管慶霞，聶澤卉，董 詩，溫美欣，趙夢(mèng)瑤，林澤榆，王彥偉*

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江瀚泊爾科技發(fā)展有限公司，黑龍江 哈爾濱 150040）

血虛（blood deficiency，BD）是女性常見疾病，通常是由勞累過度，缺乏營(yíng)養(yǎng)，失血過多等原因所致[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，女性血虛發(fā)病率高達(dá)64 %，并呈逐年遞增態(tài)勢(shì)，對(duì)女性身心健康造成極大影響。目前有多種緩解血虛的方法，中藥治療法仍占據(jù)主要地位，臨床應(yīng)用較廣泛的是中藥復(fù)方制劑[2]。

復(fù)方鹿茸超微混懸酒所用處方是由依據(jù)中醫(yī)臨床經(jīng)驗(yàn)而來，方中11味中藥：鹿茸擅在其益精填髓，精旺以化氣生血；川芎通行血海以調(diào)經(jīng)[3]；當(dāng)歸營(yíng)養(yǎng)血脈以榮經(jīng)[4]；白芍?jǐn)筷幰砸婺I肝；黃芪補(bǔ)氣以益衛(wèi)陽；熟地補(bǔ)血以滋沖任；人參扶元以通血脈；肉桂溫營(yíng)血以散外邪；柏子仁養(yǎng)血以安神；丹皮涼血熱以散滯[5]；烏梅養(yǎng)肝以補(bǔ)血，共同配伍，共奏補(bǔ)血調(diào)經(jīng)之效。本研究將鹿茸制為超微粉，提取其他藥味的有效成分，以酒為溶媒，將超微粉混懸劑與藥酒兩者的優(yōu)勢(shì)相結(jié)合，并對(duì)其處方工藝、藥效等進(jìn)行研究評(píng)價(jià)，以期實(shí)現(xiàn)用藥少、藥效強(qiáng)、方便調(diào)配、便于服用、藥效穩(wěn)定、增強(qiáng)補(bǔ)血作用的效果。

1 儀器與材料

YJ-L10氣流粉碎機(jī)（濰坊精華粉體工程設(shè)備公司），SIGMA500掃描電子顯微鏡（北京歐波同光學(xué)），Waters e2695-2698高效液相色譜儀系統(tǒng)（美國(guó)Waters），UV-4802雙束紫外可見分光光度計(jì)（尤尼柯儀器），SB-5200D超聲波清洗機(jī)（寧波新芝），AB265-S梅特勒電子天平（瑞士梅特勒托利多），XS-500i全自動(dòng)血液分析儀（希森美康）；鹿茸（市購），中藥飲片（黑龍江匯仁藥材），環(huán)磷酰胺（批號(hào)：A22A7X13656，上海源葉），乙酰苯肼（批號(hào)：SJ0121RA14，上海源葉），芍藥苷對(duì)照品、阿魏酸對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院）；昆明種小鼠，雌性，體重20±2 g，清潔級(jí)動(dòng)物（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)GLP實(shí)驗(yàn)中心）；復(fù)方阿膠漿（山東阿膠）。

2 方法與結(jié)果

2.1 芍藥苷與阿魏酸分析方法的建立

2.1.1 色譜條件 芍藥苷色譜條件：色譜柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm；流速：1.0 ml/min；進(jìn)樣量：10 μl；柱溫：30 ℃。阿魏酸色譜條件：色譜柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測(cè)波長(zhǎng)：321 nm；流速：1.0 ml/min；進(jìn)樣量：10 μl；柱溫：35 ℃。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱定芍藥苷對(duì)照品3.56 mg，置入10 ml棕色量瓶，加甲醇使其溶解并稀釋至刻度，得芍藥苷儲(chǔ)備液。精密稱定阿魏酸對(duì)照品2.39 mg，置入25 ml棕色量瓶，加70 %甲醇使其溶解并稀釋至刻度，得到阿魏酸儲(chǔ)備液。

2.1.3 供試品溶液的制備 將不含鹿茸的其他藥味按照處方比例粉碎混合，稱取約2 g，加入20倍60 %的乙醇回流提取3次，每次1 h，合并提取液，過濾，定容至25 ml，減壓濃縮，冷凍干燥，得到固體粉末，取一定量用甲醇或者70 %甲醇復(fù)溶，得到供試品溶液[6]。

2.1.4 空白對(duì)照溶液的制備 以70 %甲醇作為空白對(duì)照溶液。

2.1.5 專屬性考察 分別取芍藥苷與阿魏酸的對(duì)照品溶液、供試品溶液、空白溶液適量，按照色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜，見圖1。結(jié)果表明：在檢測(cè)條件下，溶劑對(duì)芍藥苷與阿魏酸的含量測(cè)定均無干擾，該方法的專屬性良好。

圖1 高效液相色譜圖

2.1.6 方法學(xué)考察 精密吸取2.1.2項(xiàng)下芍藥苷儲(chǔ)備液，用甲醇逐級(jí)稀釋至濃度分別為356.00，178.00，89.00，44.50，22.25 μg/ml，以對(duì)照品的濃度（X，μg/ml）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=14 512X+94 239（R2=0.9988）。結(jié)果表明，芍藥苷在22.25～356.00 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；精密吸取2.1.2項(xiàng)下阿魏酸儲(chǔ)備液，用70 %甲醇逐級(jí)稀釋至濃度分別為15.30，7.65，3.82，1.91，0.96，0.24 μg/ml，以對(duì)照品的濃度（X，μg/ml）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=57 911X+6995.4（R2=0.9997），結(jié)果表明，阿魏酸濃度在0.24～15.30 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。精密吸取芍藥苷儲(chǔ)備液和阿魏酸儲(chǔ)備液，按照2.1.1項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)得峰面積RSD小于2 %，表明精密度良好。取2.1.3項(xiàng)下供試品溶液，在24 h內(nèi)按2.1.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積RSD小于2 %，表明供試品溶液溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。芍藥苷加樣回收率回收率范圍99.35 %～102.35 %，RSD小于2 %，阿魏酸加樣回收率范圍97.47 %～102.38 %，RSD小于2 %，滿足分析要求。

2.2 鹿茸藥液的制備研究

將鹿茸凈化、切片、冷凍干燥后用氣流粉碎機(jī)超微粉碎。精密稱量20.0 mg鹿茸超微粉，加入50 ml基酒，震蕩搖勻，配制為鹿茸藥液，為類乳白色混懸液。

2.3 不含鹿茸的藥液制備研究

2.3.1 提取方法考察 以芍藥苷和阿魏酸的總含量與出膏率為指標(biāo)考察不同提取方法對(duì)不含鹿茸的中藥提取效果的影響。取不含鹿茸的其他藥味粉2 g，加10倍量50 %乙醇，分別用超聲法、回流法[7]、煎煮法提取2次，每次30 min，合并提取液過濾，定容至25 ml，按2.1.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，計(jì)算含量，結(jié)果見表1。提取液經(jīng)減壓濃縮，冷凍干燥后稱重計(jì)算出膏率。綜合考慮，以回流法作為芍藥苷與阿魏酸的提取方法。

表1 提取方法的考察（n=6）

2.3.2 單因素考察

2.3.2.1 乙醇濃度考察 設(shè)定乙醇濃度為50 %，60 %，70 %，80 %，90 %，95 %6個(gè)水平進(jìn)行考察。結(jié)果見圖2，70 %乙醇時(shí)出膏率最多。

圖2 乙醇濃度對(duì)總含量及出膏率的影響

2.3.2.2 液料比考察 設(shè)定液料比分別為8，10，12，15，20 g/ml 5個(gè)水平進(jìn)行考察。結(jié)果見圖3，液料比大于15倍量后，總量及出膏率均逐漸降低。

圖3 料液比對(duì)總含量及出膏率的影響

2.3.2.3 提取時(shí)間的考察 設(shè)定提取時(shí)間分別為0.5，1，1.5，2 h 4個(gè)水平進(jìn)行考察。結(jié)果見表4，提取時(shí)間在1.5 h前，芍藥苷與阿魏酸總量逐漸增大，1.5 h后成分基本保持不變；出膏率在提取時(shí)間1.5 h前同樣逐步增大，1.5 h后有小幅波動(dòng)。

圖4 提取時(shí)間對(duì)總含量及出膏率的影響

2.3.2.4 提取次數(shù)的考察 設(shè)定提取次數(shù)分別為1，2，3，4次4個(gè)水平進(jìn)行考察。結(jié)果見圖5，出膏率在提取3次前逐步增大，3次后基本不變。

圖5 提取次數(shù)對(duì)總含量及出膏率的影響

2.3.3 正交試驗(yàn) 選擇乙醇濃度（A）、液料比（B）、提取時(shí)間（C）、提取次數(shù)（D） 4個(gè)因素，每個(gè)因素選取3個(gè)水平，采用L9（34）表設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)。綜合評(píng)分=（含量/含量最大值）×50+（浸膏得率/浸膏得率最大值）×50。對(duì)綜合評(píng)分進(jìn)行直觀分析和方差分析，結(jié)果見表2和表3。

表2 正交實(shí)驗(yàn)安排及結(jié)果

由表2可見，影響有效成分綜合評(píng)分的因素主次順序?yàn)锽＞D＞A＞C，即液料比＞提取次數(shù)＞乙醇濃度＞提取時(shí)間。得到提取最佳條件為A2B3C3D3，即乙醇濃度60 %、液料比20倍、回流時(shí)間2 h、提取3次。

由表3可見，表明B、D即液料比與提取次數(shù)兩個(gè)因素對(duì)有效成分的含量和出膏率具有顯著性（P＜0.05）影響。C提取時(shí)間對(duì)其無顯著影響，考慮到節(jié)省時(shí)間，選擇最佳工藝為A2B3C1D3，即乙醇濃度60 %、液料比20倍量、回流時(shí)間1 h、3次。

表3 方差分析表

2.3.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 按照上述優(yōu)選的最佳工藝提取（n=3），測(cè)定芍藥苷與阿魏酸總量與出膏率。結(jié)果見表4。由表4可見，單因素考察法和正交試驗(yàn)法優(yōu)選得到的最佳提取工藝有重復(fù)性和穩(wěn)定性。有效成分含量到較高，且能獲得較多的浸膏，工藝可行。

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

2.3.5 干燥 按最佳工藝制得提取液，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)中進(jìn)行真空減壓濃縮，將濃縮液冷凍干燥，密封保存，即得凍干粉。以凍干時(shí)間為橫坐標(biāo)，凍干溫度為縱坐標(biāo)，繪制凍干曲線，見圖6。

圖6 凍干曲線

2.3.6 不含鹿茸的藥液配制 稱取0.60 g凍干粉，分散于50 ml基酒中，震蕩均勻，澄清，調(diào)味，即得不含鹿茸藥液，本品為深紅棕色藥液，酒氣醇香。

2.4 復(fù)方鹿茸超微混懸酒的配制

取鹿茸藥液50 ml，不含鹿茸藥液50 ml，震蕩混合均勻，得100 ml復(fù)方鹿茸超微混懸酒，本品為紅棕色混懸液。

2.5 復(fù)方鹿茸超微混懸酒的補(bǔ)血作用研究

2.5.1 動(dòng)物分組及給藥 取清潔級(jí)雌性小鼠48只，體重20±2 g，隨機(jī)分為6組，每組8只，即正常組、模型組、陽性對(duì)照組、低、中、高劑量組。低、中、高劑量組灌胃給藥劑量分別為0.42，0.84和1.68 mg/(kg·d)，陽性對(duì)照組灌胃給藥劑量10 ml/(kg·d)，正常組及模型組小鼠給予等體積生理鹽水。調(diào)節(jié)酒精度15 %，每日灌胃1次，連續(xù)30 d。模型組、陽性對(duì)照組與給藥組小鼠分別于給藥的第4，10，20天皮下注射乙酰苯肼20，40，20 mg/kg，第10天起，每日腹腔注射環(huán)磷酰胺40 mg/kg，連續(xù)4天制備血虛模型[8]。正常組小鼠同時(shí)注射等量生理鹽水。小鼠造模同時(shí)灌胃給予受試藥物。觀察每組小鼠行為體征并稱重。

2.5.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s），兩組間差異比較用t檢驗(yàn)，多組間采用單因素方差分析（One-way ANOVA），以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.5.3 對(duì)小鼠體重的影響 比較小鼠最開始體重與末次給藥后體重的變化，不同劑量對(duì)小鼠體重的影響，見表5。

表5 復(fù)方鹿茸超微混懸酒對(duì)小鼠體重的影響（±s，n=8）

表5 復(fù)方鹿茸超微混懸酒對(duì)小鼠體重的影響（±s，n=8）

注：#P＜0.05，##P＜0.01 vs正常組；*P＜0.05，**P＜0.01 vs模型組

組別 給藥后體重增加值/g正常組 10.63±1.92模型組 5.25±0.70##陽性對(duì)照組 9.75±0.89**低劑量組 6.38±0.92*中劑量組 7.50±1.41**高劑量組 9.88±1.73**

2.5.4 對(duì)小鼠游泳時(shí)間的影響 各組小鼠均于末次給藥0.5 h后，置游泳箱中，水深不少于30 cm，水溫25±1.0 ℃，記錄小鼠自游泳開始至力竭的時(shí)間（小鼠頭部沉入水中，經(jīng)10 s仍不能返回水面視為力竭）。結(jié)果見表6。

表6 復(fù)方鹿茸超微混懸酒對(duì)小鼠游泳時(shí)間的影響（±s，n=8）

表6 復(fù)方鹿茸超微混懸酒對(duì)小鼠游泳時(shí)間的影響（±s，n=8）

組別 游泳時(shí)間/min正常組 118.35±4.26模型組 64.37±2.22##陽性對(duì)照組 109.42±1.38**低劑量組 78.05±2.19中劑量組 96.35±3.43*高劑量組 107.13±5.06**

2.5.5 對(duì)小鼠外周血常規(guī)的影響 小鼠眼底靜脈叢取血，采用XS-500i全自動(dòng)血液分析儀檢測(cè)血常規(guī)，主要包括外周血象中紅細(xì)胞RBC（1012/L），血紅蛋白HGB（g/L)，紅細(xì)胞壓積HCT（L/L），血小板PLT（109/L），白細(xì)胞WBC（109/L）單核細(xì)胞百分比MONO（%）共6項(xiàng)指標(biāo)，見圖7。

圖7 復(fù)方鹿茸超微混懸酒對(duì)小鼠外周血象的影響

2.5.6 對(duì)小鼠免疫器官的影響 小鼠脫頸椎處死，剝?nèi)⌒叵佟⑵⑴K和肝臟，剔除旁邊的組織和筋膜后稱濕重。按公式計(jì)算胸腺指數(shù)（thymus index，TI）、脾臟指數(shù)（spleen index，SI）和肝臟指數(shù)（liver index，LI），計(jì)算公式分別如下：TI=胸腺重（mg）/鼠重（g），SI=脾重（mg）/鼠重（g），LI=肝重（mg）/鼠重（g），不同劑量對(duì)小鼠免疫器官的影響見圖8。

圖8 復(fù)方鹿茸超微混懸酒對(duì)小鼠免疫器官的影響

綜上，高劑量對(duì)小鼠的胸腺重量與TI、脾臟重量與SI、肝臟重量與LI均有顯著性改善作用，中劑量對(duì)小鼠的胸腺重量、脾臟重量與SI、肝臟重量與LI有顯著性改善作用，而低劑量只對(duì)小鼠的脾臟重量與SI、LI有顯著性改善作用。綜合考慮，初步暫定中高劑量對(duì)小鼠具有補(bǔ)血作用。

2.5.7 基于多指標(biāo)綜合指數(shù)法的補(bǔ)血效應(yīng) 依據(jù)多指標(biāo)綜合指數(shù)法，首先對(duì)外周血常規(guī)、臟器和其他等多個(gè)指標(biāo)進(jìn)行歸一化處理即標(biāo)化，當(dāng)模型組相應(yīng)指標(biāo)數(shù)值（value）與正常組相比升高時(shí)，V標(biāo)化=（V模型-V給藥）/V模型；當(dāng)模型組相應(yīng)指標(biāo)數(shù)值與正常組相比降低時(shí)，V標(biāo)化=（V給藥-V模型）/V模型。然后依據(jù)前期查閱文獻(xiàn)并綜合專家意見后給出的權(quán)重系數(shù)對(duì)各效應(yīng)指標(biāo)進(jìn)行效應(yīng)整合，指標(biāo)WBC、RBC、HGB取權(quán)重為2，HCT、PLT、MONO%、TI、SI、LI、體重（M鼠）、游泳時(shí)間（T游泳）、胸腺重量（M胸腺）、脾臟重量（M脾臟）、肝臟重量（M肝臟）取權(quán)重為1。各指標(biāo)數(shù)據(jù)的標(biāo)化值乘以各自權(quán)重系數(shù)后的加和值即為該藥物對(duì)于小鼠補(bǔ)血作用的總效應(yīng)值（total effect，TE）。綜合上述多個(gè)指標(biāo)，對(duì)復(fù)方鹿茸超微混懸酒的總補(bǔ)血效應(yīng)進(jìn)行整合，結(jié)果見表7。

由表7可見，經(jīng)過多指標(biāo)綜合指數(shù)法的處理，復(fù)方鹿茸超微混懸酒高中低劑量總補(bǔ)血效應(yīng)順序?yàn)椋焊邉┝浚局袆┝浚镜蛣┝?，高劑量補(bǔ)血效應(yīng)最好。

表7 復(fù)方鹿茸超微混懸酒的總補(bǔ)血效應(yīng)

3 小結(jié)與討論

本實(shí)驗(yàn)采用氣流式粉碎機(jī)對(duì)鹿茸進(jìn)行超微粉碎得到鹿茸超微粉，與基酒配制為鹿茸藥液；通過單因素考察法和正交試驗(yàn)法優(yōu)化提取工藝配制為不含鹿茸的藥液；二者混合得到復(fù)方鹿茸超微混懸酒。在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)中考察真空減壓干燥法與冷凍干燥法對(duì)不含鹿茸的濃縮液干燥效果時(shí)發(fā)現(xiàn)，真空減壓法干燥時(shí)間較長(zhǎng)，且干燥效果不好，故本研究選用冷凍干燥法干燥濃縮液。考慮到方中還有多糖類化合物、貴細(xì)藥材人參活性成分等補(bǔ)益功能成分，可作為下一步深入研究?jī)?nèi)容。

近年，血虛動(dòng)物模型制備方法有失血法、環(huán)磷酰胺化學(xué)損傷法、乙酰苯肼溶血法、免疫介導(dǎo)法、60Co輻照法及復(fù)合法等[9]。因乙酰苯肼、環(huán)磷酰胺操作簡(jiǎn)便易于控制，本研究選用聯(lián)合此兩種方法。環(huán)磷酰胺可損害機(jī)體的免疫器官[10]，同時(shí)使骨髓造血干祖細(xì)胞的集落生成能力降低，導(dǎo)致骨髓造血障礙[11]，因此可制備出血虛模型。乙酰苯肼是一種對(duì)RBC有氧化性損傷作用的強(qiáng)氧化劑，這種損傷可使RBC崩解出現(xiàn)溶血性貧血，RBC和HGB數(shù)量明顯降低，WBC數(shù)量升高，脾臟顯著腫大呈深褐色。乙酰苯肼與環(huán)磷酰胺聯(lián)合應(yīng)用可從雙重環(huán)節(jié)上造成動(dòng)物血虛，其表現(xiàn)為各類細(xì)胞數(shù)量整體下降和免疫器官損傷而萎縮；利用此種方法建立血虛模型，動(dòng)物存活率高，血虛狀態(tài)持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)[12]。乙酰苯肼可導(dǎo)致溶血性血虛證，使WBC升高，環(huán)磷酰胺可引起骨髓抑制性血虛證，使WBC降低[13]，同時(shí)，乙酰苯肼引起的溶血性血虛動(dòng)物表現(xiàn)為胸腺指數(shù)降低，肝臟和脾臟指數(shù)升高，環(huán)磷酰胺引起的骨髓抑制性血虛動(dòng)物表現(xiàn)為胸腺指數(shù)降低，肝臟和脾臟指數(shù)降低，在實(shí)驗(yàn)中血虛模型小鼠表現(xiàn)WBC指數(shù)增高，肝臟和脾臟指數(shù)升高，可知乙酰苯肼所致血虛占主導(dǎo)作用，與外周血中血虛主導(dǎo)作用一致。

本課題應(yīng)用現(xiàn)代超微粉碎技術(shù)，將鹿茸制為超微粉以酒為媒介與復(fù)方提取物相結(jié)合配制為混懸劑，以期達(dá)到用量少、利用度高[14]、副作用小、改善女性血虛體質(zhì)、減輕痛苦的目的。目前，超微粉碎技術(shù)僅局限于單味中藥，中藥復(fù)方及其體外制劑的超微粉碎的研究才剛開始，但是超微粉碎后的中藥復(fù)方成分之間發(fā)生的勻化作用和理化性質(zhì)的變化機(jī)制十分復(fù)雜，將可能成為未來中藥復(fù)方超微粉碎化重點(diǎn)研究的方向。