徐 林，周劍宇

（承德醫(yī)學(xué)院/河北省中藥研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北承德 067000）

神經(jīng)病理性疼痛（neuropathic pain，NP）是一種在全球范圍內(nèi)困擾人類健康的常見疾病[1,2]。NP的病因和機(jī)制非常復(fù)雜，目前尚未充分闡明，且缺乏有效的預(yù)防及治療措施，迫切需要探索新的治療靶點(diǎn)和特效藥物[3]。NP多表現(xiàn)為神經(jīng)免疫紊亂，而神經(jīng)炎性反應(yīng)在疼痛的發(fā)生和發(fā)展階段扮演著重要角色。IL-1β是IL-1家族的成員之一，主要由活化的單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，在免疫應(yīng)答及炎癥反應(yīng)中起重要作用。在NP的發(fā)病機(jī)制中，IL-1β的作用至關(guān)重要[4,5]，而NLRP3炎癥小體是合成成熟IL-1β重要途徑[6,7]。芍藥內(nèi)酯苷為中藥白芍的主要化學(xué)成分，具有廣泛的藥理活性。前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，芍藥內(nèi)酯苷具有對NP大鼠模型的鎮(zhèn)痛作用，并初步探明其作用機(jī)制與通過抑制脊髓膠質(zhì)細(xì)胞激活以降低IL-1β水平有關(guān)[8]。因此，推測芍藥內(nèi)酯苷鎮(zhèn)痛作用與調(diào)控脊髓NLRP3炎癥小體的活化有關(guān)。為證實(shí)該假說，本研究采用大鼠慢性坐骨神經(jīng)壓迫性損傷模型（chronic constriction injury，CCI），觀察芍藥內(nèi)酯苷對NP作用，并圍繞脊髓NLRP3炎癥小體探討芍藥內(nèi)酯苷的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 藥品

芍藥內(nèi)酯苷（購自成都麥德生科技有限公司），MCC950（NLRP3特異性抑制劑，購自MedChemExpress），異氟烷（購自深圳RWD生命科技有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物

40只雄性SD大鼠，體重180～220g（購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，許可證編號：SCXK（京）2016-0006）。飼養(yǎng)于23±1°C環(huán)境下，光照周期12h。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

Bioseb Von Frey電子測痛儀（法國Bioseb公司，BIOEVF4）；R58型小動物麻醉機(jī)（深圳RWD生命科技有限公司）；酶標(biāo)儀（ThermoFisher，1510）；BME-410C熱痛儀（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，BME-410C）；熒光顯微鏡（日本Olympus公司，Bx53）。

1.4 分組及給藥方案

將40只雄性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)（Sham）組，CCI模型組，CCI模型MCC950治療組（CCI+MCC950），CCI模型AF治療組（CCI+AF），每組10只。造模1d后開始，CCI+MCC950組、CCI+AF組每日腹腔注射相應(yīng)藥物溶液（MCC950 10mg/kg，AF 50mg/kg，均采用0.9%生理鹽水稀釋），連續(xù)給藥至術(shù)后11d；Sham組與CCI模型組每日腹腔注射等量0.9%生理鹽水。

1.5 CCI模型制備

參照Bennett的方法[9]，健康雄性SD大鼠通過小動物麻醉機(jī)持續(xù)吸入異氟烷麻醉，右后肢外側(cè)備皮，75%酒精消毒，股骨外側(cè)皮膚切開約1cm，鈍性分離肌肉組織，用玻璃分針分離出坐骨神經(jīng)，于坐骨神經(jīng)大腿段中部結(jié)扎4道4.0號鉻腸線，結(jié)扎力度以壓迫神經(jīng)不阻斷血液供給為宜。結(jié)扎完成后，將坐骨神經(jīng)歸回原位，逐層縫合傷口。Sham組操作相同，但將坐骨神經(jīng)分離后不予結(jié)扎，暴露適當(dāng)時間后縫合傷口。術(shù)后將大鼠置于溫暖環(huán)境待其蘇醒，自由進(jìn)水進(jìn)食，術(shù)后每日觀察大鼠狀態(tài)。

1.6 機(jī)械性刺激縮足反射閾值（paw withdrawal threshold，PWT）

在溫度適宜（23±1°C）的環(huán)境中，將大鼠置于透明有機(jī)玻璃箱中，使其適應(yīng)環(huán)境至少30min。使用Von Frey電子測痛儀垂直于足底皮膚刺激大鼠右后肢足底，記錄大鼠出現(xiàn)縮足反射時的顯示數(shù)值，重復(fù)測量3次，每次間隔5min，計(jì)算3次測量平均值為PWT。各組大鼠均于術(shù)前1d，術(shù)后3d，7d，11d進(jìn)行檢測。

1.7 熱痛縮足閾值（paw withdrawal latency，PWL）

采用BME-410C熱痛儀檢測大鼠PWL，在安靜、溫度適宜（23±1°C）的實(shí)驗(yàn)環(huán)境下，將大鼠放置于有機(jī)玻璃平面上，使其在檢測環(huán)境適應(yīng)一段時間。調(diào)整熱痛儀光源和焦距，以適宜強(qiáng)度的光刺激大鼠右后足底部，記錄大鼠出現(xiàn)縮足反射的時間作為PWL。實(shí)驗(yàn)中，以25s為光照時間上限，以防止大鼠燙傷。重復(fù)測量3次，每次間隔5min，計(jì)算3次測量的平均值作為PWL。各組大鼠均于術(shù)前1d，術(shù)后3d，7d，11d進(jìn)行檢測。

1.8 免疫熒光標(biāo)記

于CCI術(shù)后第11d給藥及行為學(xué)檢測完成后處死大鼠，收集脊髓L4～L5段固定，石蠟包埋，組織切取厚度為5μm切片，切片脫蠟，使用檸檬酸修復(fù)緩沖液（pH 6.0）孵育，3%牛血清白蛋白（BSA）在25°C孵育30min，阻斷非特異性蛋白。切片與兔抗NLRP3抗體（購自美國Novus公司）4°C孵育過夜。PBS（Ph 7.4）洗滌3次后，與連接有Cy3熒光染料的山羊抗兔抗體（購自Servicebio公司）孵育。孵育過后，切片用PBS清洗15min，置于載玻片上，用蓋玻片覆蓋。切片用熒光顯微鏡成像。

1.9 Caspase-1活性分析

CCI術(shù)后第11d，給藥及行為學(xué)測試完成后，處死大鼠，收集脊髓腰椎L4～L5段，放入冷的裂解緩沖液中勻漿，以轉(zhuǎn)速13000r/min離心15min后收集上清液。按照試劑盒說明，使用Caspase-1活性分析試劑盒（碧云天）檢測海馬中Caspase-1活性，使用酶標(biāo)儀在405nm處進(jìn)行吸光度測量。

1.10 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）

CCI術(shù)后第11d給藥及行為學(xué)測試完成后，處死大鼠，收集脊髓腰椎L4～L5段，加入冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）勻漿，13000r/min離心15min，取上清液。血清采用PBS稀釋適宜倍數(shù)，混勻，采用ELISA試劑盒（R&D Systems公司，RLB00）檢測IL-1β含量。在450nm波長條件下由酶標(biāo)儀檢測吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度與OD值建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算IL-1β含量。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 26.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有計(jì)量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（means±SE）表示。多組均數(shù)間的比較采用單因素方差分析，若方差齊采用LSD檢測法，若方差不齊采用Dunnett T3檢驗(yàn)法，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 機(jī)械痛閾與熱痛閾檢測

各組大鼠于術(shù)前機(jī)械性痛閾差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與Sham組相比，CCI組大鼠在術(shù)后3d、7d、11d機(jī)械痛閾顯著降低（P＜0.001），表明CCI手術(shù)誘發(fā)大鼠機(jī)械性痛覺超敏癥狀，成功建立NP模型。與CCI組相比，MCC950給藥組大鼠機(jī)械痛閾在術(shù)后7d、11d顯著提高（P＜0.01，P＜0.001）；與CCI組相比，AF給藥組大鼠在術(shù)后11d機(jī)械性痛閾顯著提高（P＜0.001），結(jié)果表明MCC950和AF均可有效緩解CCI大鼠機(jī)械性痛覺超敏（表1）。各組大鼠術(shù)前熱痛閾差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與Sham組相比，CCI組大鼠在術(shù)后各時間點(diǎn)熱痛閾顯著降低（P＜0.001），表明CCI手術(shù)成功建立NP模型。與CCI組相比，MCC950給藥組大鼠熱痛閾在術(shù)后3d、7d、11d出現(xiàn)顯著提高（P＜0.05，P＜0.001，P＜0.01）；AF給藥組在術(shù)后7d和11d熱痛閾顯著提升（P＜0.01，P＜0.01）。結(jié)果表明MCC950與芍藥內(nèi)酯苷均可有效提高神NP大鼠熱痛閾（表2）。

2.2 脊髓中NLRP3炎癥小體表達(dá)水平

術(shù)后11d收集大鼠脊髓腰椎L4～L5段組織，采用免疫熒光法對脊髓組織中NLRP3進(jìn)行熒光標(biāo)記，觀察各組大鼠脊髓背角NLRP3表達(dá)情況。結(jié)果表明，與Sham組相比，CCI組大鼠脊髓背角NLRP3表達(dá)水平顯著提高（P＜0.05），如附圖A；與CCI組相比，CCI+MCC950組與CCI+AF組大鼠脊髓背角NLRP3表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01），如附圖B。

附圖 A.手術(shù)后第11d各組大鼠脊髓背角中NLRP3炎癥小體免疫熒光染色；B.對脊髓背角中NLRP3的定量分析與Sham組比較，##P＜0.01；與CCI組比較，**P＜0.01

2.3 脊髓Caspase-1活性檢測

術(shù)后11d處死大鼠后，取大鼠脊髓腰椎L4～L5段檢測Caspase-1活性水平。與Sham組相比，CCI組大鼠脊髓Caspase-1活性顯著提高（P＜0.001）。與CCI組相比，CCI+MCC950組、CCI+AF組大鼠脊髓Caspase-1活性水平均顯著降低（P＜0.001）（表3）。

表3 各組大鼠脊髓Caspase-1相對活性水平

2.4 脊髓IL-1β含量測定

術(shù)后11d檢測大鼠脊髓IL-1β含量，與Sham組相比，CCI組大鼠脊髓IL-1β含量顯著提高（P＜0.01）；與CCI組相比，CCI+MCC950組、CCI+AF組大鼠脊髓IL-1β蛋白含量顯著降低（P＜0.05）（表4）。

表4 各組大鼠脊髓IL-1β含量

NP多表現(xiàn)為神經(jīng)免疫紊亂，神經(jīng)炎性反應(yīng)在疼痛的發(fā)生和發(fā)展階段扮演著重要角色。炎癥小體是近年來被人們發(fā)現(xiàn)的一類免疫蛋白復(fù)合物，其存在于胞質(zhì)內(nèi)，可感知機(jī)體內(nèi)的外源性病原相關(guān)分子模式、內(nèi)源性危險(xiǎn)相關(guān)分子模式以及代謝相關(guān)分子模式的各種危險(xiǎn)信號[10]。炎癥小體包括以NBD為主體的支架蛋白、ASC接頭蛋白和pro-caspase-l 3種主要結(jié)構(gòu)[11]。炎癥小體被激活后，各組成分子由接頭蛋白ASC募集并聚合為蛋白復(fù)合小體，自身水解內(nèi)部的pro-caspase-1使其成為成熟caspase-1，從小體中釋放并利用其蛋白酶活性對IL-1β進(jìn)行剪切，促進(jìn)IL-1β成熟，進(jìn)而在免疫炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[12,13]。NLRP3炎癥小體是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最豐富的炎癥小體，也是廣泛神經(jīng)系統(tǒng)疾病中引起神經(jīng)炎癥的關(guān)鍵因素之一[14]。有研究表明，通過特異性抑制劑MCC950抑制NLRP3炎癥小體的激活，可有效緩解痛覺過敏反應(yīng)[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CCI大鼠手術(shù)側(cè)脊髓背角NLPR3表達(dá)上調(diào)，大鼠機(jī)械痛閾、熱痛閾顯著降低，通過藥理抑制NLRP3炎癥小體的激活可以有效緩解痛覺敏化，說明NLPR3炎癥小體參與了NP的發(fā)病過程，NLRP3炎癥小體可能是治療該病的潛在藥物靶點(diǎn)。

在前期研究中我們發(fā)現(xiàn)，中藥白芍的主要化學(xué)成分芍藥內(nèi)酯苷可以抑制NP狀態(tài)下大鼠脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，并降低脊髓促炎細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β的水平，從而顯著抑制脊髓背角的神經(jīng)炎癥反應(yīng)，發(fā)揮對NP的鎮(zhèn)痛作用[8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，芍藥內(nèi)酯苷顯著下調(diào)了NP狀態(tài)下大鼠脊髓NLRP3的表達(dá)，抑制caspase1的活性，并降低了脊髓IL-1β的水平，具有與NLRP3的特異性抑制劑MCC950相似的藥理活性。該結(jié)果說明，芍藥內(nèi)酯苷可通過抑制脊髓NLRP3炎癥小體的活化而對NP發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。