文/丁寧 譚雨青 洪惠 羅永康

隨著我國水產(chǎn)養(yǎng)殖加工技術(shù)的發(fā)展與國民膳食結(jié)構(gòu)不斷均衡，消費者對具有優(yōu)質(zhì)蛋白含量高、脂肪含量低等特點的水產(chǎn)品消費需求日益增加。魚丸、魚糕和模擬蟹肉等魚糜制品及冷凍調(diào)理食品在水產(chǎn)品加工行業(yè)中占據(jù)著重要地位，此類產(chǎn)品風味良好、食用方便的特點符合消費者需求。但魚糜制品生產(chǎn)過程中的凝膠劣化效應（Modori effect）使得產(chǎn)品彈性下降、凝膠強度減小，在一定程度上制約了魚糜產(chǎn)品市場的擴大。為闡明魚糜在加工過程中凝膠強度下降的原因，早在20世紀80年代就有學者對此展開研究，并在魚肌肉中發(fā)現(xiàn)了導致肌原纖維蛋白降解的非溶酶體蛋白酶——I型蛋白酶（絲氨酸蛋白酶），它能夠在體外降解平滑肌和骨骼肌中的肌球蛋白與肌動蛋白。目前研究人員普遍認為內(nèi)源性絲氨酸蛋白酶，即魚體內(nèi)自身存在的蛋白酶，尤其是肌原纖維結(jié)合型絲氨酸蛋白酶是魚糜凝膠劣化的關(guān)鍵作用酶。

本文對魚類內(nèi)源性絲氨酸蛋白酶的性質(zhì)、分離純化及其抑制劑研究展開綜述，并對目前增強魚糜凝膠強度的方法進展進行簡要介紹，以期為魚糜制品的生產(chǎn)加工及其凝膠性能的改善提供理論基礎(chǔ)。

一、內(nèi)源性絲氨酸蛋白酶的性質(zhì)

絲氨酸蛋白酶是一類堿性蛋白酶家族，包含胰蛋白酶、彈性蛋白酶等多種水解酶，在魚體生理調(diào)控方面起著重要作用。絲氨酸蛋白酶因其活性絲氨酸殘基Ser195能與底物發(fā)生親和反應而得名，其活性部位是由His57、Asp102、Ser195殘基構(gòu)成的催化中心三聯(lián)體，三個殘基分別位于C端（His195）和N端結(jié)構(gòu)域（Asp 102 &His 57），如圖1所示（由于目前關(guān)于魚肉中的MBSP研究有限，其三維結(jié)構(gòu)并未完全闡明，因此以胰蛋白為例展示活性中心的結(jié)構(gòu)）。盡管不同絲氨酸蛋白酶在進化過程中一級序列高度可變，但其核心催化結(jié)構(gòu)相對保守和穩(wěn)定，具有相同的催化機制。即絲氨酸蛋白酶的一般特性是通過激活活性中心進行催化，但對底物具有特異性。

圖1 胰蛋白酶（PDB編號：1A0J）三維結(jié)構(gòu)示意圖

在魚類肌肉中，絲氨酸蛋白酶以肌漿絲氨酸蛋白酶（Sarcoplasm serine protease，SSP）和肌原纖維結(jié)合型絲氨酸蛋白酶（Myofibril-bound serine protease，MBSP）兩種形式存在，其中肌漿絲氨酸蛋白酶可經(jīng)漂洗從魚糜中除去，而肌原纖結(jié)合型絲氨酸蛋白酶與肌原纖維蛋白穩(wěn)固結(jié)合、不易洗脫，不僅能夠分解肌球蛋白重鏈（Myosin heavy chain，MHC），且在長時間加熱條件下對原肌球蛋白、輔肌動蛋白和肌動蛋白都有一定程度的降解，因此在凝膠劣化過程中起主要作用。在大多數(shù)淡水魚中，MBSP的最適溫度在50℃～55℃，最適pH值介于7.0～8.0，如表1所示。MBSP的分子量因生物種類不同而存在明顯差異。在淡水魚中，MBSP多為28kD左右的單亞基蛋白，在海水魚中多以同源二聚體形式存在，分子量在30kD～70kD不等。圖2列出了不同內(nèi)源性絲氨酸酶N端氨基酸序列與草魚胰蛋白酶的序列比對，它們表現(xiàn)出高度同源性，因此也稱MBSP為類胰蛋白酶型絲氨酸蛋白酶（Trypsin-like serine protease）。

表1 不同魚類中內(nèi)源性絲氨酸蛋白酶的特性

圖2 不同魚類中絲氨酸蛋白酶與胰蛋白酶的N端氨基酸序列比對

內(nèi)源性絲氨酸蛋白酶能夠特異性裂解精氨酸殘基的羧基端肽鍵，對賴氨酸殘基也有一定水解作用，但不同來源的絲氨酸蛋白酶的底物特異性略有不同。在水解肽類底物時，只對特定的堿基對表現(xiàn)出偏好性，如在單個堿基的羧基端肽鍵和兩個連續(xù)堿性殘基（例：Arg-Arg、Lys-Arg）之間的肽鍵中，對Arg-Arg的水解程度最大；在水解含MCA（7-氨基-4-甲基香豆素）的熒光底物中，傾向于水解Arg或Lys的羧基端肽鍵。這些現(xiàn)象表明底物的一級結(jié)構(gòu)對絲氨酸蛋白酶的降解率有重要影響。如表2所示，P1位置（從底物水解位點起，從C端至N端方向的氨基酸位點依次為P1、P2、P3等）為Arg的底物一般對鯉魚MBSP的親和力更高，P2處的殘基種類變換產(chǎn)生的影響則較小。需要說明的是，由于脯氨酸導向的精氨酸裂解作用（Proline-directed arginyl cleavage），P2位置是Pro的底物對MBSP的親和力更高。而P3位點的氨基酸殘基類型會嚴重影響該酶對底物的水解活性，特別是P3位點為Gly時，幾乎不被MBSP所水解。

表2 鯉魚MBSP的底物特異性

二、內(nèi)源性絲氨酸蛋白酶的分離純化

關(guān)于內(nèi)源性蛋白酶在凝膠降解中的作用在早些時候已被許多研究者所明確，但長期以來人們認為發(fā)揮作用的是一類熱穩(wěn)定堿性蛋白酶（Heatstable alkaline protease，HAP）。最早，Kinoshita從金線魚（）中分離出一種能夠有效降解肌球蛋白重鏈且不同于HAP的蛋白酶。主要方法是以背部肌肉勻漿后的上清液作為粗酶液，然后經(jīng)過DEAE-cellulose柱、Con A-Sepharose柱和Arginine-Sepharose柱層析純化至電泳級純度。研究結(jié)果表明該酶是一種絲氨酸蛋白酶，在中性pH范圍、50℃～70℃下具有對MHC的降解活性，并表現(xiàn)出類胰蛋白酶的底物特異性。隨后，關(guān)于SSP的分離純化主要是通過硫酸銨沉淀法，如Cao等在白姑魚（）、Liu等在金線魚（）中的分離方法。SSP在當時被認為是凝膠降解的主要原因，而Toyohara發(fā)現(xiàn)肌漿與肌原纖維中所含凝膠降解因子（Gel degradation-inducing factor，GIF）對凝膠的降解效果在不同魚種中有明顯不同，但洗去肌漿的肌原纖維凝膠降解更為嚴重，這也說明肌原纖維本身具有的GIF才是凝膠劣化現(xiàn)象主要因素。

1997年，Osatomi等首次在鯉魚（）肌肉肌原纖維中分離純化出MBSP，所采用的方法是首先提取出肌原纖維蛋白，置于高濃度鹽溶液、酸性條件下分離MBSP，所得粗提液先后經(jīng)過凝膠過濾層析和親和柱層析純化，得到電泳級純度MBSP，分離純化流程見圖3。此后，其他淡水魚中的MBSP都陸續(xù)得到分離純化。Cao在酸性條件下（pH4.0）分離出鰱魚MBSP，超濾濃縮后通過Sephacryl S-200、High-Q離子交換柱和Arginine Sepharose-4B層析柱進行純化。由于淡水魚和海水魚中MBSP的一級結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)及與肌原纖維的結(jié)合方式不盡相同，提取海水魚的方法需要在此基礎(chǔ)上加以改進。2000年，Cao從狗母魚（）中分離出肌原纖維，在pH6.0、55℃加熱條件下處理5min得到粗酶液，先后通過陰離子交換層析、凝膠過濾層析、羥基磷灰石層析和親和層析進行純化得到MBSP。同樣是在狗母魚中，Ohkubo對該方法進行了一些改動，得到活性更高的MBSP。所采用的方法是在相同條件下（pH6.0，55℃）得到粗酶液后凍干，溶解于1M KCl溶液后透析，與乙醇按照7:3的比例混合、離心后取上清液，再次透析后依次進行Q-sepharose柱、Phenyl Sepharose CL-4B柱純化。

圖3 分離內(nèi)源性絲氨酸蛋白酶流程圖

三、魚類絲氨酸蛋白酶的抑制劑研究

目前，許多食品添加劑、酶制劑及新型加工技術(shù)等陸續(xù)應用于魚糜制品的生產(chǎn)，以提高產(chǎn)品的凝膠性能，其中絲氨酸蛋白酶抑制劑的添加能夠顯著抑制內(nèi)源性絲氨酸蛋白酶的活性從而改善凝膠劣化現(xiàn)象。已知的絲氨酸蛋白酶抑制劑（Serine protease inhibitor，SPI）包括天然抑制劑和小分子化學制劑。天然絲氨酸蛋白酶抑制劑存在于動植物及微生物中，是能夠引起酶活力下降的蛋白或肽，一般以具有抑制活性的亞穩(wěn)態(tài)構(gòu)象存在，當與靶酶結(jié)合后結(jié)構(gòu)重排，形成非常穩(wěn)固的共價復合物，不可逆競爭性抑制靶酶活性。對于魚類中的絲氨酸蛋白酶來說，可根據(jù)是否來源于魚體分為外源性抑制劑和內(nèi)源性抑制劑。

（一）外源性抑制劑

胰蛋白酶抑制劑是常見的絲氨酸蛋白酶抑制劑種類之一，通過自身的P1位點與胰蛋白酶的活性中心以氫鍵等作用力結(jié)合而發(fā)揮抑制作用。豆類中富含胰蛋白酶抑制劑，分為Kunitz型和Bowman-Brik型，后者因其特殊的對稱結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定的二硫鍵而具有更高的蛋白酶抑制活性和耐熱性，更受研究者青睞。國內(nèi)外已有很多報道將豆類胰蛋白酶抑制劑（Soybean trypsin inhibitor，SBTI）用于提升魚糜品質(zhì)，結(jié)果顯示加入大豆蛋白酶抑制劑、綠豆蛋白酶抑制劑等的處理組與對照組相比，抑制肌原纖維蛋白降解、增強保水能力與凝膠強度效果顯著，這也有力證實了絲氨酸蛋白酶參與了魚糜凝膠劣化過程。除了加入魚糜中，豆類胰蛋白酶抑制劑也能夠作用于其他水產(chǎn)品中的內(nèi)源性絲氨酸酶，抑制其肌肉軟化。

此外，常見的化學制劑類絲氨酸蛋白酶抑制劑有4-(2-氨乙基)苯磺酰氟鹽酸鹽（Pefabloc SC）、苯甲基磺酰氟（PMSF）、抑肽酶、乙二胺四乙酸（EDTA）以及N-甲苯磺酰-L-賴氨酸-氯甲基酮（TLCK）等。在大部分研究中，Pefabloc SC、TLCK都能夠抑制魚類內(nèi)源性絲氨酸酶80%以上的活性，而PMSF、EDTA及半胱氨酸蛋白酶抑制劑E-64的抑制率根據(jù)絲氨酸蛋白酶的來源和存在部位略有不同，混合型抑制劑相比單個抑制劑有著更好的抑制效果。

此前，還有研究從牛血漿蛋白、馬鈴薯淀粉等物質(zhì)中提取絲氨酸蛋白酶抑制劑來抑制魚糜凝膠劣化，但其對產(chǎn)品顏色和風味造成影響限制了實際的生產(chǎn)應用。

（二）內(nèi)源性抑制劑

近年來，該領(lǐng)域的研究開始側(cè)重于從魚類自身的肌肉或其他器官中提取出特異針對某一絲氨酸蛋白酶的內(nèi)源性抑制劑。Cao等首次從白姑魚中發(fā)現(xiàn)一種新型的肌原纖維結(jié)合型絲氨酸蛋白酶抑制劑（MBSPI），通過序列測定、酶學特性分析發(fā)現(xiàn)該MBSPI實際上是葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶（glucose phosphate isomerase，GPI）。類似的，鯽魚GPI也能夠特異性抑制自身MBSP，動力學研究結(jié)果顯示抑制類型為可逆競爭性抑制，見圖4。隨后，狗母魚中的MBSPI也得到分離純化，能夠顯著抑制狗母魚的MBSP，但在對其他酶（SSP、鯉魚MBSP、牛胰蛋白酶等）的抑制中表現(xiàn)出高度的特異性，即用高濃度的MBSPI處理時，鯉魚MBSP的活性并未受到明顯影響。研究人員推測這可能與淡水魚、海水魚MBSP的結(jié)構(gòu)差異有關(guān)。除與抑制劑結(jié)合的活性中心可能不同以外，其他位點也可能在空間上影響MBSPI與酶的相互作用。近年，還有研究者從魷魚卵巢中提取出SPI，以2%比例添加到印度鯖魚魚糜中，能夠提高魚糜的凝膠性能，且不造成負面感官影響。這類天然SPI可以替代提高凝膠強度的添加劑，在食品加工中有很大應用潛力。

圖4 競爭性抑制示意圖

四、總結(jié)與展望

魚糜凝膠強度一直是影響產(chǎn)品適口性和消費者接受程度的重要因素，目前已確認內(nèi)源性絲氨酸蛋白酶是參與魚類肌原纖維降解的重要酶類之一，特別是在魚糜加工中絲氨酸蛋白酶對凝膠劣化的作用最為顯著，同時也是導致冷藏期間的魚類或其他水產(chǎn)品肉質(zhì)軟化的原因之一。通過添加適當?shù)囊种苿﹣斫档汪~糜等水產(chǎn)品中的內(nèi)源性絲氨酸蛋白酶活性，可以顯著提升產(chǎn)品品質(zhì)，其結(jié)合脂質(zhì)、多糖等外源物添加以及超高壓、微波加熱等物理場技術(shù)，是未來改善凝膠性能的主要研究方向。雖然關(guān)于絲氨酸蛋白酶抑制劑的研究已經(jīng)十分廣泛，但對內(nèi)源性抑制劑的結(jié)構(gòu)特性及作用機制還有待繼續(xù)探索，期望下一步通過基因克隆、重組表達等手段開發(fā)新型特異性絲氨酸蛋白酶抑制劑應用于魚糜等水產(chǎn)品的工業(yè)生產(chǎn)。