司徒慧媛， 李玉梅， 高加龍,2,*， 章超樺,2， 秦小明,2，曹文紅,2， 林海生,2， 鄭惠娜,2

(1.廣東海洋大學(xué) 食品科技學(xué)院/廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省海洋生物制品工程實(shí)驗(yàn)室/水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣東 湛江 524088；2.大連工業(yè)大學(xué) 海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心， 遼寧 大連 116034)

金鯧魚學(xué)名為卵形鯧鲹(Trachinotusovatus)，硬骨魚綱鱸形目鲹科鯧鲹屬[1]，產(chǎn)地主要為廣東、廣西和浙江等省，是我國三大海水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚類之一?！吨袊鴿O業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒》數(shù)據(jù)顯示，2020年我國金鯧魚養(yǎng)殖產(chǎn)量約10.2萬t，占全國海水養(yǎng)殖魚類總產(chǎn)量的5.8%[2]。金鯧魚肉質(zhì)細(xì)膩，滋味鮮美，具有較好的食用價(jià)值和營養(yǎng)價(jià)值。保持流通過程中金鯧魚漁獲后的鮮度和品質(zhì)對其內(nèi)陸城市消費(fèi)市場的開發(fā)十分關(guān)鍵[3]；因此，需要在運(yùn)輸過程中使用冷鏈運(yùn)輸體系，并維持整個(gè)冷鏈流通過程中溫度的穩(wěn)定[4]。水產(chǎn)品表面附著大量微生物并含有較多內(nèi)源酶，容易導(dǎo)致鮮度品質(zhì)劣化甚至腐敗變質(zhì)。因此研究運(yùn)輸和銷售過程的溫度控制以及冷鏈物流過程中魚體的品質(zhì)變化和微生物群落演替規(guī)律對水產(chǎn)品的保鮮加工具有重要的意義。

流通中溫度頻繁波動(dòng)易導(dǎo)致魚品質(zhì)劣變速度加快。黃文博等[5]研究發(fā)現(xiàn)，冷藏物流中的溫度頻繁波動(dòng)導(dǎo)致美國紅魚(Sciaenopsocellatus)的菌落總數(shù)、pH值、揮發(fā)性鹽基氮(TVB- N)值、K值等指標(biāo)的顯著變化；藍(lán)蔚青等[6]證明流通期間劇烈的溫度波動(dòng)對大目金槍魚(Thunnusobesus)品質(zhì)造成明顯影響；于淑池等[7]研究了0 ℃下貯藏金鯧魚的菌落總數(shù)、TVB- N值和特定腐敗菌。但流通過程中溫度波動(dòng)對金鯧魚品質(zhì)和微生物的影響鮮有報(bào)道。目前在食品微生物多樣性及變化規(guī)律分析中廣泛應(yīng)用高通量測序技術(shù)，具有測序通量大，能全面且精確測量樣品中的微生物類型及其真實(shí)比例等優(yōu)點(diǎn)[8]。已有學(xué)者將該技術(shù)運(yùn)用在大西洋鱈魚(Gadusmorhua)[9]、南美白對蝦(Litopenaeusvannamei)[10]等水產(chǎn)品的微生物群落組成分析中。

本研究模擬了金鯧魚漁獲至消費(fèi)環(huán)節(jié)的整個(gè)流通過程，分析了溫度波動(dòng)下鮮度指標(biāo)的變化，并通過傳統(tǒng)培養(yǎng)、Illumina Miseq測序平臺與PICRUSt功能預(yù)測工具研究微生物群落結(jié)構(gòu)組成和代謝功能的差異，探究金鯧魚冷鏈流通過程中溫度波動(dòng)對魚肉品質(zhì)和微生物多樣性的影響，以期為金鯧魚保鮮技術(shù)和冷鏈物流的建設(shè)提供參考依據(jù)。

圖1 模擬金鯧魚的冷鏈流通過程Fig.1 Process of simulated cold chain circulation of Trachinotus oratus

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活養(yǎng)殖金鯧魚，湛江市霞山區(qū)水產(chǎn)品批發(fā)市場，質(zhì)量為(720.00±37.42) g，體長為(33.00±1.22) cm，樣品捕撈后加冰1 h內(nèi)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室；2-硫代巴比妥酸，分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；ATP關(guān)聯(lián)物標(biāo)準(zhǔn)品，美國Sigma公司；平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基，北京陸橋技術(shù)股份有限公司；Qubit3.0 DNA檢測試劑盒，美國Life公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(E.Z.N.A.Soil DNA Kit)，美國Omega公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FE28型pH計(jì)，梅特勒- 托利多儀器(上海)有限公司；Thermo Varioskan Flash型全波長多功能酶標(biāo)儀，美國賽默飛世爾科技公司；Vapodest- 450型全自動(dòng)凱氏定氮儀，德國格哈特分析儀器有限公司；Waters e2695型高效液相色譜儀，美國Waters公司；Miseq型高通量測序儀，美國Illumina公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1冷鏈流通模擬實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

GB/T 28577—2021《冷鏈物流分類與基本要求》[11]和《水產(chǎn)食品學(xué)》[12]中規(guī)定：水產(chǎn)品漁獲后需放入加冰的泡沫箱中保溫，送往原料處理場的過程中所處溫度為0～2 ℃，到達(dá)原料處理場后經(jīng)冷藏車運(yùn)輸[(2.0±0.5) ℃]，超市冷藏陳列柜銷售[(2.0±0.5) ℃]，最后到達(dá)家庭冰箱(4 ℃)。依此設(shè)計(jì)了金鯧魚冷鏈物流過程。金鯧魚漁獲后經(jīng)過處理待運(yùn)，穩(wěn)定處于2 ℃(0～24 h)后分別經(jīng)過理想冷鏈過程與斷鏈過程。CL組為理想冷鏈過程：運(yùn)輸及銷售溫度穩(wěn)定處于2 ℃，家庭暫存穩(wěn)定處于4 ℃；BC組為斷鏈過程：運(yùn)輸、銷售和家庭運(yùn)輸過程中設(shè)置多個(gè)溫度變化，分別為2、4、10、25 ℃，以模擬流通過程中存在的溫度變化[11]。

具體流通過程如圖1，將魚肉分別置于對應(yīng)溫度裝置下貯藏0、24、48、96、120 h后進(jìn)行高通量測序分析以及相關(guān)指標(biāo)的測定。模擬冷鏈流通過程總共8個(gè)取樣點(diǎn)，即貯藏待運(yùn)組(SS- 0、SS- 24)，冷鏈組(CL- 48、CL- 96、CL- 120)，斷鏈組(BC- 48、BC- 96、BC- 120)。

1.3.2樣品處理

將新鮮的金鯧魚宰殺后取背部肌肉，經(jīng)蒸餾水淋洗，使用無菌紗布擦拭樣品表面水分后分裝入封口袋(約100 g/袋)，分別放在不同的模擬流通環(huán)境中貯藏。不同時(shí)間取樣進(jìn)行高通量分析和菌落總數(shù)、嗜冷菌數(shù)、pH值、TVB- N值、硫代巴比妥酸(TBA)值、K值等指標(biāo)的測定，每組至少3個(gè)重復(fù)。

1.3.3鮮度品質(zhì)指標(biāo)測定

1.3.3.1 微生物指標(biāo)測定

菌落總數(shù)、嗜冷菌數(shù)測定參考GB 4789.2—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測定》[13]。選擇合適稀釋度，平行測定3次，并設(shè)定空白對照。菌落總數(shù)需在(30±1) ℃下培養(yǎng)(72±3) h，嗜冷菌需在(7±1) ℃下培養(yǎng)(240±3) h。

1.3.3.2 pH值測定

稱取絞碎、混合均勻的2.00 g魚肉于離心管中，再加入20 mL蒸餾水混合均勻后靜置30 min，以8 000 r/min離心10 min后，取上清液測定pH值[14]。

1.3.3.3 TVB- N值測定

參考GB 5009.228—2016《食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》[15]中的半微量凱氏定氮法，采用全自動(dòng)凱氏定氮儀進(jìn)行檢測，結(jié)果以mg/100g表示。

1.3.3.4 TBA值測定

參考GB 5009.181—2016《食品中丙二醛的測定》[16]進(jìn)行測定。

1.3.3.5 K值測定

參考SC/T 3048—2014《魚類鮮度指標(biāo)K值的測定高效液相色譜法》[17]提取樣品中的ATP關(guān)聯(lián)物后使用高相液相色譜儀進(jìn)行檢測。HPLC條件：5C18- MS- II型色譜柱(4.60 mm×250 mm,5 μm)，檢測波長為 254 nm，柱溫為35 ℃，進(jìn)樣量20 μL；流動(dòng)相為0.02 mol/L磷酸二氫鉀與0.02 mol/L磷酸氫二鉀溶液體積比1∶1，使用磷酸調(diào)節(jié)pH值至6.0，流速為1.0 mL/min。等度洗脫程序：0～35 min，外標(biāo)法定量。按式(1)計(jì)算K值。

(1)

1.3.4高通量測序

1.3.4.1 總DNA提取與PCR的擴(kuò)增

使用液氮將魚肉磨成粉末狀，采用DNA提取試劑盒提取樣品DNA，使用Qubit3.0 DNA檢測試劑盒對提取的基因組DNA精確定量。PCR擴(kuò)增所需引物采用V3- V4區(qū)通用引物，為341F(5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′)和805R(5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′)。PCR擴(kuò)增完成后通過質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增效果。

1.3.4.2 PCR產(chǎn)物純化回收與測序

通過AMPure XP磁珠純化擴(kuò)增產(chǎn)物，對每個(gè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的DNA含量進(jìn)行熒光檢測，通過生物芯片分析測定系統(tǒng)進(jìn)行文庫測序片段范圍和濃度的分析檢測，然后由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行Illumina MiSeq高通量測序。

1.3.4.3 高通量測序數(shù)據(jù)處理及分析

將測序后得到的原始序列按照overlap關(guān)系進(jìn)行拼接，然后再按照原始序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控和過濾，舍棄一些較低質(zhì)量的DNA序列，再聚類成操作分類單元(operational taxonomic units，OTU)。根據(jù)聚類分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，針對OTU進(jìn)行多樣性指數(shù)綜合分析以及對不同組別測序深度的測定，并采用單樣品的多樣性指數(shù)分析方法(Alpha多樣性)研究樣品中微生物的多樣性?；诜诸悓W(xué)信息，統(tǒng)計(jì)分析不同分類水平的生物種群結(jié)構(gòu)，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行功能預(yù)測[18]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用Microsoft Excel、Prism 9.3、SPSS Statistics 20.0進(jìn)行整理分析與繪圖，運(yùn)用Tukey- HSD進(jìn)行顯著性分析與多重比較(P<0.05為差異顯著)，同時(shí)針對鮮度指標(biāo)與微生物指標(biāo)進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 冷鏈流通期間金鯧魚魚肉品質(zhì)變化分析

2.1.1菌落總數(shù)與嗜冷菌的變化

微生物的活動(dòng)是導(dǎo)致水產(chǎn)品腐敗的主要因素之一，菌落總數(shù)被廣泛應(yīng)用于判斷水產(chǎn)品鮮度。一般認(rèn)為菌落總數(shù)小于104CFU/g為一級鮮度，104～106CFU/g為二級鮮度，菌落總數(shù)大于106CFU/g表明魚體已發(fā)生腐敗[18]，而流通過程中的低溫環(huán)境則為嗜冷菌提供了有利的生長條件。

模擬流通過程中金鯧魚樣品菌落總數(shù)與嗜冷菌的變化如圖2。在貯藏前期樣品初始菌落總數(shù)與初始嗜冷菌數(shù)量均差異不明顯(P>0.05)，初始的樣品菌落總數(shù)為(2.81±0.03) lg CFU/g。在貯藏后期，CL組由于環(huán)境溫度穩(wěn)定，在流通期間菌落總數(shù)與嗜冷菌數(shù)增長緩慢。而BC組經(jīng)歷溫度變化后，貯藏96 h后BC組樣品的菌落總數(shù)與嗜冷菌數(shù)均顯著高于CL組(P<0.05)；120 h后BC組的菌落總數(shù)達(dá)(6.63±0.03) lg CFU/g，已超出限量指標(biāo)。在整個(gè)流通過程中嗜冷菌數(shù)與菌落總數(shù)的變化趨勢基本一致，其增長速率始終高于菌落總數(shù)，這說明溫度波動(dòng)營造了更適合嗜冷菌的生長環(huán)境，加速了微生物的生長繁殖最終導(dǎo)致魚肉腐敗。

不同小寫字母表示組間差異顯著(P<0.05)。圖2 模擬冷鏈流通過程中金鯧魚菌落總數(shù)與嗜冷菌數(shù) 的變化Fig.2 Changes of total colony count and psychrophilic bacteria in Trachinotus ovatus during simulated cold chain circulation

2.1.2pH值的變化

模擬冷鏈流通過程中金鯧魚魚肉pH值的變化見圖3。新鮮金鯧魚魚肉的初始pH值為6.61±0.01，貯藏前期pH值下降，而后在理想冷鏈過程與斷鏈過程中呈上升的趨勢。在貯藏初期(0～24 h)，肌肉組織中由糖酵解反應(yīng)而產(chǎn)生大量乳酸使pH值呈下降趨勢。隨后自溶階段，樣品pH值逐漸上升，歸因于魚肉中的蛋白質(zhì)與部分含氮物質(zhì)被分解，生成氨基酸、氨、三甲胺等堿性物質(zhì)[5]。BC組pH值上升趨勢大于CL組，且在48 h時(shí)的pH值顯著高于CL組(P<0.05)，說明溫度波動(dòng)促進(jìn)了蛋白質(zhì)和部分含氮物質(zhì)的分解。

不同小寫字母表示組間差異顯著(P<0.05)。圖3 模擬冷鏈流通過程中金鯧魚pH值的變化Fig.3 Changes of pH value of Trachinotus ovatus during simulated cold chain circulation

2.1.3TVB-N值的變化

內(nèi)源酶和微生物的作用，可使水產(chǎn)品中的蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)含氮化合物降解并形成揮發(fā)性的鹽基氮，因此TVB- N值常作為判斷水產(chǎn)品腐敗程度的重要化學(xué)指標(biāo)之一[19]。SC/T 3103—2010《鮮凍鯧魚》中規(guī)定魚肉的TVB- N值小于18 mg/100g為一級品，大于30 mg/100g為不合格品[20]。模擬冷鏈流通過程中金鯧魚魚肉TVB- N值的變化見圖4。樣品TVB- N值隨著流通時(shí)間延長呈上升趨勢，在貯藏初期(0～24 h)，SS組的TVB- N值上升緩慢(P>0.05)；在貯藏后期(96～120 h)，BC組樣品的TVB- N值顯著升高，均高于同一流通時(shí)間節(jié)點(diǎn)的CL組樣品(P<0.05)。在流通120 h后BC組樣品TVB- N值已由鮮魚初始的(7.95±0.49) mg/100g上升至(20.57±0.98) mg/100g，超過了一級品的標(biāo)準(zhǔn)范圍，而CL組仍屬于一級鮮度?？梢?，溫度波動(dòng)與TVB- N值的持續(xù)上升密切相關(guān)，這與徐曉蓉等[21]的馬鮫魚冷鏈流通過程中品質(zhì)變化研究結(jié)果相似。此外，樣品TVB- N值上升趨勢與菌落總數(shù)變化趨勢一致，說明微生物生長繁殖可能加快了魚肉中蛋白質(zhì)氧化分解和胺類化合物的產(chǎn)生，造成魚肉品質(zhì)下降。

不同小寫字母表示組間差異顯著(P<0.05)。圖4 模擬冷鏈流通過程中金鯧魚TVB- N值的變化Fig.4 Changes of TVB- N value of Trachinotus ovatus during simulated cold chain circulation

2.1.4K值的變化

K值能反映魚體死后ATP降解反應(yīng)進(jìn)行的程度，是衡量魚類新鮮度的重要指標(biāo)。一般認(rèn)為即殺的魚K值在10%以下，在20%以下為一級品，20%～40%為二級鮮度，60%～80%為初期腐敗魚[21]。模擬冷鏈流通過程中金鯧魚魚肉K值的變化見圖5。本研究中新鮮金鯧魚肉的K值為(10.85±0.19)%，隨著時(shí)間的延長流通期間K值呈上升趨勢；且每個(gè)流通時(shí)間節(jié)點(diǎn)BC組的K值均顯著高于CL組(P<0.05)，流通120 h后BC組樣品的K值已達(dá)到(61.05±1.32)%，成為初期腐敗魚。結(jié)果表明：溫度的頻繁波動(dòng)提高了ATP的降解速度并造成K值的增長速率加快[19]，對金鯧魚的鮮度造成了顯著影響。

不同小寫字母表示組間差異顯著(P<0.05)。圖5 模擬冷鏈流通過程中金鯧魚K值的變化Fig.5 Changes of K value of Trachinotus ovatus during simulated cold chain circulation

2.1.5TBA值的變化

TBA值一般用來反映水產(chǎn)品中脂肪氧化的程度，TBA值越高代表樣品脂肪氧化程度越大，標(biāo)志著魚肉品質(zhì)劣變速度越快[22]。模擬冷鏈流通過程中金鯧魚魚肉TBA值的變化見圖6。在流通過程中各組樣品TBA值總體均呈上升趨勢，CL組的上升速率較BC組緩慢，流通120 h后BC- 120組樣品的TBA值已由流通前(0.02±0.01) mg/kg上升至(0.38±0.02) mg/kg，且顯著高于CL- 120組(P<0.05)，其原因可能是溫度波動(dòng)導(dǎo)致魚肉中肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損和肌纖維完整性降低，加快魚肉中脂肪的氧化速率。

不同小寫字母表示組間差異顯著(P<0.05)。圖6 模擬冷鏈流通過程中金鯧魚TBA值的變化Fig.6 Changes of TBA value of Trachinotus ovatus during simulated cold chain circulation

2.2 金鯧魚各品質(zhì)指標(biāo)相關(guān)性分析

CL組和BC組的金鯧魚各品質(zhì)指標(biāo)的Pearson相關(guān)系數(shù)分析見表1。BC組中TBA值與K值呈不顯著正相關(guān)(P>0.05)。其余微生物指標(biāo)和鮮度指標(biāo)均呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，說明微生物代謝產(chǎn)物的積累會引起金鯧魚的品質(zhì)變化，而貯藏時(shí)間和溫度波動(dòng)會影響微生物的增長速率，從而影響劣變速度。因此這些指標(biāo)均可作為金鯧魚流通期間的鮮度綜合評定指標(biāo)。

表1 模擬冷鏈流通期間金鯧魚品質(zhì)指標(biāo)相關(guān)性分析

2.3 模擬冷鏈流通過程中金鯧魚微生物演替變化

2.3.1微生物群落多樣性與結(jié)構(gòu)差異分析

經(jīng)高通量測序平臺獲得原始序列后，對各樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控過濾得到有效數(shù)據(jù)，然后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析優(yōu)化，結(jié)果見表2。各時(shí)期樣品原始序列數(shù)范圍為68 004～87 483條，樣品優(yōu)化有效序列范圍為63 174～80 204條，平均長度范圍為408.4～416.9 bp，本次測序每個(gè)樣品的有效序列百分比均達(dá)50%以上，已滿足了微生物多樣性分析的要求[9]。由表2可知，樣品測序覆蓋率均大于0.99，可用于細(xì)菌多樣性分析，相對于SS組而言，CL組和BC組中ACE、Chao、Shannon指數(shù)普遍降低，而Simpson指數(shù)普遍升高，表明低溫對部分微生物的生長產(chǎn)生抑制作用，更適于耐冷優(yōu)勢菌生長。與其他樣品相比，BC- 48組的微生物多樣性和豐富度下降明顯，各菌種分布均勻度增加，可能是因?yàn)閿噫溋魍?8 h后金鯧魚已開始腐敗變質(zhì)，營養(yǎng)環(huán)境發(fā)生了改變，導(dǎo)致優(yōu)勢腐敗菌占據(jù)優(yōu)勢，從而抑制了其他細(xì)菌的繁殖生長，并形成了新的群落結(jié)構(gòu)[23]。而樣品BC- 120組的微生物多樣性和豐富度上升，可能是由于代謝產(chǎn)物的累積導(dǎo)致微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了轉(zhuǎn)變[24]。另外CL組中各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的ACE、Chao、Shannon指數(shù)均高于BC組(除CL- 120組的ACE指數(shù)外)，而Simpson指數(shù)正好相反，表明CL組樣品中的微生物多樣性比BC組更加豐富。結(jié)果表明：溫度波動(dòng)導(dǎo)致細(xì)菌群落的豐富性和多樣性減少，使CL組與BC組樣品間細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)差異明顯。這與肖蕾[25]對大目金槍魚的研究結(jié)果相似，證明水產(chǎn)品中的微生物多樣性變化受溫度波動(dòng)的影響明顯。

表2 模擬冷鏈流通過程中金鯧魚樣品序列信息和Alpha多樣性指數(shù)

2.3.2微生物群落結(jié)構(gòu)組成分析

經(jīng)RDP classifier軟件對樣品序列物種注釋，本研究在門、屬分類學(xué)水平具體分析了冷鏈流通期間魚肉的微生物群落結(jié)構(gòu)組成。模擬冷鏈流通期間魚肉的微生物菌相主要由變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、綠彎菌門(Chloroflexi)、擬桿菌門(Bacteroidetes)組成，除這些主要菌門外，還存在一些豐度較低的放線菌門(Actinobacteria)、浮桿菌門(Planctomycetes)、酸桿菌門(Acidobacteria)等，選取豐度前10的菌種繪制成門水平的菌落結(jié)構(gòu)分布圖[圖8(a)]。在門水平上，SS組(SS- 0、SS- 24)中擬桿菌門由31.01%快速下降至10.36%，后續(xù)波動(dòng)較小并保持在一定范圍內(nèi)，說明擬桿菌門不是樣品腐敗的主要原因。而SS- 24組與CL組(CL- 48、CL- 96)比較發(fā)現(xiàn)，它們的菌相組成相似，表明在冷鏈過程中溫度維持在2 ℃左右時(shí)細(xì)菌的種類與相對豐度變化較小；而與BC組(BC- 48、BC- 96)相比，BC- 48組的變形菌門迅速增至74.52%，BC- 96組的優(yōu)勢菌除了變形菌門(57.01%)還有厚壁菌門(30.43%)。當(dāng)后期流通溫度變?yōu)? ℃(到達(dá)家庭冰箱)時(shí)，菌相再次發(fā)生變化，變形菌門和綠彎菌門成為主要優(yōu)勢菌，但CL組與BC組存在數(shù)量差異。結(jié)果表明：環(huán)境溫度與菌相組成相關(guān)，變形菌門在金鯧魚腐敗過程中發(fā)揮著重要作用。

圖8 模擬冷鏈流通過程中金鯧魚的微生物群落結(jié)構(gòu)差異Fig.8 Differences of microbial community structure of Trachinotus ovatus during simulated cold chain circulation

模擬冷鏈流通期間魚肉的微生物菌相在屬水平主要包括苯基桿菌屬(Phenylobacterium)、八疊球菌屬(Sporosarcina)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、長繩菌屬(Longilinea)、普雷沃菌屬(Prevotella)，除這些主要菌屬外，還存在鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、大豆根瘤菌屬(Bradyrhizobium)、伯克霍爾德菌屬(Burkholderia)等，選取豐度前10的菌種繪制成屬水平的菌落結(jié)構(gòu)分類圖[圖8(b)]。在屬水平上，各樣品在冷鏈流通期間微生物多樣性與豐度存在區(qū)別。新鮮金鯧魚樣品以苯基桿菌屬、普雷沃菌屬、鞘氨醇單胞菌屬和乳桿菌屬為主；隨著貯藏時(shí)間的延長部分微生物的繁殖呈現(xiàn)不同變化趨勢，在冷藏中后期CL組主要以苯基桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、長繩菌屬、unclassified_Anaerolineaceae為主；而由于溫度波動(dòng)導(dǎo)致BC組與CL組存在一定區(qū)別，BC組主要以苯基桿菌屬、八疊球菌屬、長繩菌屬和unclassified_Anaerolineaceae為主。屬水平分析結(jié)果與門水平一致，特別是屬水平的結(jié)果證明溫度波動(dòng)使細(xì)菌種類與菌數(shù)發(fā)生變化。

在整個(gè)冷鏈流通過程中苯基桿菌屬(Phenylobacterium)始終占據(jù)優(yōu)勢，相對豐度為16.07%～83.51%。在冷藏中期BC- 48組中相對豐度達(dá)到最大值83.51%，CL- 48組中占74.54%，冷藏后期雖有一定程度下降，但BC組的占比仍高于CL組，說明冷鏈流通過程中的溫度波動(dòng)提高了該菌屬的增長速率。苯基桿菌屬是被Lingens等[26]在1985年首次鑒定出，近年來該菌屬的相關(guān)新菌種于湖水[27]、農(nóng)藥制造廠的污泥[28]等生境中不斷被分離出，支持了苯基桿菌屬在自然界分布廣泛、生命力頑強(qiáng)的觀點(diǎn)，但鮮見有報(bào)道其在水產(chǎn)品腐敗中的作用，具體腐敗作用有待進(jìn)一步研究。

在新鮮魚肉樣品(SS- 0)中普雷沃菌屬(Prevotella)、乳桿菌屬(Lactobacillus)和鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)占比最高，相對豐度比例分別為45.20%、13.30%和12.27%。普雷沃菌屬、乳桿菌屬在冷藏120 h后相對豐度均小于1%，說明普雷沃菌屬、乳桿菌屬并非金鯧魚冷鏈流通過程中的優(yōu)勢菌。而鞘氨醇單胞菌屬廣泛存在于各種水體中，是海洋中的優(yōu)勢菌群，具有極強(qiáng)生命力并可以適應(yīng)不斷變化的環(huán)境[29]。剛捕撈的金鯧魚魚體表面會帶有這類菌群，低溫在一定程度上可抑制其生長，但經(jīng)過沒有溫度波動(dòng)的理想冷鏈過程(0～96 h)后，CL- 96組鞘氨醇單胞菌屬相對豐度可達(dá)到34.46%，成為CL組流通中期的次要優(yōu)勢菌。相反在BC- 96組中八疊球菌屬(Sporosarcina)占比較高(30.75%)，成為BC組流通中期的次要優(yōu)勢菌。已有相關(guān)研究證明：八疊球菌屬是與食源性病原體蠟狀芽孢桿菌有密切關(guān)系的菌株，Tsuda等[30]從阿拉斯加鱈魚、梭子魚和白花魚的魚糜中分離出了八疊球菌屬，并發(fā)現(xiàn)其在10 ℃下的生長能力比28 ℃下更強(qiáng)。

隨著流通時(shí)間的延長，長繩菌屬在CL- 120、BC- 120組相對豐度分別升至20.20%和26.86%，unclassified_Anaerolineaceae相對豐度占比大于10%，已知其為厭氧繩菌綱(Anaerolineae)，在流通末期的相對豐度分別升至37.66%和45.43%，與長繩菌屬變化規(guī)律一致，但未能鑒定到具體菌屬，因此有待進(jìn)一步研究。長繩菌屬和unclassified_Anaerolineaceae兩者均為綠彎菌門(Chloroflexi)，可從河口、海水、海底沉積物、污染河流和活性淤泥中鑒定出[31]，因此可認(rèn)為長繩菌屬和unclassified_Anaerolineaceae為流通末期的次要優(yōu)勢菌。

本研究檢測到冷鏈流通前期SS組的優(yōu)勢菌群是苯基桿菌屬，由于溫度波動(dòng)的存在導(dǎo)致貯藏后期流通過程主要優(yōu)勢屬種有所不同，CL組的優(yōu)勢菌群是苯基桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬和長繩菌屬，BC組的優(yōu)勢菌群是苯基桿菌屬、八疊球菌屬和長繩菌屬。同時(shí)結(jié)果表明：部分優(yōu)勢微生物對冷鮮金鯧魚品質(zhì)變化有著至關(guān)重要的影響。但這與于淑池等[24]通過傳統(tǒng)選擇性培養(yǎng)結(jié)合16S rDNA序列分析腐敗希瓦氏菌(Shewanellaputrefaciens)是冷藏卵形鯧鲹的優(yōu)勢腐敗菌的研究結(jié)果不一致，其原因一方面可能是物種棲息地不同導(dǎo)致初始菌相不同，另一方面可能是由于高通量測序技術(shù)較傳統(tǒng)分離檢驗(yàn)技術(shù)更為快捷全面，能夠直接對待測樣本中全部基因組序列進(jìn)行檢測，從而能夠檢查出以前無法培養(yǎng)的比較新型的腐敗菌。

2.4 細(xì)菌群落功能預(yù)測分析

在不同貯藏時(shí)間菌群的多樣性和分布特征分析的基礎(chǔ)上，利用細(xì)菌群落功能預(yù)測工具PICRUSt對金鯧魚細(xì)菌群落分布進(jìn)行了功能特征預(yù)測。依據(jù)KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析對比，新陳代謝通路是各類微生物獲得營養(yǎng)后進(jìn)行個(gè)體生長發(fā)育繁殖的主要代謝作用途徑，同時(shí)也是直接影響各類食品品質(zhì)和風(fēng)味的主要代謝途徑[32]。與新陳代謝相關(guān)的通路主要是各種碳水化合物代謝、氨基酸代謝、能量代謝、脂質(zhì)代謝、核苷酸代謝、輔酶因子及各種維生素代謝等，其中碳水化合物代謝、氨基酸代謝、脂質(zhì)代謝這三大新陳代謝與腐敗氧化有著較為緊密的聯(lián)系，圖9是與三大新陳代謝作用相關(guān)的基因的相對豐度分布特征分析。

在代謝功能基因聚類上，根據(jù)不同的貯藏時(shí)間和環(huán)境溫度波動(dòng)這2個(gè)因素，金鯧魚樣品細(xì)菌代謝相關(guān)基因可聚成4類。隨著魚肉貯藏時(shí)間的延長，由于細(xì)菌的形成而產(chǎn)生大量代謝產(chǎn)物，代謝基因相對豐度總體呈先上升后下降趨勢。魚肉經(jīng)過24 h冷藏后，溫度波動(dòng)導(dǎo)致冷藏中期的代謝相關(guān)基因存在差別，但整體上在BC- 48、BC- 96組中代謝相關(guān)基因相對豐度持續(xù)上升，而CL- 48、CL- 96組中的代謝相關(guān)基因相對豐度則隨之降低；而在冷藏后期代謝相關(guān)通路發(fā)生轉(zhuǎn)變，但代謝相關(guān)基因豐度隨之降低，而BC- 120組代謝相關(guān)基因豐度高于CL- 120組，這可能是由于在冷藏后期細(xì)菌多樣性下降，群落結(jié)構(gòu)趨于簡單，導(dǎo)致代謝相關(guān)菌減少而引起相關(guān)基因相對豐度的降低，這與張夢思等[33]發(fā)現(xiàn)日本鯖與黃魚在冷藏中后期代謝相關(guān)基因相對豐度降低的研究結(jié)果相似。

圖9 模擬冷鏈流通過程中金鯧魚碳水化合物、脂類、氨基酸代謝分類功能預(yù)測Fig.9 Prediction of carbohydrate, lipid, and amino acid metabolism classification function during simulated cold chain circulation of Trachinotus ovatus

在整個(gè)貯藏過程中，氨基酸代謝在基因通路豐度上占據(jù)明顯優(yōu)勢，以色氨酸、苯丙氨酸代謝以及賴氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解為主；在碳水化合物代謝基因通路中，主要以丙酸代謝和丁酸代謝為主；而脂質(zhì)代謝通路中主要以脂肪酸降解為主。BC組的各個(gè)代謝相關(guān)基因豐度都超過了CL組，因此BC組較CL組的腐敗速度快，說明由于溫度波動(dòng)而使得BC組中能夠進(jìn)行蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂類等物質(zhì)新陳代謝的微生物數(shù)量比CL組更為豐富，在相關(guān)微生物的作用下產(chǎn)生的醛、酮和酸等物質(zhì)使魚體產(chǎn)生強(qiáng)烈腥臭味并引起品質(zhì)降低。

3 結(jié) 論

本研究分析了金鯧魚在冷鏈與斷鏈流通中品質(zhì)變化的相關(guān)性及其微生物群落演替規(guī)律。隨著流通時(shí)間的延長，BC組樣品的品質(zhì)顯著下降(P<0.05)，證明溫度波動(dòng)的存在與各指標(biāo)的變化密切相關(guān)，Pearson相關(guān)系數(shù)分析表明，菌落總數(shù)、嗜冷菌數(shù)、TVB- N值、pH值、K值均呈極顯著(P<0.01)相關(guān)性，可作為評判金鯧魚品質(zhì)變化情況的有效指標(biāo)。同時(shí)基于高通量分析金鯧魚微生物群落變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌群落的豐富性和多樣性會隨貯藏時(shí)間的延長而降低，菌相分析判斷苯基桿菌屬是金鯧魚整個(gè)冷鏈流通期間的主要優(yōu)勢菌，其中CL組的次要優(yōu)勢菌是鞘氨醇單胞菌屬、長繩菌屬和unclassified_Anaerolineaceae；BC組的次要腐敗菌是八疊球菌屬、長繩菌屬和unclassified_Anaerolineaceae。通過細(xì)菌群落功能預(yù)測，從代謝水平上進(jìn)一步解釋了溫度波動(dòng)導(dǎo)致BC組中微生物新陳代謝的增強(qiáng)，引起更快速地腐敗現(xiàn)象。本研究表明：冷鮮水產(chǎn)品的腐敗速率不但與優(yōu)勢微生物相關(guān)，還和運(yùn)輸方式有著十分重要的關(guān)系，為了達(dá)到抑制微生物生長繁殖的目的，需全面調(diào)控冷鏈流通期間的各影響因素以保證商品質(zhì)量，研究旨在為水產(chǎn)品運(yùn)輸消費(fèi)過程中的儲藏保鮮提供理論依據(jù)。