脅迫，影響活性氧代謝的同時也不斷使植株體內(nèi)離子失衡，使植株機體內(nèi)部的水分不能正常的保持，細胞膜透性的功能與結(jié)構(gòu)不斷遭到破壞，阻止植株的生長發(fā)育和繁殖，最終導致死亡[18]。在本試驗中，針對不同濃度NaCl處理對達烏里胡枝子種子產(chǎn)生相應的萌發(fā)機制可知，150 mmol/L NaCl脅迫的發(fā)芽率約為Y0的1/2（半致死濃度），因此，本試驗選擇了150 mmol/L作為本試驗的脅迫濃度。

有研究表明，外源H2S可以有效減緩鹽脅迫，它是一種氣體信號分子，可以提高植物對環(huán)境的耐受能力[19]。本試驗通過外源NaHS濃度倍增的方式來減緩達烏里胡枝子種子萌發(fā)和幼苗生長在鹽脅迫下的危害。發(fā)芽率、發(fā)芽勢反映出了種子萌發(fā)的同步程度和均勻程度[20]。本研究表明，不同濃度外源H2S處理在鹽脅迫下的發(fā)芽率、發(fā)芽勢存在差異，與CKT相比，鹽脅迫后的達烏里胡枝子種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢差異顯著并明顯下降；將種子經(jīng)過NaHS浸種預處理之后，達烏里胡枝子種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢均有不同程度的提高，25～400 μmol/L NaHS處理組的發(fā)芽率和發(fā)芽勢均顯著高于鹽脅迫下沒有經(jīng)H2S的處理組，說明低濃度的外源硫化氫對達烏里胡枝子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢有促進作用，而高濃度800 μmol/L NaHS處理促進作用不明顯，其中以50 μmol/L NaHS浸種預處理效果最好，也進一步說明低濃度的硫化氫可能促進種子內(nèi)部某種酶的活性或者提高了某種物質(zhì)的含量，還需要進一步的研究。這與外源H2S可以促進鹽脅迫下西葫蘆發(fā)芽的事實相符合[21]。

胡枝子種子的發(fā)芽指數(shù)與平均發(fā)芽時間綜合反映出了種子的生命力與萌發(fā)速率，是種子活力的大小和耐性的體現(xiàn)[22-23]。劉建新等[10]研究指出，外源H2S可以有效減緩鹽分脅迫，從而提高裸燕麥種子的發(fā)芽指數(shù)，減少了平均發(fā)芽時間。本試驗的研究結(jié)論也與此相符，不同外源H2S處理對種子的發(fā)芽指數(shù)影響差別明顯，與CKT相比，150 mmol/L NaCl濃度下達烏里胡枝子種子的發(fā)芽指數(shù)顯著降低，平均發(fā)芽時間延長，且經(jīng)NaHS浸種處理后，與CKP相比，T25～T200處理下的達烏里胡枝子種子發(fā)芽指數(shù)顯著提高。說明硫化氫緩解鹽脅迫的效果不僅與硫氫化鈉濃度有關，也產(chǎn)生相應的劑量效應機制。T25～T800處理則大大縮短了平均發(fā)芽時間，且無差異性。這可能是由于外源硫化氫在沒有濃度劑量效應的前提下，與鹽脅迫抗衡，觸發(fā)某種機制，縮短了平均發(fā)芽時間，還需要進一步的試驗論證。

胡枝子幼苗的相對含水量反映了植株體內(nèi)水分的多少，會因鹽脅迫的抑制而減少[24]，從而引起滲透脅迫。本研究表明，與CKT相比，鹽脅迫下未經(jīng)H2S處理的達烏里胡枝子幼苗相對含水量顯著下降（CKP），而用不同H2S處理后，T25～T200 H2S處理組均高于CKP且差異顯著，并且不同程度地提高了達烏里胡枝子幼苗的相對含水量，T50處理最佳。這與符姿[25]研究外源H2S和NO可以提高鹽脅迫下葦狀羊茅幼苗的相對含水量研究結(jié)論相同，說明經(jīng)過一定濃度H2S處理后，達烏里胡枝子幼苗可以維持相當?shù)乃?，減緩鹽脅迫的抑制并促進達烏里胡枝子幼苗正常的生長發(fā)育和繁殖。

苗高和根長在種子萌發(fā)過程中扮演著極其重要的角色，它們是反映幼苗生長發(fā)育與繁殖情況的重要衡量標準。本試驗表明，150 mmol/L NaCl處理后的種子幼苗苗高和根長都顯著下降，25、50、100 μmol/L NaHS處理可顯著緩解鹽脅迫對苗高和根長的傷害。李東波等[14]研究表明，經(jīng)0～40 μmol/L NaHS溶液浸種后，可以促進豌豆胚根的正常生長和發(fā)育，根尖細胞存活率也顯著提高；劉銳鋒等[13]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)50 μmol/L NaHS處理過的小麥種子，在萌發(fā)早期促進細胞分裂，可以有效促進種子的萌發(fā)和幼苗生長。本試驗結(jié)果與之相似，以50 μmol/L NaHS處理效果最佳。說明鹽脅迫對植物的生長具有抑制作用，表現(xiàn)為一系列代謝生理活動的變化最終形成外部形態(tài)的變化。但一系列的代謝生理活動需要后續(xù)的研究來支撐外部形態(tài)建成的變化。本試驗也進一步說明硫化氫緩解鹽脅迫的效果不僅與硫氫化鈉濃度有關，也產(chǎn)生相應的劑量效應機制。

本研究表明，在25～100 μmol/L NaHS浸種中均可以不同程度地減緩由150 mmol/L NaCl引起的達烏里胡枝子種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、平均發(fā)芽時間、相對含水量、根長和苗高產(chǎn)生的抑制作用，其中，50 μmol/L NaHS浸種預處理效果最佳。