陳穎瑋，趙冉，王雪亮(上海市臨床檢驗(yàn)中心質(zhì)控品研發(fā)實(shí)驗(yàn)室，上海 200126)

新型冠狀病毒(以下簡(jiǎn)稱新冠病毒)被國(guó)際病毒分類委員會(huì)命名為SARS-CoV-2，屬于冠狀病毒科β冠狀病毒屬，是一種有包膜的正單鏈核糖核酸(RNA)病毒，會(huì)引起嚴(yán)重的呼吸道感染[1]。自2019年12月被報(bào)道以來(lái)，新冠病毒及其多個(gè)“需關(guān)切突變株”(variants of concern，VOC)，如阿爾法、德?tīng)査W密克戎等，在全球范圍內(nèi)的感染人數(shù)已超過(guò)4億，其中包括近600萬(wàn)的死亡病例[2]，且該人數(shù)仍在持續(xù)增長(zhǎng)中。

為有效控制疫情，需采取便捷可靠的篩查方式，以及時(shí)發(fā)現(xiàn)傳染源并切斷疫情傳播途徑。實(shí)時(shí)熒光PCR因具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測(cè)周期短、可自動(dòng)化、高通量批處理等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是新冠病毒檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)[3-4]。實(shí)時(shí)熒光PCR的關(guān)鍵步驟包括核酸抽提、逆轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增等，任何一個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)問(wèn)題都會(huì)影響其檢測(cè)質(zhì)量。為有效保證核酸檢測(cè)質(zhì)量，需要借助于能評(píng)價(jià)檢測(cè)系統(tǒng)性能或監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果重復(fù)性和準(zhǔn)確性的質(zhì)量控制物質(zhì)，如標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和質(zhì)控品等。目前在臨床中使用的新冠病毒核酸檢測(cè)質(zhì)量控制物質(zhì)分為陰性和陽(yáng)性質(zhì)量控制物質(zhì)。陰性質(zhì)量控制物質(zhì)形式較為簡(jiǎn)單，如《新型冠狀病毒肺炎防控方案(第九版)》(聯(lián)防聯(lián)控機(jī)制綜發(fā)〔2022〕71號(hào))中要求實(shí)驗(yàn)室使用生理鹽水作為陰性質(zhì)量控制物質(zhì)，以監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)室可能出現(xiàn)的假陽(yáng)性情況。而陽(yáng)性質(zhì)量控制物質(zhì)形式多樣，主要包括患者樣本、病毒培養(yǎng)和人工制備物質(zhì)等類型。本文對(duì)新冠病毒核酸檢測(cè)陽(yáng)性質(zhì)量控制物質(zhì)的不同種類及應(yīng)用情況進(jìn)行介紹，以期為新冠病毒核酸檢測(cè)質(zhì)量控制物質(zhì)的合理選用提供參考。

1 患者樣本

患者樣本是臨床常用的質(zhì)量控制物質(zhì)之一，可經(jīng)臨床確診的新冠患者鼻咽拭子、灌洗液等樣本滅活稀釋制備而成。此類型樣本作為質(zhì)控品，可監(jiān)控檢測(cè)結(jié)果的精密度，特別是在缺乏商品化質(zhì)控品的情況下。如G?rzer等[5]在奧地利新冠病毒核酸檢測(cè)室間質(zhì)量評(píng)價(jià)(external quality assessment，EQA)中使用3個(gè)100倍稀釋的口鼻拭子樣本，而后在第3次EQA中，又使用B.1.1.7突變株在內(nèi)的2個(gè)患者樣本[6]，對(duì)于監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性起到了重要作用。

患者樣本具有與臨床樣本一致的組成成分，可真實(shí)地反映實(shí)際檢測(cè)情況，使得檢測(cè)結(jié)果更具有說(shuō)服力。但由于其自身成分復(fù)雜，可能存在生物安全方面的問(wèn)題，加之患者陽(yáng)性樣本難以獲取，這在一定程度上限制了其臨床應(yīng)用。

2 病毒培養(yǎng)樣本

病毒培養(yǎng)樣本是將新冠病毒經(jīng)細(xì)胞(如Vero E6細(xì)胞)培養(yǎng)、純化滅活處理后得到可用作質(zhì)量控制物質(zhì)的樣本。Baronti等[7]采用Vero E6細(xì)胞培養(yǎng)2020/FR/702新冠病毒，用蔗糖作為穩(wěn)定劑，將收獲病毒凍干分裝后可作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)供臨床使用。Matheeussen等[8]使用經(jīng)數(shù)字PCR定量的新冠病毒培養(yǎng)樣本開(kāi)展EQA活動(dòng)，發(fā)現(xiàn)部分實(shí)驗(yàn)室對(duì)低濃度樣本檢出率較低，為相關(guān)實(shí)驗(yàn)室后續(xù)提升檢測(cè)質(zhì)量提供了建議。Sung等[9]在韓國(guó)組織的EQA中采用Vero細(xì)胞培養(yǎng)的新冠病毒模擬上呼吸道樣本，要求報(bào)告假陰性的實(shí)驗(yàn)室采取額外糾正措施并參與后續(xù)EQA，對(duì)實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)檢測(cè)中存在的潛在問(wèn)題和持續(xù)質(zhì)量改進(jìn)起到推進(jìn)作用。

培養(yǎng)病毒的樣本具有完整的病毒結(jié)構(gòu)，也是較為理想的質(zhì)量控制物質(zhì)類型。但由于病毒培養(yǎng)需在三級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室中展開(kāi)，且需經(jīng)滅活處理，這也增加了其生產(chǎn)與使用的局限性。

3 人工制備的樣本

3.1質(zhì)粒樣本 質(zhì)粒是存在于染色體外的遺傳物質(zhì)，能獨(dú)立復(fù)制并表達(dá)攜帶的遺傳信息，是常用的載體類型。常見(jiàn)質(zhì)粒制備方式是將外源基因片段插入載體，轉(zhuǎn)染感受態(tài)大腸埃希菌增殖表達(dá)，經(jīng)過(guò)純化可獲得含有目的片段的質(zhì)粒[10]。質(zhì)粒生產(chǎn)工藝成熟，穩(wěn)定性好，易于構(gòu)建，能夠準(zhǔn)確定量，且可通過(guò)測(cè)序得到準(zhǔn)確的堿基序列，是商品化核酸檢測(cè)試劑盒中最為常見(jiàn)的質(zhì)控品類型[11]。然而，高濃度質(zhì)粒容易造成環(huán)境氣溶膠污染。Mascuch等[12]報(bào)道實(shí)驗(yàn)室在研制新冠病毒核酸檢測(cè)試劑過(guò)程中發(fā)現(xiàn)在處理質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)室以及相鄰實(shí)驗(yàn)室物表上有陽(yáng)性質(zhì)粒污染。

質(zhì)粒易于制備且方便定量，可被用于評(píng)估新冠病毒核酸檢測(cè)方法或試劑性能，如檢測(cè)下限的確定、標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制、重復(fù)性檢測(cè)等。但質(zhì)粒與實(shí)際病毒樣本相差較大，需要添加額外基質(zhì)樣本以更好地模擬臨床樣本，如陰性唾液樣本。此外，質(zhì)粒也無(wú)法監(jiān)控核酸抽提過(guò)程以及RNA逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程。因此，作為廣泛應(yīng)用的商品化質(zhì)控品類型，質(zhì)粒仍存在較大不足。

3.2體外轉(zhuǎn)錄的RNA樣本 體外轉(zhuǎn)錄是指在體外模擬體內(nèi)轉(zhuǎn)錄過(guò)程，通過(guò)RNA轉(zhuǎn)錄酶合成RNA片段。如將合成的新冠病毒靶標(biāo)DNA片段構(gòu)建入含有T7啟動(dòng)子的載體中，利用T7 RNA聚合酶進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄可得到相應(yīng)的RNA片段[13-14]。體外轉(zhuǎn)錄的RNA使得RNA量產(chǎn)變?yōu)榭赡?，可作為質(zhì)量控制物質(zhì)來(lái)保證診斷試劑的準(zhǔn)確性。

體外轉(zhuǎn)錄的RNA常被用于新冠病毒核酸檢測(cè)試劑方法學(xué)性能驗(yàn)證，如將體外轉(zhuǎn)錄的RNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)用于新冠病毒核酸定量[15]，或用于最低檢出限研究[16]。體外轉(zhuǎn)錄的RNA也是常見(jiàn)的新冠病毒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)類型，美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和技術(shù)協(xié)會(huì)、歐盟委員會(huì)聯(lián)合研究中心、中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院和上海市計(jì)量測(cè)試技術(shù)研究院等多家研究機(jī)構(gòu)均可提供體外轉(zhuǎn)錄RNA形式的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

體外轉(zhuǎn)錄的RNA不僅易于批量制備，還可彌補(bǔ)質(zhì)粒無(wú)法監(jiān)控RNA逆轉(zhuǎn)錄步驟的不足，從而更好地監(jiān)測(cè)PCR檢測(cè)全過(guò)程[17]。但是，體外轉(zhuǎn)錄的RNA依然無(wú)法監(jiān)測(cè)病毒RNA的抽提過(guò)程。此外，體外轉(zhuǎn)錄的RNA穩(wěn)定性較差，需通過(guò)優(yōu)化保存劑來(lái)保證其不發(fā)生降解[13]，對(duì)存儲(chǔ)運(yùn)輸條件也提出了更高要求。

3.3病毒抽提的RNA樣本 從新冠病毒中抽提得到的RNA具有完整的新冠病毒基因組信息，常被用于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或質(zhì)控品等質(zhì)量控制物質(zhì)的制備。本研究組將病毒抽提RNA制備的新冠病毒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)倍比稀釋，用于評(píng)估14種常規(guī)新冠病毒檢測(cè)試劑和3種快檢試劑的檢測(cè)靈敏度，發(fā)現(xiàn)不同檢測(cè)試劑間最低檢出限可相差8倍[18]。此外，本研究組也曾使用病毒抽提的RNA作為EQA質(zhì)控品，發(fā)現(xiàn)部分實(shí)驗(yàn)室存在低濃度樣本檢出率不太理想的情況[19]。然而，與體外轉(zhuǎn)錄RNA相似，病毒抽提的RNA樣本也存在不能監(jiān)測(cè)核酸抽提過(guò)程、穩(wěn)定性較差的問(wèn)題。

3.4噬菌體假病毒顆粒 噬菌體MS2的外殼蛋白CP、成熟酶蛋白A和包裝位點(diǎn)PAC可以自行組裝形成噬菌體病毒樣顆粒，并將PAC下游的外源RNA包裝到外殼蛋白內(nèi)[20]。使用該技術(shù)制備的質(zhì)量控制物質(zhì)在形態(tài)結(jié)構(gòu)上與天然病毒顆粒相似，由于缺乏完整的病毒核酸，無(wú)法進(jìn)行獨(dú)立復(fù)制，可有效減少生物安全性的問(wèn)題。Wang等[21]將覆蓋EQA試劑檢測(cè)靶點(diǎn)的部分ORF1ab基因、N基因和E基因序列插入到pACYC-MS2載體中，制備了4個(gè)濃度的樣本用于EQA。

MS2病毒樣顆粒無(wú)感染性且復(fù)制缺陷，遺傳物質(zhì)由蛋白質(zhì)外殼包裹，彌補(bǔ)了體外轉(zhuǎn)錄RNA無(wú)法監(jiān)測(cè)病毒RNA抽提的問(wèn)題，從而做到全過(guò)程監(jiān)控。此外，外殼蛋白的包裹可使其耐受核酸酶降解，因而具有較好的穩(wěn)定性。然而，由于MS2病毒樣顆粒對(duì)外源片段的包裹能力有限，導(dǎo)致其無(wú)法一次性包裹較長(zhǎng)外源基因片段，如新冠病毒ORF1ab基因，因而往往需要制備多個(gè)假病毒顆粒，混合后作為質(zhì)控品使用，增加了操作的復(fù)雜性。因此，在選用此類質(zhì)量控制物質(zhì)時(shí)，應(yīng)確認(rèn)噬菌體假病毒顆粒所包含的基因片段能覆蓋檢測(cè)試劑的擴(kuò)增區(qū)域，以有效用于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)系統(tǒng)中。

3.5慢病毒 慢病毒載體是一種復(fù)制缺陷病毒載體，能夠?qū)⑼庠椿蛘系剿拗魅旧w上得到表達(dá)[22]。此種方式也用于制備質(zhì)量控制物質(zhì)，如中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院將新冠病毒N基因、E基因和ORF1ab基因片段克隆至慢病毒載體pCDH上，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后獲得帶有相應(yīng)目的片段的慢病毒顆粒，可作為新冠病毒核糖核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[23]。Lee等[24]也通過(guò)pCDH載體制備了含有RdRp基因、N基因、E基因和S基因片段的慢病毒，并使用數(shù)字PCR定量，可作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)用于RT-qPCR、二代測(cè)序、等溫?cái)U(kuò)增和CRISPR檢測(cè)方法中。相較于噬菌體假病毒，慢病毒能整合較大的外源DNA，但目前對(duì)于其安全性仍會(huì)有一定的擔(dān)憂，常需要通過(guò)使用復(fù)制缺陷的慢病毒載體、插入額外的停止子和熱滅活來(lái)確保其生物安全。

3.6其他 此外，也有其他一些人工制備的樣本用于新冠病毒質(zhì)量控制物質(zhì)的制備，如在疫苗制備中廣泛應(yīng)用的甲病毒。東京都政府在2020年7月組織的EQA中使用了甲病毒制備的新冠病毒質(zhì)控品[25]。此外，Chan等[26]開(kāi)發(fā)了基于噬菌體Qβ和植物病毒豇豆褪綠斑駁病毒(CCMV)的帶有新冠病毒基因片段的病毒樣顆粒，可作為新冠病毒核酸檢測(cè)質(zhì)控品。

4 總結(jié)

在新冠病毒核酸檢測(cè)中，人員操作誤差、儀器設(shè)備未及時(shí)校準(zhǔn)或故障、試劑質(zhì)量等因素都會(huì)影響檢測(cè)質(zhì)量[14]。因此，必須采取嚴(yán)格的質(zhì)量控制措施，而性能可靠的質(zhì)量控制物質(zhì)的應(yīng)用是其中重要一環(huán)。本文內(nèi)容揭示了不同類型的質(zhì)量控制物質(zhì)具有各自不同的優(yōu)缺點(diǎn)，應(yīng)根據(jù)實(shí)際應(yīng)用場(chǎng)景進(jìn)行合理選擇。當(dāng)前，研發(fā)一種更易于制備、生物安全風(fēng)險(xiǎn)低、穩(wěn)定可靠、可監(jiān)控反應(yīng)全程的理想新冠病毒核酸檢測(cè)質(zhì)量控制物質(zhì)仍是業(yè)內(nèi)從業(yè)人員的研究熱點(diǎn)。此外，由于新冠病毒核酸檢測(cè)技術(shù)的廣泛應(yīng)用，臨床分子檢測(cè)平臺(tái)不斷完善，更多的分子檢測(cè)技術(shù)將在臨床加速開(kāi)展。為保證相關(guān)項(xiàng)目檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠，這對(duì)分子檢測(cè)質(zhì)量控制物質(zhì)提出了更高要求，而新冠病毒核酸檢測(cè)質(zhì)量控制物質(zhì)的應(yīng)用也將為其他相關(guān)分子檢測(cè)項(xiàng)目質(zhì)量控制物質(zhì)的研發(fā)和選用提供參考借鑒。