中藥材在生產(chǎn)、運(yùn)輸、儲(chǔ)存過(guò)程中容易受到黃曲霉的侵染從而產(chǎn)生黃曲霉毒素[1]。黃曲霉毒素是黃曲霉和寄生曲霉等某些菌株產(chǎn)生的雙呋喃環(huán)類(lèi)毒素，主要分為B族和G族兩種，其中以黃曲霉毒素B1的毒性最大，致癌性最強(qiáng)。

目前黃曲霉毒素的檢測(cè)方法有薄層色譜法、色譜分析法和免疫分析法[2]。《中華人民共和國(guó)藥典》（以下簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》）2020年版將酶聯(lián)免疫法列入2351通則中真菌毒素測(cè)定法的黃曲霉毒素測(cè)定法，為中藥材、中藥飲片及中藥制劑中黃曲霉毒素的測(cè)定提供了新的檢測(cè)方法。黃曲霉毒素在食品中的研究較為廣泛，而在中藥飲片的研究仍較少。傳統(tǒng)的色譜分析方法有著靈敏度高、重復(fù)性好的優(yōu)勢(shì)，但操作復(fù)雜不利于大批次快速檢測(cè)。隨著酶聯(lián)免疫吸附法的發(fā)展與應(yīng)用，能快速、簡(jiǎn)便地測(cè)定出樣品中的黃曲霉毒素，為黃曲霉毒素的檢測(cè)提供了便捷的檢測(cè)手段，有利于大批次快速篩查出中藥飲片中的黃曲霉毒素。本文通過(guò)建立酶聯(lián)免疫吸附法，考察其在中藥飲片中黃曲霉毒素檢測(cè)的應(yīng)用，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行探討研究。

1 材料與方法

1.1 材料

中藥飲片，珠海市場(chǎng)銷(xiāo)售。

1.2 試劑

甲醇，分析純；乙腈、正己烷、三氯甲烷，分析純；超純水；黃曲霉毒素B1殘留酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒（北京勤邦生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：S220223A10）；黃曲霉毒素總量殘留酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：S220223A10，北京勤邦生物技術(shù)有限公司）；黃曲霉毒素B族和G族混標(biāo)溶液（批號(hào)：S 095875；含量：黃曲霉毒素B199.9%；黃曲霉毒素B299.9%；黃曲霉毒素G199.7%；黃曲霉毒素G299.7%；天津阿爾塔科技有限公司）以及黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液（批號(hào)：GBW（E） 100302；含量：100%；國(guó)家糧食和物資儲(chǔ)備局科學(xué)研究院）。

1.3 儀器設(shè)備

Multiskan FC型酶標(biāo)儀，賽默飛；Centrifuge-V型離心機(jī)，賽默飛；XSR205電子分析天平型，梅特勒-托利多；N-EVAP24氮吹儀型，Organomation；888型洗板機(jī)，賽默飛。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 樣品和試劑的制備

（1）中藥飲片樣品。將中藥飲片用打粉機(jī)粉碎，混勻，稱取供試品粉末約2.0 g，參照《中國(guó)藥典》2020年版四部通則2351真菌毒素測(cè)定法，黃曲霉毒素測(cè)定法第三法（酶聯(lián)免疫法）制備樣品[3]。

（2）樣品復(fù)溶工作液、酶結(jié)合物工作液及洗滌工作液。參照酶聯(lián)免疫試劑盒說(shuō)明書(shū)[4-5]。

（3）混合對(duì)照品溶液的制備。①黃曲霉毒素混合對(duì)照品溶液：精密量取黃曲霉毒素B族和G族混標(biāo)溶液（黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1和黃曲霉毒素G2標(biāo)示濃度分別為1.0 μg·mL-1、0.3 μg·mL-1、1.0 μg·mL-1和0.3 μg·mL-1）1 mL，置于100 mL量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，作為黃曲霉毒素混合對(duì)照品溶液。

（4）黃曲霉毒素B1對(duì)照品溶液的制備。精密量取黃曲霉毒素B1對(duì)照品溶液（黃曲霉毒素B1標(biāo)示濃度為1.96 μg·mL-1）1 mL，置于100 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，作為黃曲霉毒素B1對(duì)照品貯備溶液。

1.4.2 酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定黃曲霉毒素B1含量

在96孔反應(yīng)板中分別加入標(biāo)準(zhǔn)品、樣品50 μL到對(duì)應(yīng)微孔中，然后加入黃曲霉毒素B1酶結(jié)合物工作液50 μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后于25 ℃避光反應(yīng)45 min。揭開(kāi)蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，加入洗滌工作液250 μL/孔，充分洗滌5次，每次間隔10 s，棄去洗滌液，用吸水紙拍干。每孔依次加入底物顯色A液50 μL，再依次加入底物顯色B液50 μL，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后于25 ℃避光反應(yīng)15 min。最后每孔依次加入終止液50 μL，輕輕振蕩混勻后，采用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔吸光度值，儀器參數(shù)為測(cè)定波長(zhǎng)450 nm，參比波長(zhǎng)620 nm。

1.4.3 酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定黃曲霉毒素總量

在96孔反應(yīng)板中分別加入標(biāo)準(zhǔn)品、樣品20 μL到對(duì)應(yīng)微孔中，然后加入黃曲霉毒素總量酶結(jié)合物工作液80 μL/孔，按1.4.2操作步驟處理。黃曲霉毒素總量以黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1和黃曲霉毒素G2總量計(jì)算。

1.5 方法學(xué)驗(yàn)證

1.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將濃度為0 μg·mL-1、0.05 μg·mL-1、0.15 μg·mL-1、0.45 μg·mL-1和1.35 μg·mL-1的 黃 曲 霉 毒 素B1系 列標(biāo) 準(zhǔn) 品 溶 液，濃 度 為0 μg·mL-1、0.025 μg·mL-1、0.075 μg·mL-1、0.225 μg·mL-1和0.675 μg·mL-1的黃曲霉毒素總量系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按試劑盒操作步驟處理，測(cè)定吸光度值。以標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度的對(duì)數(shù)值（lgC）為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品溶液的百分吸光率為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5.2 檢測(cè)限

實(shí)驗(yàn)以酶聯(lián)免疫法分別檢測(cè)6份陰性的樣本，計(jì)算陰性樣本中黃曲霉毒素B1及黃曲霉毒素總量的含量，方法的檢出限等于陰性樣本的檢測(cè)平均值加上陰性樣本檢測(cè)濃度的3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.5.3 精密度實(shí)驗(yàn)

分別取濃度為1.35 μg·mL-1的黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品溶液、濃度為0.675 μg·mL-1的黃曲霉毒素總量標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按試劑盒操作步驟處理，各平行6孔，測(cè)定吸光度值，計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.5.4 回收率實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取薏苡仁供試品2組，每組各6份，每份樣品約2 g，置于50 mL離心管中，第一組加入黃曲霉毒素B1對(duì)照品溶液1 mL，第二組加入黃曲霉毒素混合對(duì)照品溶液1 mL，按供試品溶液制備方法制備樣品溶液，按試劑盒操作步驟處理，每份平行2孔，測(cè)定吸光度值并計(jì)算百分吸光率，由標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算各成分濃度，計(jì)算回收率及其RSD值。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶聯(lián)免疫測(cè)定中藥飲片中黃曲霉毒素B1的結(jié)果

2.1.1 線性方程

由表1可知，黃曲霉毒素B1在0～1.35 μg·mL-1，濃度的對(duì)數(shù)與其百分吸光率呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

表1 黃曲霉毒素B1線性方程數(shù)據(jù)表

2.1.2 檢測(cè)限

由表2可知，黃曲霉毒素B1方法檢出限為1 μg·kg-1，方法靈敏度高。

表2 黃曲霉毒素B1檢出限測(cè)定結(jié)果表

2.1.3 精密度實(shí)驗(yàn)

由表3可知，黃曲霉毒素B1試劑盒的RSD為13%，符合方法分析驗(yàn)證精密度限度范圍。

表3 黃曲霉毒素B1精密度測(cè)定結(jié)果表

2.1.4 回收率實(shí)驗(yàn)

由表4可知，薏苡仁黃曲霉毒素B1的加標(biāo)回收率在100.8%～118.9%，符合方法分析驗(yàn)證回收率限度范圍。

表4 黃曲霉毒素B1回收率測(cè)定結(jié)果表

2.1.5 樣品測(cè)定結(jié)果

根據(jù)黃曲霉毒素B1的檢出限為1 μg·kg-1，由此可得出當(dāng)檢測(cè)結(jié)果低于或等于1 μg·kg-1時(shí)可判定為未檢出，當(dāng)檢測(cè)結(jié)果高于1 μg·kg-1時(shí)可判定為黃曲霉毒素B1陽(yáng)性。而編號(hào)為2、5、8、24、25和26的樣品，測(cè)得的結(jié)果稍高于1 μg·kg-1，按照修約規(guī)則可認(rèn)為其結(jié)果為1 μg·kg-1，而且其目測(cè)顏色與其他未檢出的樣品顏色一致，可根據(jù)目測(cè)顏色的結(jié)果判定為未檢出，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 中藥飲片中黃曲霉毒素B1檢測(cè)結(jié)果表

2.2 酶聯(lián)免疫測(cè)定中藥飲片中黃曲霉毒素總量的結(jié)果

2.2.1 線性方程

由表6可知，黃曲霉毒素總量在0～0.675 μg·mL-1，濃度的對(duì)數(shù)與其百分吸光率呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

表6 黃曲霉毒素總量線性方程數(shù)據(jù)表

2.2.2 檢測(cè)限

由表7可知，黃曲霉毒素總量方法檢出限為0.5 μg·kg-1，方法靈敏度高。

表7 黃曲霉毒素總量檢出限測(cè)定結(jié)果表

2.2.3 精密度實(shí)驗(yàn)

由表8可知，黃曲霉毒素總量試劑盒的RSD為13%，符合方法分析驗(yàn)證精密度限度范圍。

表8 黃曲霉毒素總量精密度測(cè)定結(jié)果表

2.2.4 回收率實(shí)驗(yàn)

由表9可知，薏苡仁黃曲霉毒素總量加標(biāo)回收率在84.6%～90.5%，回收率較好，符合方法分析驗(yàn)證回收率限度范圍。

表9 黃曲霉毒素總量回收率測(cè)定結(jié)果表

2.2.5 樣品測(cè)定結(jié)果

根據(jù)黃曲霉毒素總量的檢出限為0.5 μg·kg-1，由此可得出當(dāng)檢測(cè)結(jié)果低于或等于0.5 μg·kg-1時(shí)可判定為未檢出，當(dāng)檢測(cè)結(jié)果高于0.5 μg·kg-1時(shí)，可判定為黃曲霉毒素總量陽(yáng)性，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表10。

表10 中藥飲片中黃曲霉毒素總量檢測(cè)結(jié)果表

3 結(jié)論與討論

3.1 討論

《中華人民共和國(guó)藥品管理法》的第三條要求“藥品管理……全面提升藥品質(zhì)量，保障藥品的安全、有效、可及”，國(guó)家“十四五”規(guī)劃中也提到了要“嚴(yán)格食品藥品安全監(jiān)管”，國(guó)家藥監(jiān)局藥監(jiān)綜藥注函〔2022〕87號(hào)關(guān)于《中華人民共和國(guó)藥品管理法》第一百一十七條第二款適用原則的指導(dǎo)意見(jiàn)就是充分考慮了中藥飲片的特點(diǎn)作出的專(zhuān)門(mén)規(guī)定[6]，廣東省藥監(jiān)局在2021年印發(fā)了《廣東省藥品監(jiān)督管理局中藥飲片不符合藥品標(biāo)準(zhǔn)尚不影響安全性、有效性的認(rèn)定指導(dǎo)原則》，其中就提到了“影響中藥飲片安全性的檢驗(yàn)項(xiàng)目有二氧化硫殘留量、重金屬及有害元素、農(nóng)藥殘留量、真菌毒素……”。中藥藥材是中藥產(chǎn)業(yè)的原料，中藥飲片是一種處方藥。中藥飲片主要用在中醫(yī)臨床辨證論治的治療中，也是中醫(yī)用藥效果的主要保障。中藥飲片的質(zhì)量和中醫(yī)的臨床療效具有密切的關(guān)系，安全質(zhì)量問(wèn)題甚至?xí)绊懙接盟幍陌踩?。而中藥飲片的質(zhì)量和中藥的發(fā)展不可分開(kāi)，中藥的發(fā)展可弘揚(yáng)中醫(yī)文化，具有高度的重要性。

為了適應(yīng)監(jiān)管需求，本實(shí)驗(yàn)選取了31批次共26個(gè)品種的中藥飲片作為檢測(cè)對(duì)象，其中大部分為藥食同源的中藥飲片。市面上大部分藥食同源的中藥飲片常被用作食品，其來(lái)源和質(zhì)量參差不齊，雖然食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、《中國(guó)藥典》及行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)等多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)可作為藥食同源食品質(zhì)量控制研究的依據(jù)，但這些標(biāo)準(zhǔn)并不完全適用于藥食同源食品的質(zhì)量控制，所以其安全性更加難以保證。絕大部分被用作藥食同源中藥飲片含有大量淀粉、糖類(lèi)、蛋白質(zhì)等容易發(fā)生變質(zhì)的成分，儲(chǔ)存不當(dāng)很容易產(chǎn)生霉變，因此安全問(wèn)題更加值得關(guān)注。食品中黃曲霉毒素檢測(cè)的相關(guān)規(guī)定有很多，而這部分被用作藥食同源的中藥飲片的歸屬性不在食品安全中，導(dǎo)致安全檢測(cè)容易被忽視，2020年版《中國(guó)藥典》項(xiàng)下規(guī)定要檢測(cè)黃曲霉毒素的品種僅有25種，在與眾多品種的中藥飲片相比之下，該范圍少之又少，是否會(huì)存在未規(guī)定檢測(cè)的品種檢測(cè)出被污染黃曲霉毒素，該安全性問(wèn)題也值得人們深思。所以，增加檢測(cè)這類(lèi)中藥飲片中的黃曲霉毒素檢測(cè)方法探索，可以為藥食同源中藥飲片進(jìn)行科學(xué)、適宜、符合其使用特點(diǎn)的安全性評(píng)價(jià)研究提供一定的參考。

3.2 結(jié)論

在本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，31批次的中藥飲片，有5批次檢出黃曲霉毒素B1、6批次檢出黃曲霉毒素總量?！吨袊?guó)藥典》規(guī)定中藥飲片黃曲霉毒素B1的限量標(biāo)準(zhǔn)為5 μg·kg-1，黃曲霉毒素總量（以黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1和黃曲霉毒素G2總量計(jì)）的限量標(biāo)準(zhǔn)為10 μg·kg-1[3]。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)及上述結(jié)果可得，黃曲霉毒素總量的靈敏度為0.025 μg·kg-1[5]，檢 出 限 為0.5 μg·kg-1；黃 曲 霉 毒 素B1的 靈 敏 度 為0.05 μg·kg-1[4]，檢出限為1 μg·kg-1。故當(dāng)檢測(cè)結(jié)果超出檢出限時(shí)，可認(rèn)為其黃曲霉毒素檢出陽(yáng)性。酶聯(lián)免疫測(cè)定法是通過(guò)測(cè)定其吸光值計(jì)算出黃曲霉毒素的含量，由于中藥飲片中含有多種復(fù)雜的成分，致使其提取液中含有各種雜質(zhì)和色素，部分雜質(zhì)和色素能與抗原抗體結(jié)合，且在特定的波長(zhǎng)下存在一定的吸收，還有其他各種不確定因素的影響，有可能出現(xiàn)假陽(yáng)性的檢測(cè)結(jié)果。雖然酶聯(lián)免疫測(cè)定法用于快速篩查能定量檢測(cè)出黃曲霉毒素含量，其結(jié)果具有一定的不準(zhǔn)確性，結(jié)果確證仍需要通過(guò)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行確認(rèn)。