張超，李小鵬，張傳寶(北京醫(yī)院 國家老年醫(yī)學(xué)中心 國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗(yàn)中心 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院老年醫(yī)學(xué)研究院，北京 100730)

半胱氨酸蛋白酶抑制劑C(cystatin C，CysC)亦稱作γ-微量蛋白，廣泛存在于各組織細(xì)胞中。CysC由122個(gè)氨基酸殘基組成，是一種低分子量、堿性非糖化蛋白質(zhì)，由20號(hào)染色體短臂上的管家基因CST3編碼，產(chǎn)生速率恒定[1]。循環(huán)中的CysC僅經(jīng)腎小球?yàn)V過，并在近曲小管被重吸收，而后被完全代謝分解，因此，其血中濃度由腎小球?yàn)V過率(glomeruar filtration rate，GFR)決定，而不受諸如性別、年齡、體重、炎癥等外在因素的影響，故而是一種反映GFR變化的理想內(nèi)源性標(biāo)志物[2]。盡管已有血清尿素(Urea)、肌酐(creatinine，Cr)等反映腎功能的指標(biāo)，但研究表明，CysC是較血清Urea、Cr更靈敏和特異的指標(biāo)[3]。正常情況下，CysC在血中的濃度為0.51～1.09 mg/L。當(dāng)腎功能受損時(shí)，CysC在血液中的濃度隨GFR變化而變化[4-5]。

CysC當(dāng)前沒有應(yīng)用于臨床檢驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，而用于室間質(zhì)量評(píng)價(jià)(EQA)計(jì)劃的質(zhì)控品需要購買。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)于臨床檢驗(yàn)的意義是能夠讓測(cè)量“有源可溯”；EQA則是通過對(duì)質(zhì)控品回報(bào)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)、分析，發(fā)現(xiàn)臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)存在的不足，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性；而這些都是實(shí)現(xiàn)臨床檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確、可比、互認(rèn)的前提。然而，傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和質(zhì)控品制備原料主要依賴血清，其量產(chǎn)、種類、濃度水平、穩(wěn)定性及來源均受到極大限制。近年來基因工程蛋白質(zhì)重組技術(shù)迅猛發(fā)展，重組蛋白在藥物研發(fā)、疫苗研發(fā)、蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)解析、蛋白質(zhì)功能研究等領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。故本研究擬利用基因工程蛋白質(zhì)重組技術(shù)，體外表達(dá)純化CysC，為制備臨床可用的CysC標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和質(zhì)控品奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料 DH5α克隆感受態(tài)及BL21表達(dá)感受態(tài)購自北京擎科公司；質(zhì)粒pET-28a(+)由清華大學(xué)結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心惠贈(zèng)。限制性核酸內(nèi)切酶NcoⅠ、XhoⅠ、MluⅠ以及T4 DNA連接酶購自NEB公司。質(zhì)粒提取試劑盒及DNA凝膠回收試劑盒購自北京天根公司。LB培養(yǎng)基、卡那霉素、異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、咪唑等均購自Sigma公司。CysC檢測(cè)試劑盒購自北京萬泰公司。DNA電泳儀購自北京市六一儀器廠；蛋白質(zhì)電泳儀購自美國Bio-Rad公司；PCR儀購自美國ABI公司；Ni-NTA鎳離子親和樹脂購自美國Qiagen公司；鎳離子親和層析柱購自上海生工公司；超聲細(xì)胞破碎儀購自上海力辰邦西公司；7180全自動(dòng)生化分析儀購自日立公司。

1.2CysC基因合成 從NCBI數(shù)據(jù)庫檢索獲得人CysC編碼序列(ID：1471)，用Codon Adaptation Tool依據(jù)大腸桿菌密碼子偏好進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后序列委托擎科公司基因合成。因CysC有一段信號(hào)肽序列，為避免切割信號(hào)肽時(shí)將標(biāo)簽切除，在本研究中將這段78 bp的信號(hào)肽序列刪除。

1.3原核表達(dá)載體構(gòu)建 基因合成時(shí)在N端增加NcoⅠ酶切位點(diǎn)，C端增加XhoⅠ酶切位點(diǎn)。將雙酶切片段插入pET-28a(+)載體，T4 DNA連接酶連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)，利用Kan+抗性篩選，通過菌落PCR及酶切對(duì)陽性克隆進(jìn)行鑒定，初步鑒定成功的菌液提取得到6×His-CysC-pET質(zhì)粒，進(jìn)一步測(cè)序鑒定。

1.4重組CysC表達(dá) 將構(gòu)建好的6×His-CysC-pET轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.coliBL21感受態(tài)，挑取單菌落接種至5 mL LB培養(yǎng)基37 ℃搖床培養(yǎng)過夜。以1∶250體積比將菌液接種至250 mL LB培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)至A600 nm=0.6～0.8，向培養(yǎng)基中加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，37 ℃ 160 r/min誘導(dǎo)6 h。所有誘導(dǎo)后的菌液5 000×g離心5 min收集菌體，菌體重懸于20 mL蛋白質(zhì)裂解液(50 mmol/L Na3PO4，pH 8.0，150 mmol/L NaCl)中，冰浴條件下用超聲細(xì)胞破碎儀超聲15 min(超聲2 s，間隔3 s)破碎裂解菌體，裂解產(chǎn)物5 000×g、4 ℃離心15 min，分離上清液與沉淀。

1.5重組CysC表達(dá)條件優(yōu)化 將6×His-CysC-pET表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌E.coliBL21感受態(tài)。先選取2個(gè)常用溫度16、37 ℃和常用IPTG濃度0.5 mmol/L，將菌體超聲破碎后離心取上清液，再將沉淀溶于高鹽裂解液離心后取上清液。上清液及沉淀與鎳柱Ni-NTA親和層析，20 mmol/L咪唑清洗非特異性結(jié)合，250 mmol/L咪唑洗脫的蛋白液經(jīng)SDS-PAGE電泳。進(jìn)一步在0.5 mmol/L IPTG 180 r/min前提下，16、20、30、37 ℃條件下誘導(dǎo)6 h；確定最佳誘導(dǎo)溫度后，在0.1、0.2、0.4、0.5 mmol/L的IPTG，37 ℃ 160 r/min的條件下誘導(dǎo)6 h，以獲得重組CysC誘導(dǎo)表達(dá)最優(yōu)的溫度與IPTG濃度。

1.6重組CysC純化 將裂解上清液與2 mL Ni-NTA親和樹脂在4 ℃充分混勻2 h，用20 mmol/L咪唑清洗非特異性結(jié)合，最后用250 mmol/L咪唑洗脫重組人6×His-CysC蛋白。

1.7重組CysC檢測(cè) 用日立7180全自動(dòng)生化分析儀及CysC檢測(cè)試劑盒(萬泰公司)檢測(cè)重組CysC。

2 結(jié)果

2.1構(gòu)建CysC原核表達(dá)載體CysC基因插入于NcoⅠ和XhoⅠ兩酶切位點(diǎn)之間，并在N端融合了6×His標(biāo)簽，用于CysC蛋白的親和純化。經(jīng)硫酸卡那霉素篩選的單克隆菌落，經(jīng)搖菌后提純質(zhì)粒用XhoⅠ和MluⅠ酶切后得到1 100 bp左右的片段(圖1)，證實(shí)插入成功。將質(zhì)粒送測(cè)序鑒定以證實(shí)基因序列的正確性，經(jīng)DNAMAN軟件對(duì)比編碼CysC蛋白的堿基序列完全正確，表明6×His-CysC-pET原核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 原核表達(dá)質(zhì)粒6×His-CysC-pET酶切后的瓊脂糖電泳結(jié)果

2.2檢測(cè)6×His-CysC-pET28a(+)是否表達(dá) 如圖2所示，在親和純化產(chǎn)物中清晰可見相對(duì)分子質(zhì)量約15 000電泳條帶，大小與預(yù)期的6×His-CysC-pET相符，表明重組CysC蛋白誘導(dǎo)表達(dá)成功。同時(shí)可以看到,蛋白質(zhì)表達(dá)既有可溶蛋白質(zhì)也有沉淀蛋白質(zhì)，當(dāng)溫度升高時(shí)(37 ℃)可溶蛋白質(zhì)減少，包涵體蛋白質(zhì)增加，可能溫度升高蛋白質(zhì)合成加速，故而大部分蛋白質(zhì)來不及準(zhǔn)確折疊而形成包涵體蛋白質(zhì)，故在低溫下誘導(dǎo)表達(dá)較好，且表達(dá)量也較高。因包涵體蛋白質(zhì)在純化時(shí)為變性純化，需要復(fù)性，考慮到蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，選擇后續(xù)純化上清液中的可溶蛋白。

圖2 不同條件下上清液和沉淀中CysC的純化產(chǎn)物

2.3重組6×His-CysC-pET28a(+)誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化 最佳誘導(dǎo)溫度和IPTG濃度結(jié)果見圖3。在16、20、30、37 ℃條件下，160 r/min誘導(dǎo)6 h，CysC濃度變化不大，但在20 ℃時(shí)相對(duì)表達(dá)最高，故最佳誘導(dǎo)溫度取20 ℃；在0.1、0.2、0.4、0.5 mmol/L IPTG，20 ℃ 160 r/min的條件下誘導(dǎo)6 h，IPTG濃度為0.1和0.2 mmol/L時(shí)，CysC表達(dá)量最高，考慮到IPTG濃度越高毒性也越大，故選取0.1 mmol/L為IPTG誘導(dǎo)的最優(yōu)濃度。

圖3 不同誘導(dǎo)條件下裂解產(chǎn)物上清純化后SDS-PAGE電泳結(jié)果

2.4重組CysC稀釋后與稀釋倍數(shù)間呈現(xiàn)線性關(guān)系 將從250 mL菌液中純化的3 mL CysC蛋白樣品原液，用ddH2O稀釋40、50、100、200、400等不同倍數(shù)，在日立7180全自動(dòng)生化分析儀，用常規(guī)膠乳免疫比濁法分別測(cè)定不同稀釋濃度下的數(shù)值分別為60.51、47.80、21.30、10.56、4.41 mg/L。以稀釋倍數(shù)的倒數(shù)為橫坐標(biāo)，測(cè)定濃度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并添加回歸方程計(jì)算R2值。如圖4所示，CysC純品蛋白稀釋倍數(shù)與測(cè)點(diǎn)值之間呈現(xiàn)線性關(guān)系，提示純化蛋白質(zhì)不僅能夠被臨床檢測(cè)，且符合線性關(guān)系。

圖4 稀釋倍數(shù)與測(cè)定值之間線性關(guān)系

3 討論

CysC在腎功能評(píng)價(jià)方面較之Cr具有無可比擬的優(yōu)勢(shì)，研究證實(shí)CysC是優(yōu)于Cr的內(nèi)源性標(biāo)記物。Cr清除率測(cè)定受體表面積、肌肉量等因素影響，對(duì)于肌肉含量較少的嬰幼兒來說，Cr很難準(zhǔn)確監(jiān)測(cè)GFR的輕微變化，而CysC在出生數(shù)月后水平即可與成人相當(dāng)且血漿濃度穩(wěn)定，故CysC是評(píng)價(jià)嬰幼兒GFR更為理想的標(biāo)志物。還有研究認(rèn)為，CysC在腎移植術(shù)后對(duì)檢測(cè)腎小球?yàn)V過率而言，比Cr和Cr清除率都敏感，可以快速診斷出急性排斥反應(yīng)或藥物治療可能造成的腎損害[6-7]。CysC不僅應(yīng)用于腎臟功能的臨床診斷，在糖尿病、心血管疾病、肝硬化、妊娠高血壓、先兆子癇等臨床診療中均有重要意義。CysC檢出糖尿病腎病的特異性可達(dá)100%[8]；當(dāng)Cr還處于正常水平時(shí)CysC就可提示GFR輕度下降，而GFR輕度下降與血同型半胱氨酸(Hcy)之間存在顯著相關(guān)，而血Hcy是冠狀動(dòng)脈疾病的獨(dú)立因素[9-10]；肝硬化伴腎功能損傷時(shí)血漿體積明顯降低，因此早期發(fā)現(xiàn)患者腎功能受累極其重要，可防止肝腎綜合征的發(fā)生[11]。

如此重要的臨床診療指標(biāo)必然要求其檢測(cè)的準(zhǔn)確性，然而截至目前CysC卻并沒有標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，沒有標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)就意味著全國成千上百的臨床實(shí)驗(yàn)室使用不同儀器、方法、試劑所檢測(cè)的數(shù)值無法溯源到同一個(gè)源頭。傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和質(zhì)控品的原料來源于人血漿，面臨取材困難、成本高昂、倫理等諸多問題，體外純化CysC則可很好地避開這些問題，獲得CysC純品蛋白且能夠被臨床儀器檢測(cè)，是開發(fā)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和質(zhì)控品的前提。結(jié)果證實(shí)所構(gòu)建的去掉信號(hào)肽編碼序列的CysC能夠順利被臨床檢測(cè)儀器所檢出，確定了重組CysC的代表性序列。體外純化的CysC蛋白即便在稀釋400倍時(shí)濃度仍然可達(dá)到4.41 mg/L，遠(yuǎn)高于CysC在血中的正常濃度。1次搖菌250 mL約可純化3 mL CysC原液，稀釋后即可獲得濃度為5～20 mL/L、規(guī)格為1 mL的質(zhì)控品300～1 200支。由此可見，借助基因工程技術(shù)確實(shí)可快速、高效生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和質(zhì)控品。從實(shí)際應(yīng)用和經(jīng)濟(jì)效益出發(fā)，以目前開展室間質(zhì)量評(píng)價(jià)計(jì)劃的CysC項(xiàng)目為例，2021年參加實(shí)驗(yàn)室數(shù)量為1 716家，并且數(shù)量逐年增長，按現(xiàn)行購買價(jià)格每年成本費(fèi)用接近百萬。本項(xiàng)研究不但可以節(jié)省開支，降低全國EQA成本，同時(shí)還可提高對(duì)臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)質(zhì)量的管理水平，縮小實(shí)驗(yàn)室之間的檢測(cè)偏倚，提高室間質(zhì)量評(píng)價(jià)結(jié)果的準(zhǔn)確性，也為逐步推行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、可比奠定基礎(chǔ)。

后續(xù)將對(duì)CysC純化樣品按國際標(biāo)準(zhǔn)要求進(jìn)行均勻性、穩(wěn)定性、基質(zhì)效應(yīng)及互通性的評(píng)價(jià)[12-16]。采取多中心聯(lián)合定值方式，用主流常規(guī)分析方法為所純化的CysC蛋白定值，接著將制備的候選標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和質(zhì)控品在短時(shí)間內(nèi)送達(dá)多個(gè)臨床實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行適用性評(píng)價(jià)，收集回報(bào)結(jié)果，計(jì)算不確定度。