李陽(yáng) 邵宇

帕金森是臨床常見的神經(jīng)內(nèi)科疾病，作為一種神經(jīng)退行性病變，患者大多具有運(yùn)動(dòng)遲緩、四肢震顫、步態(tài)障礙等表現(xiàn)，嚴(yán)重影響身體健康、生活質(zhì)量[1,2]。老年人為帕金森主要發(fā)病群體，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，近年來(lái)我國(guó)每年新增帕金森病例數(shù)居高不下，引起廣泛關(guān)注[3,4]。帕金森癥狀的發(fā)生發(fā)展受多種因素的共同作用，其具體發(fā)病機(jī)制尚未研究透徹[5]。目前西醫(yī)藥物治療為常用的治療帕金森的手段，但臨床療效并不十分理想，且會(huì)出現(xiàn)一些不良反應(yīng)，并無(wú)一種特效的治療帕金森的藥物，因此中醫(yī)藥治療帕金森逐漸成為神經(jīng)科醫(yī)生的重點(diǎn)研究方向[6,7]。本研究使用建立帕金森大鼠模式，并使用天麻素進(jìn)行干預(yù)，觀察效果。

1 材料與方法

1.1 材料 選取50只SD健康雄性大鼠[湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，許可證號(hào)：SYXK(湘)2019-0008]，年齡7～9周，平均(8.1±0.8)周；體重213～237 g，平均(225.1±9.6)g。所有大鼠于(22.9±2.7)℃環(huán)境中喂養(yǎng)。主要試劑：小鼠抗兔TLR4抗體(BD公司)；小鼠抗大鼠NF-κB p65抗體(Dako公司)；兔抗大鼠p38MAPK抗體(Gibco公司)；大鼠抗小鼠TNF-α(Sigma公司)；大鼠抗小鼠IL-1β、IL-6抗體(Hyclone公司)；兔抗大鼠Wnt3a抗體(Selleck公司)；小鼠抗兔β-catenin抗體(Invitrogen公司)。本研究獲取醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 建模及分組干預(yù) 隨機(jī)挑選10只為正常組，其余40只建立帕金森模型。建模方法：葵花油乳油溶解魚藤酮，濃度2 mg/ml，于大鼠頸背部皮下注射，1次/d，2 mg·kg-1·d-1，連續(xù)注射4周。大鼠出現(xiàn)肢體震顫、僵直、行動(dòng)遲緩、步態(tài)不穩(wěn)等現(xiàn)象即判定為建模成功。將建模失敗及建模過(guò)程中死亡大鼠剔除，最終建模成功35只。將35只帕金森大鼠隨機(jī)分為模型組8只及低、中、高劑量組各9只，正常組、模型組大鼠使用0.9%氯化鈉溶液進(jìn)行灌胃處理，低、中、高劑量組大鼠分別使用0.2、0.4、0.6 g/kg天麻素注射液進(jìn)行腹腔注射，1次/d。所有大鼠連續(xù)干預(yù)14 d。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1 學(xué)習(xí)、記憶能力檢測(cè):學(xué)習(xí)能力檢測(cè)：將大鼠放入準(zhǔn)備好的Y型迷宮內(nèi)，5 min后進(jìn)行電刺激，60 V電壓持續(xù)6 s，大鼠感受到電刺激后直接逃至無(wú)電刺激區(qū)域?yàn)檎_反應(yīng)，大鼠在無(wú)電刺激區(qū)域停留30 s后再次放入電刺激中，按此步驟反復(fù)訓(xùn)練，連續(xù)訓(xùn)練10次，其中9次符合正確反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)為訓(xùn)練合格，對(duì)比5組大鼠學(xué)習(xí)合格所用訓(xùn)練次數(shù)。記憶能力檢測(cè)：Y型迷宮訓(xùn)練結(jié)束后，次日再次進(jìn)行Y型迷宮訓(xùn)練，記錄5組大鼠10次訓(xùn)練正確反應(yīng)次數(shù)。

1.3.2 標(biāo)本采集、HE染色:取5組大鼠腹部靜脈血3 ml,離心處理(離心半徑10 cm，轉(zhuǎn)速2 500 r/min，離心時(shí)間15 min)，-50℃保存。對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉處理后頸椎脫臼法處死，取海馬區(qū)腦組織，固定、完全浸泡在4%甲醛中，1 d后石蠟包埋、連續(xù)切片。切片脫蠟、脫水處理，蘇木素染色，之后進(jìn)行分化、沖洗、乙醇梯度脫水處理，伊紅染色后再次進(jìn)行乙醇梯度脫水，之后進(jìn)行封片處理，顯微鏡下觀察，并記錄5組大鼠神經(jīng)元數(shù)量。

1.3.3 Western blot法檢測(cè)TLR4/NF-κB通路、Wnt/β-catenin通路蛋白表達(dá):取各組大鼠腦組織切片，添加裂解液提取蛋白50 μg，蛋白定量后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜處理，室內(nèi)環(huán)境封閉，3 h后1∶1 000添加一抗，4℃過(guò)夜孵育，次日取出后TBST清洗3次，之后1∶5 000添加二抗，室溫孵育2 h后TBST清洗3次，顯色、曝光、成像，檢測(cè)TLR4/NF-κB通路、Wnt/β-catenin通路蛋白表達(dá)。

1.3.4 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)炎性因子水平:標(biāo)記酶標(biāo)板，設(shè)置對(duì)照1、對(duì)照2、檢測(cè)孔3孔，終止液、顯色劑加入對(duì)照1孔，稀釋標(biāo)準(zhǔn)品加入對(duì)照2孔，血清標(biāo)本、抗體加入檢測(cè)孔，封膜后震蕩均勻，使用37℃保溫箱培養(yǎng)1 h，之后去膜清洗，將水分吸干后添加顯色劑晃勻，顯色后添加終止液，450 nm處測(cè)吸光值，計(jì)算TNF-α、IL-1β、IL-6水平。

2 結(jié)果

2.1 5組大鼠腦組織病理學(xué)觀察 正常組大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)完好，分布緊密，無(wú)病理變化。模型組大鼠腦組織細(xì)胞形態(tài)各異，細(xì)胞核破裂，排列雜亂，出現(xiàn)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況；低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠細(xì)胞形態(tài)改善，排列較為規(guī)則，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況緩解，其中高劑量組大鼠神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)基本正常，排列規(guī)則。見圖1。

圖1 5組大鼠腦組織病理學(xué)觀察(HE×200)

2.2 5組大鼠學(xué)習(xí)、記憶能力比較 與正常組比較，其他4組大鼠達(dá)標(biāo)所需訓(xùn)練次數(shù)較高、記憶成績(jī)較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，低、中、高劑量組大鼠達(dá)標(biāo)所需訓(xùn)練次數(shù)較低、記憶成績(jī)較高(P<0.05)；與低、中劑量組比較，高劑量組大鼠達(dá)標(biāo)所需訓(xùn)練次數(shù)較低、記憶成績(jī)較高(P<0.05)。見表1。

表1 5組大鼠學(xué)習(xí)、記憶能力比較

2.3 5組大鼠兩側(cè)神經(jīng)元數(shù)量比較 與正常組比較，其他4組大鼠兩側(cè)神經(jīng)元數(shù)量較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，低、中、高劑量組大鼠兩側(cè)神經(jīng)元數(shù)量較高(P<0.05)，且高劑量組大鼠兩側(cè)神經(jīng)元數(shù)量高于低、中劑量組(P<0.05)。見表2。

表2 5組大鼠兩側(cè)神經(jīng)元數(shù)量比較 個(gè)

2.4 5組大鼠TLR4/NF-κB通路蛋白表達(dá)比較 與正常組比較，其他4組大鼠TLR4、NF-κB p65、p38MAPK表達(dá)較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，低、中、高劑量組TLR4、NF-κB p65、p38MAPK表達(dá)低于模型組，且高劑量組大鼠TLR4、NF-κB p65、p38MAPK表達(dá)低于低、中劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 5組大鼠TLR4/NF-κB通路蛋白表達(dá)比較

2.5 5組大鼠炎性因子水平比較 與正常組比較，其他4組大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6水平較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，低、中、高劑量組大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6水平較低，且高劑量組大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6水平低于低、中劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 5組大鼠炎性因子水平比較

2.6 5組大鼠Wnt/β-catenin通路蛋白表達(dá)比較 與正常組比較，其他4組大鼠Wnt3a、β-catenin表達(dá)較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，低、中、高劑量組大鼠Wnt3a、β-catenin表達(dá)較低，且高劑量組大鼠Wnt3a、β-catenin表達(dá)低于低、中劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表5。

表5 5組大鼠Wnt/β-catenin通路蛋白表達(dá)比較

3 討論

帕金森發(fā)病機(jī)制復(fù)雜性較高，有學(xué)者認(rèn)為，環(huán)境、年齡、氧化應(yīng)激、壓力、家族遺傳等均為危險(xiǎn)因素[8]。臨床治療帕金森首選抗精神疾病藥物，但是尚無(wú)一種特效藥物能夠徹底治愈，并且有些藥物治療安全性欠佳，會(huì)誘發(fā)一些不良反應(yīng)，甚至具有肝腎毒性，因此越來(lái)越多的專家學(xué)者通過(guò)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究中醫(yī)藥對(duì)帕金森的干預(yù)效果[9,10]。天麻素主要提取自天麻根塊部位，具有抑制血小板聚集、清除自由基、調(diào)節(jié)免疫等藥理作用[11,12]，有研究表明，天麻素具有神經(jīng)保護(hù)作用，但是關(guān)于天麻素治療帕金森的效果及機(jī)制的研究還相對(duì)較少[13]。

大量臨床研究表明，帕金森的發(fā)生發(fā)展伴隨著機(jī)體神經(jīng)功能、認(rèn)知功能大幅減退[13,14]。有學(xué)者通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究帕金森大鼠學(xué)習(xí)記憶能力變化，認(rèn)為帕金森大鼠學(xué)習(xí)記憶能力較差，干預(yù)之后能夠改善大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，從而起到神經(jīng)功能保護(hù)作用[15]。本研究設(shè)計(jì)Y型迷宮實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，帕金森大鼠訓(xùn)練達(dá)標(biāo)所需次數(shù)較多、記憶成績(jī)較低，使用天麻素進(jìn)行干預(yù)的大鼠達(dá)標(biāo)所需次數(shù)下降，記憶成績(jī)提升，并且隨著天麻素劑量提升，效果更加明顯，說(shuō)明帕金森大鼠神經(jīng)功能出現(xiàn)損傷，學(xué)習(xí)記憶能力大幅下降，使用天麻素進(jìn)行干預(yù)，帕金森大鼠學(xué)習(xí)記憶能力明顯提升，說(shuō)明天麻素具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用，能夠減輕帕金森大鼠神經(jīng)、認(rèn)知功能損傷，并且其能力具有一定的劑量依賴性。本研究還對(duì)帕金森大鼠腦組織神經(jīng)元數(shù)量進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)帕金森大鼠神經(jīng)元數(shù)量較低，使用天麻素干預(yù)的大鼠神經(jīng)元數(shù)量上升，并且隨著天麻素劑量提升，神經(jīng)元數(shù)量上升幅度更加明顯，進(jìn)一步說(shuō)明天麻素能夠發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

有研究表明，帕金森癥狀的發(fā)生發(fā)展與炎性反應(yīng)具有密切聯(lián)系[16]。有研究表明，減輕腦組織炎性反應(yīng)能夠使機(jī)體神經(jīng)損傷嚴(yán)重程度減輕，起到神經(jīng)保護(hù)作用，從而對(duì)帕金森癥狀起到干預(yù)效果[17]。TLR4/NF-κB通路為廣譜的炎癥通路，包括TLR4、NF-κB p65、p38MAPK等蛋白，其表達(dá)變化在機(jī)體炎性反應(yīng)發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用[18,19]。TNF-α、IL-1β、IL-6均為TLR4/NF-κB通路下游炎性因子，三者水平變化與機(jī)體炎性反應(yīng)發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，帕金森大鼠腦組織TLR4、NF-κB p65、p38MAPK相對(duì)表達(dá)量較高，使用天麻素進(jìn)行干預(yù)后，TLR4、NF-κB p65、p38MAPK表達(dá)下調(diào)，TNF-α、IL-1β、IL-6水平下降，且天麻素劑量越高，TLR4、NF-κB p65、p38MAPK表達(dá)及TNF-α、IL-1β、IL-6水平下調(diào)幅度越大，說(shuō)明帕金森大鼠腦組織出現(xiàn)一定程度炎性反應(yīng)，使用天麻素進(jìn)行干預(yù)，能夠調(diào)控TLR4/NF-κB通路蛋白表達(dá)，從而使下游炎性因子水平下降，減輕帕金森大鼠腦組織炎性反應(yīng)，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

有研究表明，帕金森患者認(rèn)知障礙、神經(jīng)功能損傷與機(jī)體腦組織神經(jīng)元細(xì)胞凋亡具有密切聯(lián)系，緩解腦組織神經(jīng)元細(xì)胞凋亡是緩解帕金森病情的關(guān)鍵[20]。Wnt/β-catenin通路蛋白表達(dá)變化與細(xì)胞凋亡具有密切聯(lián)系[21,22]。本研究顯示，帕金森患者Wnt3a、β-catenin表達(dá)較高，使用天麻素干預(yù)的大鼠Wnt3a、β-catenin表達(dá)下調(diào)，隨著天麻素應(yīng)用劑量的提升，下調(diào)幅度更加明顯，說(shuō)明使用天麻素進(jìn)行干預(yù)能夠調(diào)控Wnt/β-catenin通路蛋白表達(dá)，從而抑制帕金森大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡，具有一定的腦保護(hù)作用。

綜上所述，使用天麻素對(duì)帕金森大鼠進(jìn)行干預(yù)，具有一定神經(jīng)元損傷修復(fù)作用，其機(jī)制可能與減輕帕金森大鼠腦組織炎性反應(yīng)、調(diào)控細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)有關(guān)，為帕金森的臨床治療提供一定的理論依據(jù)。