馮 悅，李潤(rùn)植，崔紅利，薛金愛(ài)，張春輝

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所，山西 太谷 030801）

干旱脅迫和鹽脅迫會(huì)引起植物生理代謝功能紊亂，從而抑制植物生長(zhǎng)發(fā)育。干旱作為損害最大的非生物脅迫之一[1]，會(huì)引起植物葉片氣孔關(guān)閉、水分平衡失調(diào)及抗氧化酶活性降低，從而對(duì)植物器官造成潛在危害[2]，長(zhǎng)期嚴(yán)重的干旱脅迫會(huì)引起植物表觀形態(tài)不可逆的變化，最終導(dǎo)致其死亡[3]。鹽脅迫下，植物根系部分最先接收脅迫信號(hào)，繼而導(dǎo)致地上部分產(chǎn)生活性氧和有毒代謝物，同時(shí)抑制光合作用，最終導(dǎo)致細(xì)胞和整株植物死亡[4]，不同濃度鹽脅迫會(huì)降低植物幼苗苗高、根長(zhǎng)和鮮質(zhì)量[5]。作物種子萌發(fā)期是對(duì)逆境脅迫較為敏感的時(shí)期，使用有效的生物刺激素是提高作物抗逆能力的重要手段[6]。

外源氨基酸可作為生物刺激素調(diào)節(jié)作物生長(zhǎng)發(fā)育、增強(qiáng)作物抗逆性、提高作物產(chǎn)量、改善作物品質(zhì)[7]。同時(shí)，氨基酸也可作為生物活性類(lèi)增效物質(zhì)與肥料配合施用，發(fā)揮多重增效作用，其應(yīng)用日益廣泛[8]。此外，氨基酸浸種還能通過(guò)提高酶活性來(lái)促進(jìn)種子萌發(fā)[9]。其中，支鏈氨基酸（Branched-chain Amino Acids，BCAAs）因其特殊的側(cè)鏈結(jié)構(gòu)被命名，包括亮氨酸（Leu）、異亮氨酸（Ile）和纈氨酸（Val），在機(jī)體代謝過(guò)程中也發(fā)揮著重要作用。

亞麻薺是十字花科亞麻薺屬的1年生草本植物，有耐寒、耐旱、抗病、抗蟲(chóng)、耐草害等多種特性[10]。亞麻薺也是一種重要的油料作物，研究表明，其具有其他油料作物所缺少的耐貧瘠特性，適宜在半干旱、鹽漬土壤上種植。此外，由于亞麻薺籽油特定的脂肪酸組成并富含α-亞麻酸，在化妝品、醫(yī)學(xué)、食品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和生物能源等方面展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。種子萌發(fā)是植物生長(zhǎng)過(guò)程中的重要一環(huán)，種子發(fā)芽良好有利于后期幼苗生長(zhǎng)，同時(shí)也是獲得高產(chǎn)的第1步，因此，促進(jìn)亞麻薺種子萌發(fā)從而提高其產(chǎn)量尤為重要。然而，有關(guān)BCAAs緩解干旱和鹽脅迫下亞麻薺種子萌發(fā)的研究目前鮮有報(bào)道。

本研究通過(guò)探究BCAAs浸種對(duì)干旱和鹽脅迫下亞麻薺種子發(fā)芽勢(shì)、萌發(fā)率、發(fā)芽指數(shù)、根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)、干質(zhì)量和鮮質(zhì)量的影響，旨在為干旱和高鹽等逆境條件下亞麻薺的種植和栽培提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

亞麻薺種質(zhì)材料選用SC-N16，該品種已在山西省太谷區(qū)連續(xù)種植7 a，現(xiàn)存于分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所實(shí)驗(yàn)室。支鏈氨基酸購(gòu)自索萊寶公司，使用分析純NaCl模擬鹽脅迫、分析純PEG-6000模擬干旱脅迫。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 脅迫模型的建立 選取籽粒飽滿、均勻一致的亞麻薺種子，75%乙醇消毒后，用無(wú)菌水沖洗4～5次。參考車(chē)代弟等[11]的研究方法，分別以0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 g/mL的PEG-6000溶液（簡(jiǎn)稱(chēng)PEG）為處理液浸泡亞麻薺種子模擬干旱脅迫條件。參考孫元新等[12]的研究方法，分別以50、100、150、200 mmol/L的NaCl溶液（簡(jiǎn)稱(chēng)NaCl）為處理液浸泡亞麻薺種子模擬鹽脅迫條件，對(duì)照組為無(wú)菌水浸泡的種子，在萌發(fā)第7天時(shí)，測(cè)定其萌發(fā)率，以此作為標(biāo)準(zhǔn)。

采用培養(yǎng)皿紙上發(fā)芽法萌發(fā)種子。取直徑為9 cm的培養(yǎng)皿，在培養(yǎng)皿底部放置3層濾紙，加入處理液6 mL使濾紙吸液至飽和，在每個(gè)培養(yǎng)皿中整齊擺放50粒種子置于人工氣候箱中培養(yǎng)（25℃、光周期12 h/12 h）。每隔24 h對(duì)萌芽的種子計(jì)數(shù)一次，萌發(fā)7 d。試驗(yàn)結(jié)束后，以直尺測(cè)定種子的根和芽長(zhǎng)度，并計(jì)算種子各項(xiàng)萌發(fā)指標(biāo)，重復(fù)3次。

式中，Gt表示發(fā)芽試驗(yàn)終期內(nèi)每日發(fā)芽數(shù)，Dt表示發(fā)芽天數(shù)。

1.2.2 外源支鏈氨基酸（BCAAs）的篩選 在上述試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)選定的脅迫條件，通過(guò)測(cè)定其萌發(fā)率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)、干質(zhì)量和鮮質(zhì)量篩選最優(yōu)BCAAs-Val，具體方法如表1所示。

表1 外源支鏈氨基酸的篩選方法Tab.1 Screening methods for exogenous branched chain amino acids

1.2.3 最優(yōu)濃度的Val篩選 為確定最優(yōu)BCAAs-Val的最佳濃度，進(jìn)一步擴(kuò)大Val的處理范圍以精確濃度。在干旱脅迫（0.20 g/mL PEG）和鹽脅迫（150 mmol/L NaCl）2個(gè)條件下，選取濃度為0、10、50、100、150、200 μmol/L的Val溶液浸種進(jìn)行亞麻薺種子萌發(fā)試驗(yàn)，從而確定其最佳濃度。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用Sigmaplot數(shù)據(jù)系統(tǒng)作圖，采用SPSS分析差異顯著性（P＜0.05）。數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)的均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫和鹽脅迫模型建立

從表2可以看出，采用0.05～0.25 g/mL PEG和0～200 mmol/L NaCl處理后，亞麻薺種子的發(fā)芽勢(shì)、萌發(fā)率隨濃度升高呈顯著下降趨勢(shì)（P＜0.05），直至完全抑制。其中，采用0.20 g/mL PEG處理后，亞麻薺種子發(fā)芽勢(shì)和萌發(fā)率較CK分別降低了79.07%和75.00%；當(dāng)NaCl濃度為150 mmol/L時(shí)，亞麻薺種子發(fā)芽勢(shì)和萌發(fā)率較CK分別降低了58.49%和46.67%；而0.25 g/mL PEG和200 mmol/L NaCl處理下萌發(fā)率為0，即種子萌發(fā)完全被抑制。綜合考慮，脅迫模型處理液濃度需能顯著抑制但又不能完全損害種子萌發(fā)的能力。因此，選取0.20 g/mL PEG溶液構(gòu)建亞麻薺種子干旱脅迫模型、150 mmol/L NaCl溶液構(gòu)建亞麻薺種子的鹽脅迫模型。

表2 脅迫處理對(duì)亞麻薺種子萌發(fā)的影響Tab.2 Effects of stress treatment on Camelina sativa seed germination %

2.2 干旱和鹽脅迫下BCAAs篩選結(jié)果

2.2.1 干旱脅迫下BCAAs對(duì)亞麻薺種子萌發(fā)及生長(zhǎng)的影響 由表3可知，與CK相比，干旱脅迫下（PEG）亞麻薺種子的發(fā)芽勢(shì)、萌發(fā)率和發(fā)芽指數(shù)顯著降低（P＜0.05），分別降低了86.18%、66.17%和81.87%。與干旱脅迫（PEG）相比，PEG+BCAAs處理均顯著緩解了干旱脅迫對(duì)亞麻薺種子萌發(fā)的抑制作用（P＜0.05），其中，Val濃度為100 μmol/L時(shí)效果最好，此時(shí)亞麻薺種子的發(fā)芽勢(shì)、萌發(fā)率和發(fā)芽指數(shù) 分別是PEG組的2.65倍、1.35倍 和2.07倍。

表3 干旱脅迫下BCAAs對(duì)亞麻薺萌發(fā)的影響Tab.3 Effects of BCAAs on the germination of Camelina sativa under drought stress

從表4可以看出，干旱脅迫下（PEG）亞麻薺種子的根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)、干質(zhì)量和鮮質(zhì)量較CK相比顯著降低（P＜0.05），降幅分別為30%、37.31%、48.66%和30.46%；與干旱脅迫（PEG）相比，PEG+BCAAs處理緩解了干旱脅迫對(duì)亞麻薺種子生長(zhǎng)的影響，其中，100 μmol/L的Val處理后亞麻薺的根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)、干質(zhì)量和鮮質(zhì)量是PEG的1.09倍、1.19倍、1.17倍和1.05倍。

表4 干旱脅迫下BCAAs對(duì)亞麻薺種子生長(zhǎng)的影響Tab.4 Effects of BCAAs on the growth of Camelina sativa seeds under drought stress

2.2.2 鹽脅迫下BCAAs對(duì)亞麻薺種子萌發(fā)及生長(zhǎng)的影響 鹽脅迫下BCAAs對(duì)亞麻薺種子萌發(fā)及生長(zhǎng)的影響如表5、6所示。

表5 鹽脅迫下BCAAs對(duì)亞麻薺萌發(fā)的影響Tab.5 Effects of BCAAs on the germination of Camelina sativa under salt stress

與CK相比，鹽脅迫下（NaCl）亞麻薺種子的發(fā)芽勢(shì)、萌發(fā)率和發(fā)芽指數(shù)顯著降低，分別降低了38.13%、34.12%和33.96%（表5）；與鹽脅迫（NaCl）相比，NaCl+BCAAs處理均顯著緩解了鹽脅迫對(duì)亞麻薺種子萌發(fā)的抑制作用（P＜0.05），其中，Val濃度為100 μmol/L時(shí)效果最好，此時(shí)亞麻薺種子發(fā)芽勢(shì)、萌發(fā)率和發(fā)芽指數(shù)分別是NaCl鹽脅迫的1.37倍、1.30倍 和1.49倍。

從表6可以看出，與CK相比，鹽脅迫下（NaCl）亞麻薺種子的根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)、干質(zhì)量和鮮質(zhì)量顯著降低（P＜0.05），降幅分別為50.40%、38.89%、37.69%和15.37%；與鹽脅迫（NaCl）相比，NaCl+BCAAs處理進(jìn)一步緩解了鹽脅迫對(duì)亞麻薺種子生長(zhǎng)的影響，其中，100 μmol/L的Val處理后效果最好，亞麻薺種子根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)、干質(zhì)量和鮮質(zhì)量分別是NaCl鹽 脅 迫 處 理 的1.15倍、1.39倍、1.27倍和1.08倍。

表6 鹽脅迫下BCAAs對(duì)亞麻薺種子生長(zhǎng)的影響Tab.6 Effects of BCAAs on the growth of Camelina sativa seeds under salt stress

2.3 干旱和鹽脅迫下Val濃度篩選結(jié)果

2.3.1 干旱脅迫下不同濃度Val對(duì)亞麻薺種子萌發(fā)及生長(zhǎng)的影響 由圖1可知，不同濃度Val對(duì)干旱條件下亞麻薺種子萌發(fā)的緩解作用是不同的，隨Val濃度的增大，干旱脅迫下Val對(duì)亞麻薺種子萌發(fā)的緩解作用呈先上升后下降的趨勢(shì)；當(dāng)Val濃度為100 μmol/L時(shí)，亞麻薺種子的萌發(fā)率效果最好，與干旱脅迫相比，萌發(fā)結(jié)束時(shí)（7 d）萌發(fā)率提高了375.46%。

圖1 干旱脅迫下不同濃度Val對(duì)亞麻薺種子萌發(fā)的影響Fig.1 Effects of different concentrations of Valine on the germination of Camelina sativa seeds under drought stress

如表7所示，與CK相比，干旱脅迫下（PEG）亞麻薺種子的根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)、干質(zhì)量和鮮質(zhì)量顯著降低（P＜0.05），降幅分別為36.25%、36.06%、53.41%和32.01%；與干旱脅迫相比，100 μmol/L Val處理緩解了干旱脅迫對(duì)亞麻薺種子生長(zhǎng)的影響，亞麻薺種子的根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)、干質(zhì)量和鮮質(zhì)量增幅分別為19.61%、30.77%、28.66%和9.53%。

表7 干旱脅迫下不同濃度Val對(duì)亞麻薺種子生長(zhǎng)的影響Tab.7 Effects of different concentration of Valine on the growth of Camelina sativa seeds under drought stress

2.3.2 鹽脅迫下不同濃度Val對(duì)亞麻薺種子萌發(fā)及生長(zhǎng)的影響 不同濃度Val對(duì)鹽脅迫條件下亞麻薺種子萌發(fā)的緩解作用是不同的（圖2）。隨著Val濃度的增大，鹽脅迫下Val對(duì)亞麻薺種子萌發(fā)的促進(jìn)效果呈先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)Val濃度為100 μmol/L時(shí)，亞麻薺種子的萌發(fā)率效果最好，萌發(fā)結(jié)束時(shí)（7 d）較NaCl鹽脅迫提高了29.77%。

圖2 鹽脅迫下不同濃度Val對(duì)亞麻薺種子萌發(fā)的影響Fig.2 Effects of different concentrations of Valine on the germination of Camelina sativa seeds under salt stress

由表8可知，鹽脅迫下（NaCl）亞麻薺種子的根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)、干質(zhì)量和鮮質(zhì)量較CK相比顯著降低（P＜0.05），降 幅 分 別 為54.40%、38.89%、37.69%和15.37%；與鹽脅迫相比，100 μmol/L Val處理緩解了鹽脅迫對(duì)亞麻薺種子生長(zhǎng)的影響，且效果最好，亞麻薺種子的根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)、干質(zhì)量和鮮質(zhì)量增幅分別為21.05%、38.63%、27.14%和7.83%。

表8 鹽脅迫下不同濃度Val對(duì)亞麻薺種子生長(zhǎng)的影響Tab.8 Effects of different concentrations of Valine on the growth of Camelina sativa seeds under salt stress

3 結(jié)論與討論

種子萌發(fā)期是形態(tài)建成的關(guān)鍵時(shí)期，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑通過(guò)協(xié)調(diào)或者拮抗作用可促進(jìn)種子萌發(fā)[13]。發(fā)芽勢(shì)表明了種子發(fā)芽的整齊程度和發(fā)芽潛力，萌發(fā)率則反映了種子發(fā)芽狀態(tài)[13]。本研究的目的是在脅迫下使用外源生物刺激素BCAAs促進(jìn)種子萌發(fā)。干旱和鹽脅迫是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的主要逆境因素。鄒成林等[14]研究認(rèn)為，干旱脅迫能延緩玉米種子發(fā)芽時(shí)間，損害其發(fā)芽能力，降低貯藏物質(zhì)運(yùn)轉(zhuǎn)率。陳葉等[15]和于愛(ài)明[16]選用PEG模擬干旱條件研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫明顯抑制了鮮卑花和胡盧巴種子的萌發(fā)及生長(zhǎng)。本研究也表明，隨著PEG濃度的升高，亞麻薺種子的發(fā)芽勢(shì)和萌發(fā)率均隨之降低，其中PEG質(zhì)量濃度為0.2 g/mL時(shí)能顯著抑制亞麻薺種子的萌發(fā)但又不完全損害其發(fā)芽能力。鹽脅迫也是作物栽培經(jīng)常遇到的脅迫[17]。董夢(mèng)宇等[18]研究指出，隨鹽濃度的增加，根長(zhǎng)、莖長(zhǎng)、總長(zhǎng)和含水量則呈下降趨勢(shì)。桂毓[19]研究發(fā)現(xiàn)，隨鹽濃度的增加，苜蓿和沙冬青種子的發(fā)芽勢(shì)、萌發(fā)率、根系長(zhǎng)度、植株鮮質(zhì)量等指標(biāo)均呈逐漸下降的趨勢(shì)。以上研究均選用NaCl模擬鹽脅迫，脅迫所用濃度均為150 mmol/L，與本研究所用濃度一致。本研究也表明，隨著NaCl濃度的升高，亞麻薺種子的發(fā)芽勢(shì)和萌發(fā)率均呈逐漸下降的趨勢(shì)直至完全致死，其中下降程度最大且不完全致死的NaCl濃度為150 mmol/L。據(jù)此，本研究建立的干旱和鹽脅迫模型分別為0.2 g/mL PEG和150 mmol/L NaCl。

在逆境中，植物不能維持體內(nèi)的離子平衡，導(dǎo)致代謝功能紊亂，生長(zhǎng)受到抑制，從而造成種子萌發(fā)率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)降低。通過(guò)添加外源赤霉素，板藍(lán)根種子的萌芽能力和幼苗生長(zhǎng)均得到了一定程度的緩解[20]。鄭云鳳等[21]研究發(fā)現(xiàn)，甜菜堿、赤霉素等外源物浸種可以顯著緩解干旱脅迫對(duì)歐報(bào)春種子萌發(fā)的抑制作用。此外，支鏈氨基酸分解代謝可用于脂肪合成以及相關(guān)代謝分子的積累，種子萌發(fā)過(guò)程中需要將富含的脂肪酸轉(zhuǎn)化為糖類(lèi)和蛋白質(zhì)等有機(jī)物。蘭大偉[22]研究表明，添加支鏈氨基酸能部分恢復(fù)丙酯草醚對(duì)牛繁縷植株的抑制。本研究發(fā)現(xiàn)，適宜濃度的BCAAs浸種能夠緩解干旱和鹽脅迫對(duì)于亞麻薺種子萌發(fā)的抑制作用，其中，100 μmol/L Val在干旱脅迫和鹽脅迫下均對(duì)亞麻薺種子萌發(fā)的緩解效果最好。Val作為一種BCAAs，其降解代謝產(chǎn)物參與脂肪酸的合成及油脂積累，推測(cè)干旱脅迫和鹽脅迫下，Val浸種能提高亞麻薺種子萌發(fā)過(guò)程所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量，從而促進(jìn)種子萌發(fā)；此外，Val還可經(jīng)過(guò)代謝轉(zhuǎn)變?yōu)殓牾oA進(jìn)入三羧酸循環(huán)，推測(cè)Val浸種也能通過(guò)參與三羧酸循環(huán)提供種子萌發(fā)過(guò)程所需的能量，進(jìn)一步促進(jìn)干旱脅迫和鹽脅迫下的種子萌發(fā)。

本研究通過(guò)篩選不同濃度PEG和NaCl下的亞麻薺種子發(fā)芽不致死的最低發(fā)芽勢(shì)和萌發(fā)率，建立了0.2 g/mL PEG和150 mmol/L NaCl的模擬干旱和鹽脅迫模型。在干旱和鹽脅迫模型下，通過(guò)10、50、100 μmol/L的Leu、Val和Ile等3種BCAAs浸種處理，發(fā)現(xiàn)3種BCAAs都能改善亞麻薺種子的發(fā)芽能力，其中，100 μmol/L Val效果最好，能提高脅迫下亞麻薺種子萌發(fā)的發(fā)芽勢(shì)、萌發(fā)率、根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)、干質(zhì)量和鮮質(zhì)量。為進(jìn)一步確定BCAAs-Val的最優(yōu)濃度，擴(kuò)大干旱和鹽脅迫模型下Val濃度為10、50、100、150、200 μmol/L，結(jié)果仍為100 μmol/L的Val處理效果最優(yōu)。本研究首次報(bào)道纈氨酸（Val）能顯著促進(jìn)干旱和鹽脅迫下亞麻薺種子的萌發(fā)，為逆境條件下亞麻薺的種植和栽培提供了理論依據(jù)。