隨著我國水產加工業(yè)的發(fā)展，水產品加工廢棄物激增。然而這些廢棄物中往往含有可利用的高價值物質，包括蛋白質、礦物質、ω-3不飽和脂肪酸、甲殼素、蝦青素和其他生物活性物質等[1]。其中甲殼素是迄今為止僅次于纖維素的第二大可再生天然聚合物，每年的生物合成量約為100億t[2]。甲殼素資源豐富并具有許多特殊的生物理化性質，被認為是可替代石油的生物燃料和其他功能性化合物的生物質來源[3]。作為21世紀環(huán)境友好型的新型生物高分子材料，甲殼素及其衍生物在醫(yī)學、制藥、化妝品、食品工業(yè)、農業(yè)、環(huán)保、生物等相關科學技術領域都展現(xiàn)出了巨大的潛力，具有廣闊的應用前景和較高的商業(yè)價值。

我國主要從蝦、蟹的甲殼中提取甲殼素及殼聚糖[4-6]。目前提取甲殼素、殼聚糖的方法主要有傳統(tǒng)酸堿法、物理法、酶法、化學改良法、發(fā)酵法、微生物合成法等[7-9]。制取過程主要為脫鈣及脫蛋白，為了解各方法在脫蛋白方面的效果及對比各方法的脫除效果，最終選擇以單一酶解及復合酶解為研究對象進行實驗。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

蝦殼，廣東省湛江市北橋菜市場；冰乙酸（AR）、無水乙醇（AR），廣東化學試劑工程技術研究開發(fā)中心；酸性蛋白酶、中性蛋白酶，夏盛公司；堿性蛋白酶，諾維信中國銷售代理廣州明曜公司。

1.2 實驗儀器

電子分析天平FA2104N，上海蒲春計量儀器股份有限公司；紫外分光光度計TU-1810DASPC，廣州市紅圖儀器有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州榮華儀器制造有限公司；pHS-3C酸度計，上海儀電科學儀器股份有限公司；電熱鼓風干燥箱DHG-9035A，上海一恒鼓風干燥箱。

1.3 實驗方法

1.3.1 蝦粗甲殼素蛋白質含量測定

稱取干燥后樣品0.2 g，分別用20 mL 4%NaOH浸泡樣品，將這3份樣品于90 ℃水浴鍋中水浴3 h，冷卻過濾，分別收集好濾渣和濾液，濾液于50 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度。將上述定容的濾液用移液槍移取1 mL于試管中，然后加入2 mL蒸餾水（稀釋3倍），混勻，用紫外分光光度計測定280 nm和260 nm處的吸光度，另用20 mL 4%的NaOH溶液加蒸餾水定容至50 mL容量瓶中，做空白對照。蛋白質含量（mg·mL-1）計算公式為蛋白質含量=1.31A280-0.57A260。

1.3.2 水打醇洗粗蝦甲殼素制備

新鮮蝦下腳料加蒸餾水，于豆?jié){機高速打漿2 min，然后用篩網(wǎng)過濾，濾渣中加入食用乙醇，于豆?jié){機再打0.5 min，然后用篩網(wǎng)過濾收集濾渣，水洗4次，備用。

1.3.3 單一酶解

（1）酸性蛋白酶酶解后再堿提。樣品加水（料液比1∶10），調pH值為5.0，加入酸性蛋白酶（按底物0.1%計），50 ℃水浴鍋中水浴3 h，90 ℃滅酶10 min，冷卻過濾，分別收集好濾渣和濾液，過濾時用少許蒸餾水多次沖洗燒杯殘渣，濾液于100 mL容量瓶中定容，用蒸餾水定容至刻度，用紫外分光光度計測定280 nm和260 nm處的吸光度，測定蛋白質含量。同時烘干濾渣，測定蛋白質殘留量。

（2）堿提后再用堿性蛋白酶酶解。樣品約5 g，分別加入50 mL 0.1%NaOH溶液（pH=13.17）和0.05%NaOH溶液（pH=12.65）浸泡，于90 ℃水浴鍋中水浴3 h。冷卻過濾，分別收集好殘渣和濾液，過濾時用少許蒸餾水多次沖洗燒杯殘渣，濾液于100 mL容量瓶中定容，用蒸餾水定容至刻度，待測。將過濾好的濾渣，加入25 mL蒸餾水和2.5 μL的諾維信堿性蛋白酶（按底物0.1%計），測定其pH值為8.0，于50 ℃水浴鍋中水浴3 h，90 ℃滅酶10 min，同時測定濾液蛋白質含量和濾渣蛋白質殘留量。

（3）復合酶解。①樣品約5 g，按料液比1∶10加水，調pH值為5.0，加入酸性蛋白酶（按底物0.1%計），50 ℃水浴鍋中水浴3 h，調pH值為7.0，加入中性蛋白酶（按底物0.1%計），50 ℃水浴鍋中水浴3 h，測定濾液和濾渣蛋白質含量。②樣品約5 g，按料液比1∶10加水，調pH值為5.0，加入酸性蛋白酶（按底物0.1%計），50 ℃水浴鍋中水浴3 h，調pH值為8.0，加入堿性蛋白酶（按底物0.1%計），50 ℃水浴鍋中水浴3 h，測定濾液和濾渣蛋白質含量。③樣品約5 g，按料液比1∶10加水，調pH值為7.0，加入中性蛋白酶（按底物0.1%計），50 ℃水浴鍋中水浴3 h，調pH值為8.0，加入堿性蛋白酶（按底物0.1%計），50 ℃水浴鍋中水浴3 h，測定濾液和濾渣蛋白質含量。

（4）復合酶解后再堿提取。樣品復合酶解后烘干0.2 g，加入4 mL 0.1%氫氧化鈉于90 ℃水浴3 h，分別測定濾液和濾渣蛋白質含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析方法

采用Excel 2007整理實驗數(shù)據(jù)，使用SPSS 20.0軟件處理數(shù)據(jù)。每個實驗重復3次，實驗結果取平均值。

2 結果與分析

2.1 蝦粗甲殼素蛋白質含量測定

由圖1可知，蝦下腳料的蛋白含量高于處理完畢的水打醇洗樣品，而0.1%NaOH提取液中蛋白質含量為20.23%，0.05%NaOH提取液中蛋白質含量為18.1%。由以上數(shù)據(jù)可知在堿提過程中0.1%NaOH的提取效果比0.5%NaOH的提取效果好。

圖1 不同濃度的NaOH提取蛋白質效果對比圖

2.2 單一酶解

由圖2、圖3、圖4可知，水打醇洗蝦殼樣品經酸性蛋白酶酶解再堿提后殘余的蛋白質含量分別為2.68%（0.1%NaOH）、3.59%（0.05%NaOH）。堿 提后再堿性蛋白酶酶解殘余的蛋白質含量分別為2.55%（0.1%NaOH）、3.44%（0.05%NaOH）。由此可知，在單一酶解過程中堿提加堿性蛋白酶酶解的提取效果優(yōu)于酸性蛋白酶加堿提，且用0.1%的NaOH提取優(yōu)于使用0.05%的NaOH提取。

圖2 蛋白酶酶解后酶解液中蛋白質含量比較圖

圖3 堿提液中蛋白質含量對比圖

圖4 蝦殼中殘留蛋白質含量對比圖

2.3 復合酶解

由圖5、圖6、圖7可知，在復合酶解的過程中初次酶解中性蛋白酶酶解液中蛋白質含量最高為28.57%，第二次酶解中堿性蛋白酶酶解液中蛋白含量最高為24.89%。烘干后殘留蛋白質含量分別為11.51%、5.60%、5.57%。由此可知，復合酶解時由酸性-中性提取效果最差，酸性-堿性，中性-堿性效果差異不大，中性-堿性略優(yōu)于酸性-堿性。

圖5 復合酶解第一次酶解蛋白含量對比圖

圖6 復合酶解第二次酶解液蛋白質含量對比圖

圖7 烘干后粗甲殼素殘留蛋白質含量對比圖

2.4 復合酶解后干燥樣品再堿提取蛋白質

由圖8、圖9可知，復合酶解后再用低濃度的堿液提取過程中，酸性-中性提取量最高為10.07%，酸性-堿性最低為4.6%。而濾渣中殘留蛋白質含量也是酸性-堿性最低為3.61%。結合復合酶解實驗結果分析可知，復合酶解中酸性-堿性的提取效果最好，酸性-中性提取效果最差。

圖8 0.1%堿提取液中蛋白質含量對比圖

圖9 甲殼素中蛋白質含量對比圖

3 結論

本實驗主要研究不同方法脫蝦殼蛋白質的效果，其中包括酸性蛋白酶酶解后再堿提，堿提后再用堿性蛋白酶酶解以及采用復合酶包括酸性蛋白酶、堿性蛋白酶及中性蛋白酶。通過對比不同方法處理后烘干樣品中蛋白質的含量即可得出脫蛋白效果最好的方法，根據(jù)實驗數(shù)據(jù)可知，復合酶解提取效果略低于單一酶解再堿提的效果，而復合酶解后再使用低濃度的堿液進行提取可使殘留蛋白質達到較好的效果。堿提后再用堿性蛋白酶酶解，殘留蛋白質含量最低，即該方法脫蛋白效果最好。