王禮霄，劉晉仙，柴寶峰

山西大學(xué)黃土高原研究所/黃土高原生態(tài)恢復(fù)山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030006

亞高山草地具有水源涵養(yǎng)、生物多樣性保育、水土保持和碳匯功能（趙鵬宇，2019）。受全球變化和人類活動(dòng)的影響，山西亞高山草地植被退化，水土流失，生態(tài)系統(tǒng)功能嚴(yán)重受損?；谏鷳B(tài)環(huán)境的保護(hù)和改善，我國(guó)實(shí)施了“退耕還林/草”工程（常慶瑞等，1999）。山西亞高山草甸面積約33.33×104hm2，占全省草地總面積的10%。這一重要的政策實(shí)施以來(lái)，植被得以迅速恢復(fù)。植物是生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能自然演化的主要驅(qū)動(dòng)力（史利江等，2021），凋落物和根系分泌物的輸入影響土壤的理化性質(zhì)（Kuypers et al.，2018），進(jìn)而驅(qū)動(dòng)了土壤微生物群落的演替過(guò)程（Kardol et al.，2010；Bardgett et al.，2014）。亞高山生態(tài)系統(tǒng)對(duì)氣候變化敏感，恢復(fù)較為困難，植被和土壤微生物群落的演替規(guī)律尚不清楚。

目前關(guān)于退耕還草地恢復(fù)過(guò)程中植物多樣性和土壤特征的變化規(guī)律已有了一定的研究。隨著演替的進(jìn)行，植物生物量和物種多樣性會(huì)隨著時(shí)間的推移而增加（樊博等，2020）。自然植被的恢復(fù)可以改善退化土壤的性質(zhì)并增加肥力（Cao et al.，2021）。植物演替對(duì)土壤養(yǎng)分有積極的作用，并增強(qiáng)了植物的多樣性（Deng et al.，2014；Matetskaya et al.，2021）。Wang et al.（2011）發(fā)現(xiàn)黃土高原農(nóng)田棄耕后，土壤有機(jī)碳、全氮、速效氮和速效鉀以及土壤酶活性隨著植被恢復(fù)年限的增加而提高。

土壤微生物在生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，微生物群落結(jié)構(gòu)和功能的變化會(huì)影響植物殘?bào)w分解、土壤碳氮轉(zhuǎn)變和地上植被養(yǎng)分供給等生態(tài)過(guò)程（Wang et al.，2011）。同時(shí)，微生物多樣性、結(jié)構(gòu)和功能也受到植被、土壤特性等因素的影響（Fan et al.，2016；Bier et al.，2014）。有越來(lái)越多的研究關(guān)注于土壤微生物群落對(duì)地上植被演替的響應(yīng)，地上植被的演替過(guò)程會(huì)對(duì)土壤微生物類群和功能多樣性等造成重要影響（Lee-Cruz et al.，2013；Nacke et al.，2014）。Li et al.（2014）和Zuo et al.（2016）對(duì)植被恢復(fù)礦區(qū)和沙地草原土壤微生物群落的分析發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌的多樣性隨著植被恢復(fù)時(shí)間的增長(zhǎng)而顯著提高，呈現(xiàn)出明顯的時(shí)間演替趨勢(shì)。多樣性的增加對(duì)微生物群落的功能產(chǎn)生重要的影響，功能基因豐度可以反映微生物群落的功能對(duì)環(huán)境變化的響應(yīng)（Li et al.，2014）。目前關(guān)于地上植被如何影響土壤微生物氮循環(huán)功能仍有爭(zhēng)議，Blaud et al.（2017）報(bào)道，在從農(nóng)田到森林的次生演替過(guò)程中，氮循環(huán)相關(guān)基因的豐度增加；而Zhong et al.（2018）觀察到，在從草原到森林的次生演替過(guò)程中，氮循環(huán)相關(guān)基因的相對(duì)豐度則是先升高后降低。因此，退耕還草過(guò)程中植物群落與微生物群落結(jié)構(gòu)、多樣性和功能之間的關(guān)系是恢復(fù)生態(tài)學(xué)有待回答的問(wèn)題。

本研究以山西省寧武云中山亞高山退耕還草區(qū)不同恢復(fù)年限（15、20、30 a）的草地為研究對(duì)象，進(jìn)行草地植物群落調(diào)查和土壤樣本的采集，利用16S rRNA基因的Illumina MiSeq測(cè)序和qPCR技術(shù)，通過(guò)多元統(tǒng)計(jì)的方法分析草甸恢復(fù)過(guò)程中土壤細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)與功能特征及其驅(qū)動(dòng)因素，闡明土壤細(xì)菌群落對(duì)地上植被恢復(fù)時(shí)間序列的響應(yīng)。本研究旨在回答以下問(wèn)題：（1）亞高山草草甸退耕還草過(guò)程中，植物多樣性、土壤性質(zhì)和土壤細(xì)菌群落的演變規(guī)律；（2）退耕還草過(guò)程中土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和氮循環(huán)功能演變的驅(qū)動(dòng)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

研究地點(diǎn)位于山西省呂梁山脈北段分支寧武云中山，呈東北—西南走向，海拔約 2160 m。本區(qū)年平均氣溫2.0—9.0 ℃，無(wú)霜凍期84—135 d，年降水量430—700 mm。該地區(qū)自上世紀(jì)90年代開(kāi)始實(shí)施退耕還草措施，農(nóng)田植被開(kāi)始自然恢復(fù)。1個(gè)農(nóng)田樣地（對(duì)照）和3個(gè)不同恢復(fù)年限的草甸（15、20、30 a）作為試驗(yàn)樣地。樣地具有相似的坡度和海拔，并經(jīng)歷了類似的耕作方式。退耕前，農(nóng)田的主要作物是莜麥，退耕后，植被自然演替。選擇對(duì)照農(nóng)田種植的也是莜麥，在春季施用了農(nóng)家肥。

在每個(gè)樣地，設(shè)置3個(gè)1 m×1 m的樣方，樣方之間間隔約20 m。用土鉆采集表層土壤樣品（0—10 cm），每個(gè)樣方內(nèi)采集5個(gè)子樣（每個(gè)角1個(gè)，中心1個(gè)），在聚乙烯袋中混合成一個(gè)樣品。經(jīng)2 mm網(wǎng)篩，將大部分根、動(dòng)物和石頭去除，然后將樣本分成兩部分。其中一部分風(fēng)干后進(jìn)行土壤理化性質(zhì)測(cè)定，另一部分保存在-80 ℃冰箱中，用于DNA的提取。在每個(gè)樣方中調(diào)查植被參數(shù)，記錄每種植物的名稱、高度、蓋度及多度等指標(biāo)。

1.2 土壤理化性質(zhì)測(cè)定

烘干法測(cè)定土壤含水量（SWC）；土壤pH值用電位法（HANNA，意大利）測(cè)定（土水質(zhì)量比為1∶2.5）；總碳（TC）和總氮（TN）通過(guò)元素分析儀（ElementarVario MACRO，德國(guó)）測(cè)定；銨態(tài)氮（NH4+-N）、硝態(tài)氮（NO3--N）采用間斷元素分析儀（CleverChem 380，德國(guó)）測(cè)定。

脲酶采用苯酚鈉-次氯酸鈉比色法，其活性以37 ℃下培養(yǎng)24 h后1 g土壤產(chǎn)生的NH3的mg數(shù)表示；蔗糖酶采用3,5-二硝基水楊酸比色法，其活性以37 ℃培養(yǎng)24 h后1 g土壤產(chǎn)生的葡萄糖的mg數(shù)表示；過(guò)氧化氫酶活性（H2O2）采用KMnO4滴定法，其活性以20 min內(nèi)每克土壤分解的過(guò)氧化氫的毫克數(shù)來(lái)表示。

1.3 DNA提取、高通量測(cè)序及生物信息學(xué)分析

稱取0.5 g土壤樣品，使用E.Z.N.A.土壤DNA試劑盒（Omega Bio-tek，USA）提取和純化土壤微生物DNA。將每個(gè)采樣點(diǎn)的3個(gè)土壤樣品等體積混合，一共12個(gè)DNA樣品，送往上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序。采用338F（正向引物 5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′）和806R（反向引物 5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）對(duì)細(xì)菌16S rRNA的V3—V4高可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并通過(guò)Illumina Miseq測(cè)序平臺(tái)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。剔除嵌合序列后，剩下的序列使用UPARSE以97%的相似性作為閾值劃分分類操作單元（operational taxonomic units，OTUs）。

1.4 氮循環(huán)功能基因的定量PCR

采用CFX 96 touch實(shí)時(shí)定量 PCR系統(tǒng)（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）測(cè)定參與土壤氮循環(huán)過(guò)程的主要功能基因（nifH、amoA-AOA、amoA-AOB、nirK、nirS）豐度。操作過(guò)程和引物序列見(jiàn)課題組之前的報(bào)道（Luo et al.，2020）。反應(yīng)體系、擴(kuò)增程序及熔解曲線見(jiàn)文獻(xiàn)（徐白璐等，2017）。以含有目的基因片段的重組質(zhì)粒為模板，10倍倍比進(jìn)行稀釋，根據(jù)情況選取4—5個(gè)稀釋梯度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。將樣品與標(biāo)準(zhǔn)品同時(shí)進(jìn)行 qPCR檢測(cè)，每個(gè)樣品設(shè)置 3個(gè)重復(fù)和一個(gè)陰性對(duì)照。qPCR的擴(kuò)增效率是 80%—95%，標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2＞0.990。所有功能基因的豐度最終計(jì)算為每克干土的拷貝數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

基于R studio（v.3.4.3）vegan包，計(jì)算細(xì)菌和植物的α多樣性和β多樣性，采用非度量多維尺度分析（Non-metric multidimensional scaling，NMDS）和相似性分析（Analysis of similarity，ANOSIM）對(duì)農(nóng)田與不同恢復(fù)年限草地細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較。采用冗余分析（Redundancy analysis，RDA）評(píng)價(jià)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境變量之間的相關(guān)性。利用IBM SPSS statistics 20進(jìn)行皮爾遜相關(guān)性分析（Pearson correlation test）以及采用單因素方差分析（One-way analysis of variance）和Duncan多重比較分析進(jìn)行顯著性差異分析。所有統(tǒng)計(jì)分析的顯著性水平均為P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 土壤理化性質(zhì)和植物多樣性特征

不同恢復(fù)年限草地的土壤理化參數(shù)和植物多樣性數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。所有土壤樣品的pH都小于7，為弱酸性土壤。土壤總碳、總氮、碳氮比、硝態(tài)氮、銨態(tài)氮、土壤含水率、過(guò)氧化氫酶、脲酶和蔗糖酶活性在農(nóng)田和不同年限恢復(fù)年限的草地間差異顯著（P＜0.05），而土壤pH的差異不顯著（P＞0.05）。農(nóng)田土壤總碳、總氮、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮含量、脲酶活性顯著高于草地，而在草地恢復(fù)過(guò)程中土壤總碳和總氮含量穩(wěn)步提升；退耕30年草地土壤碳氮比、含水率和蔗糖酶活性顯著高于其他樣地。不同恢復(fù)年限的草地地上植被多樣性指數(shù)（Shannon index）和豐富度指數(shù)（Richness index）差異顯著（P＜0.05），但均勻度差異不顯著（P＞0.05）?；謴?fù)15年的草地植物生物多樣性最高，隨著恢復(fù)年限的加長(zhǎng)，草地優(yōu)勢(shì)種發(fā)生變化，生物多樣性降低。

表1 農(nóng)田與不同恢復(fù)年限草地土壤理化性質(zhì)與植物群落參數(shù)Table 1 Soil physicochemical properties and plant community parameters under different revegetation habitats and farmland

2.2 細(xì)菌群落組成和多樣性

通過(guò)高通量測(cè)序，在12個(gè)樣本中共檢測(cè)到358488個(gè)細(xì)菌序列。按最小樣本序列數(shù)抽平，共鑒定出5410個(gè)OTU（＞97%序列相似性水平），屬于36個(gè)門(mén)、118個(gè)綱、295個(gè)目、449個(gè)科、808個(gè)屬和1709個(gè)種。36個(gè)門(mén)中有11個(gè)門(mén)定義為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)（樣本中相對(duì)豐度＞1%），相對(duì)豐度從高到低，依次為放線菌門(mén)（Actinobacteria）、變形菌門(mén)（Proteobacteria）、酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）、綠彎菌門(mén)（Chloroflexi）、芽單胞菌門(mén)（Gemmatimonadetes）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、疣微菌門(mén)（Verrucomicrobia）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、髕骨細(xì)菌門(mén)（Patescibacteria）、甲基肌酐門(mén)（Methylomirabilota）和粘球菌門(mén)（Myxococcota）（圖1a）。在不同恢復(fù)年限退耕草地的土壤中，這些優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)占據(jù)了95%以上的細(xì)菌序列。綠彎菌門(mén)的相對(duì)豐度在不同恢復(fù)年限退耕草地之間存在顯著差異（P＜0.05）（圖1b）。

圖1 農(nóng)田和不同退耕年限草地細(xì)菌群落在門(mén)水平的相對(duì)豐度及差異分析Figure 1 The relative abundance of dominant bacteria phylum and variation analysis from different revegetation habitats and farmland

12個(gè)相對(duì)豐度最高的細(xì)菌綱、科和屬，在亞高山不同恢復(fù)年限退耕草地間存在差異（圖2）。α變形菌綱（Alphaproteobacteria）、γ變形菌綱（Gammaproteobacteria）、Blastocatellia、綠彎菌綱（Chloroflexia）的豐度差異顯著；在科水平，黃色桿菌科（Xanthobacteraceae）、Pyrinomonadaceae、Roseiflexaceae的差異顯著；RB41和norank_f_Roseiflexaceae屬在不同恢復(fù)年限退耕草地間存在顯著差異（P＜0.05）。

圖2 農(nóng)田和不同退耕年限草地細(xì)菌群落在綱、科、屬水平的差異分析Figure 2 The variation analysis of dominant bacteria class,family and genus from different revegetation habitats and farmland

不同恢復(fù)年限退耕草地的土壤細(xì)菌群落α多樣性分析結(jié)果見(jiàn)表2。其中農(nóng)田土壤細(xì)菌群落Shannon指數(shù)顯著高于退耕還草地，Simpson指數(shù)顯著低于退耕還草地，即農(nóng)田土壤細(xì)菌群落多樣性最高，而均勻度較低。自然恢復(fù) 15年的退耕地的細(xì)菌群落Shannon指數(shù)顯著低于其他樣地，Simpson指數(shù)顯著高于其他樣地。隨著自然恢復(fù)年限的增長(zhǎng)，細(xì)菌群落Shannon指數(shù)增加，Simpson指數(shù)降低。農(nóng)田土壤細(xì)菌群落Sobs指數(shù)、ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)最大，其土壤細(xì)菌群落種類數(shù)目最多，在退耕地自然恢復(fù)過(guò)程中，細(xì)菌群落種類數(shù)目呈增加趨勢(shì)。

表2 農(nóng)田和不同恢復(fù)年限草地土壤細(xì)菌群落多樣性Table 2 Diversity of bacteria communities of different revegetation habitats and farmland

基于Bray-Curtis距離的非度量多維尺度分析（NMDS）和ANOSIM結(jié)果表明，不同恢復(fù)年限退耕草地的土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著的變化（R2=0.5014，P＜0.01）（圖3a）。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，細(xì)菌群落的Bray-Curtis距離符合正態(tài)分布（P＞0.05），土壤細(xì)菌群落 β多樣性（Bray-Curtis距離）與組間時(shí)間距離呈顯著正相關(guān)（r=0.449，P＜0.001），土壤細(xì)菌群落之間的相異性隨著恢復(fù)時(shí)間的增加而增加（圖3b）。

圖3 農(nóng)田和不同恢復(fù)年限草地細(xì)菌群落基于Bray-Curtis距離的NMDS分析及其與線性回歸分析Figure 3 NMDS and linear regression analysis of bacteria communities based on Bray-Curtis distance among different revegetation habitats and farmland

2.3 環(huán)境因子對(duì)細(xì)菌群落的影響

環(huán)境因子對(duì)不同恢復(fù)年限草地細(xì)菌群落的組成具有一定的影響。冗余分析（RDA）的前兩個(gè)軸解釋了總變量的48.42%。從圖4a可知，環(huán)境變量總體上沿著時(shí)間序列分布。在環(huán)境變量中，總碳、總氮、碳氮比與銨態(tài)氮含量是細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化的重要驅(qū)動(dòng)因子（P＜0.05）。此外，通過(guò)環(huán)境因子對(duì)細(xì)菌主要類群影響的Pearson相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)（圖4b），土壤總碳、總氮與綠彎菌門(mén)、粘球菌門(mén)顯著正相關(guān)（P＜0.01），土壤含水量與變形菌門(mén)和蛭弧菌門(mén)（Bdellovibrionota）顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），與浮霉菌門(mén)顯著正相關(guān)（P＜0.01），土壤銨態(tài)氮含量與黏細(xì)菌門(mén)顯著正相關(guān)（P＜0.01），土壤硝態(tài)氮含量與變形菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)與粘球菌門(mén)顯著正相關(guān)（P＜0.01），與浮霉菌門(mén)與甲基肌酐門(mén)顯著負(fù)相關(guān)。植物群落多樣性與土壤細(xì)菌群落之間的相關(guān)性分析結(jié)果表明（圖 5），土壤細(xì)菌和植物的Shannon指數(shù)顯著相關(guān)（P＜0.05），而它們之間的β多樣性沒(méi)有顯著的相關(guān)關(guān)系（r=0.127，P＞0.05）。

圖4 農(nóng)田和不同恢復(fù)年限草地細(xì)菌群落組成的冗余分析及優(yōu)勢(shì)門(mén)與環(huán)境因子的Pearson相關(guān)分析Figure 4 Redundancy analysis of bacterial community composition and Pearson analysis with dominant phylum in different revegetation grasslands and farmland

圖5 農(nóng)田和不同恢復(fù)年限草地土壤細(xì)菌群落與植物群落α多樣性和β多樣性之間的相關(guān)關(guān)系（基于Bray-Curtis距離）Figure 5 Relationship between plant and soil bacterial α-diversity and β-diversity (based on Bray-Curtis distances)in different revegetation grasslands and farmland

2.4 退耕還草過(guò)程中氮循環(huán)功能基因的變化特征

利用實(shí)時(shí)定量 PCR方法分析了土壤中與氮循環(huán)有關(guān)的關(guān)鍵功能基因，包括固氮有關(guān)的nifH基因、與硝化作用有關(guān)的amoA-AOA基因、amoA-AOB基因、反硝化作用有關(guān)的nirK和nirS基因。結(jié)果顯示，在4個(gè)樣地中土壤中nifH的拷貝數(shù)是 1.31×108—4.04×108g-1，amoA-AOA 的拷貝數(shù)是 0.33×108—2.47×108g-1，amoA-AOB 的拷貝數(shù)是0.31×107—7.28×107g-1，nirK 的拷貝數(shù)是 3.32×107—4.55×107g-1，nirS的拷貝數(shù)是0.28×107—4.30×107g-1（圖6）。農(nóng)田中5種氮循環(huán)有關(guān)的關(guān)鍵功能基因的拷貝數(shù)均顯著高于退耕還草自然恢復(fù)樣地，amoA-AOA、amoA-AOB、nifH、nirS的拷貝數(shù)在4個(gè)樣地間有顯著差異（P＜0.05），且隨著恢復(fù)年限的增長(zhǎng)，amoA-AOB與 nifH的拷貝數(shù)顯著增加（P＜0.05），nirK的拷貝數(shù)在4個(gè)樣地間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

圖6 農(nóng)田和不同恢復(fù)年限草地參與氮循環(huán)主要過(guò)程的功能基因拷貝數(shù)（amoA-AOA,amoA-AOB,nifH,nirK and nirS）Figure 6 Gene copy numbers of functional genes involved in major steps of the nitrogen cycle (amoA-AOA,amoA-AOB,nifH,nirK and nirS) in different revegetation grasslands and farmland

2.5 氮循環(huán)功能基因與環(huán)境參數(shù)和優(yōu)勢(shì)類群的相關(guān)關(guān)系

用Pearson相關(guān)性分析環(huán)境因子對(duì)氮循環(huán)相關(guān)基因拷貝數(shù)的影響。編碼氨單加氧酶基因amoA-AOA與amoA-AOB對(duì)環(huán)境因子的響應(yīng)一致，amoA-AOA與amoA-AOB與總碳、總氮、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮顯著正相關(guān)，與土壤含水率顯著負(fù)相關(guān)（圖7）。編碼固氮酶基因 nifH、總碳、總氮、碳氮比與銨態(tài)氮顯著正相關(guān)。編碼亞硝酸還原酶基因nirS、nirK對(duì)環(huán)境因子的響應(yīng)不同，環(huán)境因子與nirK相關(guān)性不顯著，但nirS與總碳、總氮、銨態(tài)氮與硝態(tài)氮顯著正相關(guān)，與土壤含水量顯著負(fù)相關(guān)。

圖7 參與氮循環(huán)主要過(guò)程的功能基因與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)關(guān)系Figure 7 Correlations between gene copy numbers of functional genes involving in nitrogen cycling and soil physicochemical properties

氮循環(huán)相關(guān)基因與細(xì)菌優(yōu)勢(shì)門(mén)的相關(guān)性（表3）表明，氮循環(huán)相關(guān)基因與優(yōu)勢(shì)門(mén)具有一定的相關(guān)性。其中，amoA-AOA基因與綠彎菌門(mén)和擬桿菌門(mén)極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與粘球菌門(mén)顯著正相關(guān)（P＜0.05）；amoB-AOB基因與綠彎菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和粘球菌門(mén)極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；nirK基因與擬桿菌門(mén)極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；nirS基因與綠彎菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和粘球菌門(mén)極顯著正相關(guān)（P＜0.01）。

表3 參與氮循環(huán)主要過(guò)程的功能基因與優(yōu)勢(shì)門(mén)的相關(guān)關(guān)系Table 3 Correlation between dominant phylum and functional genes involved in the main processes of nitrogen cycling

3 討論

3.1 退耕還草過(guò)程中植物與土壤性質(zhì)的變化

我們的結(jié)果顯示恢復(fù) 15年的草地植物生物多樣性最高，隨著恢復(fù)年限的增長(zhǎng)，草地優(yōu)勢(shì)種發(fā)生變化，生物多樣性降低。與Zhang et al.（2016）和Wang et al.（2009）的研究一致，植物多樣性與豐富度在退耕后呈駝峰型變化，退耕還草后植物多樣性與豐富度持續(xù)增加，在植物群落演替中期物種豐富度最高，而后隨著退耕年限的增加而減少。這是由于恢復(fù)初期機(jī)會(huì)物種先占據(jù)，隨后隨著累積資源的增加，物種豐富度增加。隨著生態(tài)系統(tǒng)的成熟，強(qiáng)大的競(jìng)爭(zhēng)對(duì)手可能會(huì)在后期占據(jù)主導(dǎo)地位，導(dǎo)致物種豐富度下降，反映了植物在草地恢復(fù)過(guò)程中由于環(huán)境變化和種間競(jìng)爭(zhēng)而導(dǎo)致群落結(jié)構(gòu)的變化（海旭瑩等，2020）。

退耕初期，因?yàn)橥Ｖ沽朔柿系妮斎耄寥鲤B(yǎng)分含量顯著降低。然而，隨著自然恢復(fù)年限的增加，研究發(fā)現(xiàn)地上植被發(fā)生次生演替，土壤有機(jī)殘?bào)w和根系分泌物的輸入量逐漸增加（Zhang et al.，2016），與該研究的結(jié)果一致，土壤中積累的養(yǎng)分水平（TC、TN）隨退耕年限逐漸增加，且蔗糖酶活性也逐漸增加，說(shuō)明自然恢復(fù)導(dǎo)致了草地碳氮的積累。植被自然恢復(fù)過(guò)程中，植物的枯枝落葉可將部分養(yǎng)分歸還土壤，土壤碳含量積累可能歸因于凋落物以及根系的數(shù)量和質(zhì)量逐漸增多，促進(jìn)了土壤碳的礦化過(guò)程（Li et al.，2004）；此外，隨著恢復(fù)年限的增加，與固氮作用有關(guān)的豆科植物增加促進(jìn)了氮的積累（張文彥等，2010）；我們的結(jié)果均體現(xiàn)出植被自然恢復(fù)對(duì)土壤系統(tǒng)有積極影響。

3.2 退耕還草過(guò)程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化

地上植被演替影響植物根系的生長(zhǎng)，引起土壤細(xì)菌群落組成和多樣性的變化。本研究中，沒(méi)有額外施肥的退耕草地放線菌門(mén)更豐富，這是由于放線菌門(mén)對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的貧乏有較高耐受性，且對(duì)干燥環(huán)境有較高抗性（Schimel et al.，2007）。植被自然恢復(fù)過(guò)程顯著增加了綠彎菌門(mén)的豐度，綠彎菌門(mén)是環(huán)境中C、N等元素生物地球化學(xué)循環(huán)的重要參與者，且與土壤中積累的養(yǎng)分水平（TC、TN）顯著相關(guān)。Tscherko et al.（2005）證明，在植被演替期間，土壤C和N資源對(duì)確定土壤微生物群落組成非常重要。Lozano et al.（2014）也報(bào)告了廢棄耕地細(xì)菌群落組成沿退耕年限順序的變化，顯示出植被自然恢復(fù)對(duì)地下微生物群落具有顯著作用。

隨著長(zhǎng)期的植被自然恢復(fù)，土壤營(yíng)養(yǎng)資源不斷改善，為微生物提供了更多的可用生態(tài)位。關(guān)于植被演替對(duì)土壤細(xì)菌群落多樣性和結(jié)構(gòu)的影響的尚有爭(zhēng)議（Hossain et al.，2011；Lin et al.，2012）。我們的結(jié)果表明，隨著恢復(fù)時(shí)間的推移，細(xì)菌群落多樣性增加，且土壤細(xì)菌群落的α多樣性與植物群落的α多樣性之間有顯著相關(guān)關(guān)系，表明植物和微生物群落的演替過(guò)程是同步的，Zhang et al.（2016）的報(bào)道也支持了我們的結(jié)果。Lozano et al.（2014）發(fā)現(xiàn)了棄耕地土壤植被恢復(fù)過(guò)程中細(xì)菌群落演替階段之間的明顯分離，但與Kuramae et al.（2011）的研究結(jié)果相反，他們發(fā)現(xiàn)了大量的微生物群落重疊，在草原的時(shí)間序列上沒(méi)有明顯的差異。我們基于Bray-Curtis的NMDS結(jié)果與Lozano et al.（2014）結(jié)果一致，顯示細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)沿時(shí)間序列發(fā)生了顯著變化。

相關(guān)分析和RDA表明，優(yōu)勢(shì)菌門(mén)（放線菌門(mén)、變形菌門(mén)、酸桿菌門(mén)和綠彎菌門(mén)）的豐度與土壤養(yǎng)分水平顯著相關(guān)。土壤總碳、總氮、碳氮比與銨態(tài)氮是影響黃土高原亞高山退耕還草自然恢復(fù)土地細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主要環(huán)境因素。之前的研究表明，土壤銨態(tài)氮含量對(duì)土壤中主要細(xì)菌類群的相對(duì)豐度有正向影響（Yao et al.，2014；Yuan et al.，2014），合適的土壤碳氮比含量是微生物群落生長(zhǎng)繁殖的驅(qū)動(dòng)力，我們的結(jié)果也證實(shí)了這點(diǎn)，支持了土壤碳、氮組分在細(xì)菌群落形成中的重要性。變形菌門(mén)中包含高比例的特定固氮根瘤菌，研究表明氮肥處理對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響因研究地域不同存在差異（Bai et al.，2021）。我們的結(jié)果顯示恢復(fù)后期雖C、N積累，但變形菌門(mén)的豐度隨著自然恢復(fù)的時(shí)間序列減少，且豐度與土壤水分負(fù)相關(guān)，與硝態(tài)氮和脲酶活性顯著正相關(guān)，表明在亞高山干旱環(huán)境中變形菌門(mén)在氮代謝過(guò)程中產(chǎn)生了重要作用。此外，結(jié)果顯示酸桿菌門(mén)的Blastocatellia隨著恢復(fù)時(shí)間顯著增加，酸桿菌門(mén)屬于寡營(yíng)養(yǎng)性型細(xì)菌（王光華等，2020），該發(fā)現(xiàn)與Campbell et al.（2010）報(bào)道的結(jié)果不一致，可能與亞高山特殊的地域環(huán)境（如低溫）有關(guān)。

3.3 退耕還草過(guò)程中細(xì)菌功能類群的變化

氮是土壤中重要的養(yǎng)分元素，土壤氮循環(huán)對(duì)土壤健康有重要的影響，土壤微生物在氮循環(huán)過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用（賀紀(jì)正等，2013）。本研究中，由于農(nóng)田有額外的氮肥輸入，農(nóng)田土壤比恢復(fù)草地土壤中的氮代謝相關(guān)的基因更豐富，表明農(nóng)田土壤中固氮、硝化、反硝化作用較棄耕地土壤更強(qiáng)。氮主要通過(guò)生物固定進(jìn)入陸地生態(tài)系統(tǒng)，nifH基因是固氮作用的標(biāo)志性基因，編碼固氮酶鐵蛋白組分（Wang et al.，2017；Nie et al.，2019）。在自然恢復(fù) 30年達(dá)到最高值，表明固氮能力隨著植被自然恢復(fù)時(shí)間的推移而加強(qiáng)，我們的結(jié)果顯示土壤全氮含量與nifH基因豐度顯著相關(guān)，這與在西藏高山草地土壤和長(zhǎng)白山溫帶森林土壤中的研究結(jié)果一致（Yang et al.，2013；Tang et al.，2018）。amoA-AOA與amoA-AOB基因驅(qū)動(dòng)土壤中氨氧化過(guò)程，該過(guò)程是硝化作用的第一步（Schmidt et al.，2019）。本研究發(fā)現(xiàn)amoA-AOA基因在草甸自然恢復(fù)20年達(dá)到最高值，amoA-AOB基因隨自然恢復(fù)顯著增加，且與總碳、總氮含量顯著正相關(guān)，大部分研究結(jié)果均認(rèn)為底物濃度是影響氨氧化微生物在土壤中生長(zhǎng)并發(fā)揮氨氧化功能的主要因素（Martens et al.，2009），本研究也證實(shí)了這一結(jié)果。同時(shí)，amoA-AOA和amoA-AOB基因與綠彎菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和粘球菌門(mén)顯著正相關(guān)，表明這3個(gè)優(yōu)勢(shì)門(mén)可能參與了氨氧化過(guò)程，nirS和nirK基因是將亞硝酸鹽還原為NO的功能基因，是反硝化作用的標(biāo)志性反應(yīng)（Wang et al.，2020）。本研究中隨著草甸自然恢復(fù)nirS和nirK基因增加不顯著（（P＞0.05）），表明亞高山草甸的自然恢復(fù)沒(méi)有顯著增加土壤的反硝化作用。研究發(fā)現(xiàn)土壤含氮量等是微生物反硝化過(guò)程的重要影響因素（Blaud et al.，2017；王楊，2014），本研究也發(fā)現(xiàn)nirS與總氮、硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量有顯著的相關(guān)關(guān)系。因此，亞高山退耕還草自然恢復(fù)過(guò)程不僅會(huì)改變微生物群落結(jié)構(gòu)，還會(huì)通過(guò)微生物功能基因豐度的變化而顯著影響到土壤中的物質(zhì)循環(huán)過(guò)程（Zhang et al.，2007）。

4 結(jié)論

亞高山草甸自然恢復(fù)顯著改變了地上植被的多樣性，土壤的養(yǎng)分條件也隨著土壤有機(jī)殘?bào)w的積累顯著改善。植被恢復(fù)改善了亞高山的土壤養(yǎng)分資源，為微生物提供提了更多生態(tài)位，土壤細(xì)菌群落的多樣性沿自然恢復(fù)年限順序顯著增加，群落結(jié)構(gòu)也發(fā)生了顯著變化。同時(shí)，隨著地上植被的恢復(fù)演替，固氮作用的標(biāo)志性基因 nifH基因豐度顯著增加，參與氨氧化過(guò)程的amoA-AOA和amoA-AOB基因豐度也顯著增加，表明亞高山草甸自然恢復(fù)加強(qiáng)了土壤的固氮與硝化過(guò)程。通過(guò)對(duì)環(huán)境因子與細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)和功能基因分析證實(shí)，土壤碳氮含量是影響亞高山退耕還草自然恢復(fù)土壤細(xì)菌群落的主要環(huán)境因素。本研究全面關(guān)聯(lián)了植被、土壤性質(zhì)、微生物群落結(jié)構(gòu)與氮循環(huán)相關(guān)功能基因，為制定亞高山退耕還草措施提供了數(shù)據(jù)依據(jù)，并為亞高山草地生態(tài)恢復(fù)策略提供了理論支撐。