高 靜，周明國

（南京農業(yè)大學植物保護學院，南京 210095）

使用化學殺菌劑是防治農作物病害的重要措施之一，極大地保障了農作物高產、穩(wěn)產。隨著科學技術的進步，殺菌劑逐漸從單一的多作用位點殺菌劑發(fā)展為高效選擇性殺菌劑，琥珀酸脫氫酶抑制劑（SDHIs）和甲氧基丙烯酸酯類（QoIs）殺菌劑是目前市面上使用體量較大的選擇性殺菌劑，但是隨著藥劑使用時間、范圍、頻率的不斷增加，殺菌劑抗藥性問題也變得越來越普遍和嚴重，常突發(fā)性暴發(fā)導致防治失敗，造成農作物減產、減質，極大地增加了有害生物的防治難度。本文結合國內外殺菌劑抗性進展，詳細介紹了SDHI和QoIs 2類藥劑的抗性發(fā)生現(xiàn)狀和抗性機制，并總結了抗藥性監(jiān)測手段，提出了抗藥性治理建議，旨在為我國有害生物科學防控、殺菌劑抗性治理提供理論參考。

1 殺菌劑抗性發(fā)生現(xiàn)狀

1.1 琥珀酸脫氫酶抑制劑類

琥珀酸脫氫酶抑制劑（SDHIs）類殺菌劑在分子上均有（苯）酰胺結構，故又名酰胺類殺菌劑，是殺菌劑抗性行動委員會（FRAC）于2009年劃分出來的一類作用機制和抗性機理相似的化合物。該類殺菌劑作用機制為抑制病原菌線粒體呼吸電子傳遞鏈和三羧酸循環(huán)中琥珀酸脫氫酶活性，干擾呼吸作用，阻礙能量產生，從而殺死病原菌。最早的SDHIs殺菌劑——萎銹靈于19世紀60年代上市，主要用于防治谷類作物銹病和黑粉病等擔子菌病害，因其易氧化和光解，多用于種子處理[1]。直到2003年，巴斯夫公司創(chuàng)制出第一個能夠用于噴霧和具有廣譜殺菌活性的殺菌劑——啶酰菌胺[2]，推動了SDHIs類殺菌劑的快速發(fā)展。目前，一系列新型SDHIs，如氟吡菌酰胺、異丙噻菌胺、氟唑菌酰羥胺和聯(lián)苯吡嗪菌胺等，已被廣泛用于防治多種作物白粉病、葉斑病、菌核病、灰霉病、赤霉病等真菌病害。其中氟吡菌酰胺還可通過土壤處理防治多種作物根結線蟲病。

SDHIs藥劑均含有酰胺基（-CONH-）基團，相似的化學結構也決定了該類藥劑作用機理相似——與作用靶標琥珀酸脫氫酶單位點結合，靶標位點突變即可產生抗藥性。19世紀90年代，Leroux[3]研究報道了生產上首例真菌褐黑粉菌（Ustilago nuda）對萎銹靈產生了抗藥性。在啶酰菌胺上市4年后，Zhang等[2]報道了田間和實驗室灰霉病菌（Botrytis cinerea）對啶酰菌胺產生了抗藥性。隨著田間用藥的增加，抗性問題也日益突出?；颐共【鷮DHIs的抗性問題呈高發(fā)趨勢，Hu等[4]發(fā)現(xiàn)田間分離的草莓灰霉菌株對啶酰菌胺、氟吡菌酰胺、氟唑菌酰胺和吡噻菌胺的抗性頻率在3年內分別增加至30.0%、1.0%、5.5%和7.4%。除了灰霉病菌以外，多種田間病原菌也對該類藥劑產生抗性，如桃褐腐病菌[5]、黃瓜白粉病菌[6]均對啶酰菌胺產生抗性，大麥網班病菌對大多數SDHIs藥劑產生抗性[7]，以及殺菌劑抗性行動委員會（FRAC）報道田間發(fā)現(xiàn)大豆銹病、油菜菌核、大麥葉斑抗性菌株等。除抗性發(fā)生頻率外，抗性菌株生物活性、適合度和藥劑交互抗性數據對后續(xù)用藥也具有重要指導意義，如發(fā)現(xiàn)核盤菌的啶酰菌胺抗性菌株適合度降低，且與萎銹靈存在正交互抗性[8]，則萎銹靈抗性菌株不可使用啶酰菌胺防治。FRAC基于不同的SDHI交互抗性模式、抗藥性變異頻率、抗藥性水平及適合度等因素，評估SDHIs的抗藥性風險為中等至高等。因此，隨著SDHIs藥劑的使用時間延長和應用規(guī)模擴大，抗性問題也將進一步加重。

1.2 甲氧基丙烯酸酯抑制劑類

甲氧基丙烯酸酯抑制劑（QoIs）類殺菌劑作用于呼吸鏈復合物Ⅲ細胞色素氧化酶bc1復合物（泛醌氧化酶）外側，殺菌基團是其分子上的甲氧基丙烯酸酯活性基團。該類化合物抗菌譜廣，對半知菌、子囊菌、擔子菌和卵菌都有較好的抗菌活性。

19世紀90年代，嘧菌酯和醚菌酯進入市場，隨后肟菌酯、啶氧菌酯、吡唑醚菌酯相繼上市。由于作用方式單一，QoIs極易產生抗藥性。QoIs上市2年后，德國北部地區(qū)發(fā)現(xiàn)小麥白粉病菌對醚菌酯產生抗性[9]，且抗性發(fā)展較快。此后，小麥赤霉病、白粉病、葉枯病，大麥網斑病，水稻紋枯病、稻瘟病，大豆褐斑等多種作物病害對該類藥劑表現(xiàn)出抗性[10]。在瓜果類作物中，霜霉病抗性問題比較嚴重。QoIs類殺菌劑在法國和意大利上市4年后即檢測到葡萄霜霉菌株對其產生抗性[11]。隨著用藥的不斷增加，葡萄霜霉病對QoIs類殺菌劑已經發(fā)展出嚴重抗性，美國佐治亞州3個葡萄園39株葡萄霜霉菌株全部表現(xiàn)出抗性[12]。隨著藥劑的不斷擴大使用，瓜類白粉病、果樹黑星病、瓜果炭疽病等病原菌也對QoIs產生抗性。研究發(fā)現(xiàn)，蘋果黑星病菌對嘧菌酯產生了嚴重抗性，抗性頻率為96.4%[13]。中國不同地區(qū)162株黃瓜靶斑病菌對吡唑醚菌酯均已產生較高抗性，且抗性菌株適合度比敏感菌株更高[14]。溫室中采集到的黃瓜褐斑病菌對QoIs類殺菌劑的抗性高達100%，且對6種QoIs藥劑表現(xiàn)出較強的正交互抗性[15]。不同的是，經過多年的使用，QoIs類殺菌劑在田間銹病病菌中極少未進化出抗藥性，原因是銹病抗性菌株發(fā)生氨基酸突變后適合度大大降低，不能在田間形成抗性群體。結合抗性產生和發(fā)展情況，F(xiàn)RAC將QoIs殺菌劑歸類為高抗性風險殺菌劑。

2 殺菌劑的抗性機制

2.1 琥珀酸脫氫酶類抑制劑

SDHIs藥劑的作用靶標為病原菌呼吸作用電子傳遞鏈上的復合體Ⅱ，由黃素蛋白（Fp，SdhA）、鐵硫蛋白（Ip，SdhB）和另外2種嵌膜蛋白（SdhC和SdhD）等4個亞基組成。

目前，研究發(fā)現(xiàn)病原菌對SDHIs產生抗性主要是因為靶標復合物Ⅱ發(fā)生氨基酸突變。藥靶蛋白發(fā)生氨基酸突變后，與藥劑的結合受阻，親和力降低，從而使藥劑喪失殺菌作用。其中，大多數突變發(fā)生于SdhB、SdhC和SdhD，發(fā)生于SdhA的突變極少，具體可見表1?；颐共【l(fā)生SdhB-P225L、SdhC-G85A和I93V點突變后，對氟唑菌酰羥胺產生抗性[16]。據統(tǒng)計，灰霉病菌SdhB亞基中與SDHIs抗性有關的突變?yōu)镻225F/L/T/H、N230I、H272R/Y/L/V[17]，SdhD亞基中為H132R[18]。286株鏈格孢霉對啶酰菌胺的抗性菌株基因中有11種突變，80%為SdhB的氨基酸突變（7種：H277Y/R/L，P230A/R，N235D/T），其余為SdhC（1種：H134R）、SdhD（3種：D123E，H133R/P）[19]。西瓜蔓枯病菌的氟唑菌酰羥胺抗性菌株同樣為SdhB（H277Y）突變[22]。有趣的是，同一種氨基酸突變會對不同的SDHI類藥劑產生不同的效果，如灰霉病菌SdhB（H272R）對除氟吡菌酰胺外的所有SDHIs均產生抗性，SdhB（H272Y）則產生氟吡菌酰胺超敏反應[24]。這可能是因為不同的藥劑化學基團不同，藥靶氨基酸突變后與藥劑的結合模式差異較大，從而產生了截然不同的抗性結果。此外，發(fā)生在不同的真菌物種中的同源氨基酸突變也會產生不同的影響，如M.graminicola的P220位點突變和B.cinerea的P225位點突變[25]。

表1 SDHIs殺菌劑抗性菌株氨基酸突變類型

除了氨基酸突變以外，靶標的遺傳分化也會導致藥劑抗性。赤霉病菌存在2個SdhC的遺傳分化，降低了對SDHIs的敏感性。除赤霉病菌外，小麥葉枯病菌分化出一個SdhC的同源基因——alt-SDHC，該基因介導了對氟唑菌酰羥胺、氟吡菌酰胺等SHA-SDHIs亞類殺菌劑的天然抗性。Alt-SDHC與其他3個SDH亞基結合可產生功能齊全的酶，其蛋白中的獨特Qp位殘基賦予了SHA-SDHI抗性。歐洲小麥葉枯病菌群體中20%～30%菌株存在alt-Sdhc基因，且該基因的表達水平、剪切效率可直接影響菌株對氟唑菌酰羥胺等藥劑的抗性水平，這種現(xiàn)象表明了靶標的分化對藥劑抗性的重要影響作用[26]。

2.2 甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑

QoIs和SDHIs同屬于呼吸抑制劑，均結合于線粒體呼吸作用電子傳遞鏈上的復合物，但QoIs主要結合于復合物Ⅲ中細胞色素b（Cyt b）的Qo位點，從而抑制氫醌與Qo位點的結合，中斷復合物Ⅲ的電子傳遞，使病原菌不能產生ATP，進而造成能量代謝紊亂[27]。

細胞色素b由線粒體DNA編碼，容易發(fā)生氨基酸突變產生抗藥性。已報道的病原菌對該類殺菌劑的抗性突變類型是G143A、F129L和G137R，表2統(tǒng)計了常見病原菌的抗性突變類型。第一種，G143A為核苷酸密碼子由GGT突變?yōu)镚CT，丙氨酸取代甘氨酸，藥劑與靶標的結合能力受到較大影響，因此產生了高水平抗藥性。G143A在田間抗性菌株中十分常見，像蘋果黑星病菌27株抗性菌株均為G143A點突變[13]，黃瓜靶斑病菌162株抗性菌株中均檢測到了G143A點突變[14]。G143A引發(fā)的抗性倍數可高達數百倍，大大影響了QoIs單劑在田間的藥效[30]。菜豆銹菌等143位密碼子后存在內含子，突變后抗性菌株不能在田間生存，因此很少有高水平抗藥性發(fā)生[31]?；颐共【嬖?43位密碼子后包含和不包含內含子2種基因型，在QoIs藥劑廣泛使用后，自然界形成了G143A高水平抗藥性基因型病原菌群體[32]。第二種，苯丙氨酸轉變?yōu)榱涟彼幔‵129L）使得Cyt b空間上更靠近血紅素bL，干擾QoIs殺菌劑毒性基團發(fā)揮作用，進而產生高水平抗性，但抗藥性水平略低于G143A。F129L抗藥性變異對致病性的影響比較大[28]。第三種，甘氨酸被精氨酸取代（G137R）產生的抗性多為低抗和中抗，且抗性變異的適合度代價較大，難以在田間存活。

表2 QoIs殺菌劑抗性菌株氨基酸突變類型

除氨基酸突變外，旁路氧化途徑（又名替代氧化途徑）也是導致QoIs產生抗性的重要原因之一。旁路氧化途徑指的是電子從NADH經FMN、Fe-S、UQ、FP，由旁路氧化酶（AOX）傳至氧，該過程不經過復合物Ⅲ。很多真菌的AOX為誘導表達型，即正常條件下表達水平很低或者不表達，但如果以細胞色素為介導的呼吸途徑被阻斷或線粒體蛋白的合成受到抑制，AOX則會被誘導表達[27]。嘧菌酯、肟菌酯都可激活甜橙炭疽病菌的旁路氧化途徑，從而導致抗性增加[33]。旁路氧化途徑合成的ATP只是經過復合物III合成能量的40%，因此通過增加旁路氧化酶活性而表現(xiàn)抗藥性的菌株適合度低，不是生產實際中產生抗藥性的主要機制。

3 殺菌劑的抗藥性監(jiān)測

目前，化學防治仍是防控真菌病害最有效的方法。由于病原微生物具有較高的繁殖率，在藥劑選擇壓力下，少數抗藥性突變菌株在較短時間內就可能通過侵染和繁殖形成抗藥性群體，導致殺菌劑突然失效，防控措手不及，造成重大損失。因此，抗藥性群體發(fā)展態(tài)勢監(jiān)測及早期預警十分重要。

抗藥性監(jiān)測和治理大概可分為4個階段[9]：第一步是在殺菌劑投入市場之前，在實驗室測定病原菌對藥劑的敏感性，建立敏感基線。通過敏感基線可以比較不同病原菌對殺菌劑敏感性的時空變化，有利于掌握病原菌抗性發(fā)展動態(tài)[34]。從實驗室數據中評估藥劑的抗藥性風險，制定藥劑的初步使用策略。第二步是在殺菌劑前期使用階段，此階段可能會出現(xiàn)一些抗性個例。采集田間抗性菌株，確定是否產生抗性、與其他藥劑是否有交互抗性及適合度變化等問題，調整藥劑使用策略并加強抗藥性監(jiān)測。第三步是在抗性問題比較普遍情況下，通過抗性監(jiān)測認識到抗性的傳播速度、發(fā)展速度，探究抗性機制，進一步調整藥劑使用策略（多分為繼續(xù)使用和禁用2種）。第四步指的是藥劑被禁用的情況下，繼續(xù)監(jiān)測病原菌的抗性發(fā)展情況，為同類藥劑的使用提供理論參考。

傳統(tǒng)的抗藥性監(jiān)測方法主要是敏感性測定和區(qū)分劑量法[35]。敏感性測定指的是通過菌絲生長速率法或孢子萌發(fā)法將病原菌放置到含藥培養(yǎng)基或噴灑藥劑的植物組織上，檢測病原菌對藥劑的敏感性。該方法通過計算EC50值（引起群體50%個體死亡的藥劑濃度）確定病原菌的抗性水平，計算抗性頻率，判斷抗性產生情況，評估該群體的抗藥性風險。區(qū)分劑量法指的是通過測定病原菌對藥劑的EC50值和MIC值（藥劑完全抑制病原菌生長的最小濃度），確定一個鑒別劑量，以病原菌是否可以在該濃度生長來判斷其敏感或抗性[9]。傳統(tǒng)方法主要適用于抗性機制還不完全明確的藥劑，比如檢測番茄灰霉病菌對苯醚甲環(huán)唑的抗性[36]。該方法對病原菌的抗性檢測是比較準確和靈敏的，但是過程費時費力，工作量比較大，不適合在田間展開。

隨著科學技術的進步，現(xiàn)代分子檢測法開始被應用。第一類方法為基于核酸檢測水平的分子技術，通過檢測已知的抗性位點來判斷抗性發(fā)展情況。單核苷酸多態(tài)性（SNPs），是指由于單個核苷酸改變而導致的核酸序列多態(tài)[9]，是研究生物遺傳變異的重要依據。由于藥劑靶標發(fā)生氨基酸突變而產生的抗性，可通過SNPs相關技術被監(jiān)測到，具體可包括Simoes等[23]利用物種特異性RT-PCR定性、定量檢測引發(fā)大豆銹病病菌對SDHIs抗性的C-I86F突變；Battistini等[37]采用微滴數字PCR檢測引發(fā)小麥葉枯病菌對QoIs抗性的典型突變G143A；Samaras等[17]應用高分辨率熔解（HRM）可快速識別對SDHIs有抗性的B.cinerea病菌SdhB上的P225H/F/L/T、N230I、H272L/R/Y突變[17]；利用環(huán)介導等溫擴增（LAMP）技術可以監(jiān)測和評估B.cinerea對QoIs藥劑的抗性發(fā)展風險[38-39]，而且不受實驗設備的限制，能夠直接用于現(xiàn)場快速檢測；采用實時定量熒光PCR技術[40]也可以實現(xiàn)抗性監(jiān)測等。第二類方法為分析靶標蛋白與藥劑的結合方式，如分子對接法，該方法是基于相關軟件模擬靶標蛋白與藥劑的結合，通過各個參數預測二者的結合方式和結合能力，從而推斷出抗性機制。陶麗紅等[41]利用分子對接研究了5種SDHIs與灰葡萄孢菌SDH的結合模式，并分析了氨基酸突變導致結合部位的結構變化。綜上比較可得，分子檢測技術相比于傳統(tǒng)檢測技術，檢測速度快，可批量檢測大批樣本，但適用范圍有限，成本比較高。

4 殺菌劑的抗藥性治理

田間出現(xiàn)抗藥性主要是因為長期頻繁使用同一種作用機制的藥劑，病原菌長期受到同一種篩選壓力，便容易進化出抗性群體。因此，抗藥性治理最重要的措施是合理規(guī)范用藥。

我們應充分了解病害的發(fā)生特點、藥劑的作用機理和抗性監(jiān)測情況，保證藥效的同時減少抗性群體的產生。在藥劑的選擇上，應考慮防治對象的特性、不同殺菌劑作用機制的差異、抗性機制的差異、抗性群體的生物學特性和適合度變化等因素。關于防治對象，明確病原菌的抗性風險級別，像小麥白粉病菌、灰霉病菌為高風險病原菌，小麥紋枯病菌為中風險病原菌，銹病菌為低風險病原菌，再結合藥劑特點進行組合用藥。關于藥劑的選用，應考慮藥劑作用機制和抗性機制，明確所用藥劑的抗性風險等級。避免使用FRAC中同一個亞類的藥劑，因為同一亞類的藥劑多有交互抗性（大多數SDHIs有正交互抗性；QoIs中代碼11的嘧菌酯、丁香菌酯、醚菌胺等有正交互抗性），建議使用無交互抗性（QoIs中代碼11和代碼11A）或有負交互抗性的藥劑；限制同一類作用機制藥劑的使用量，將不同作用機制的藥劑復配使用，目前藥劑混用多分為交替使用和混合使用2種，研究表明混合使用時效果更好[42]；對已經產生抗藥性的病原菌，根據其抗性特點合理安排藥劑，如對QoIs代碼11的藥劑產生抗性的G143A突變體，可使用代碼11A的藥劑防治。關于抗性群體的形成，通過檢測抗性菌株的菌絲生長、孢子萌發(fā)、致病力等生物學特性判斷其是否可以在田間形成抗性群體或成為病原菌的優(yōu)勢群體。適合度降低的情況下可繼續(xù)使用此類藥劑（G137R抗性菌株可繼續(xù)使用QoIs），適合度增加的情況下則不可使用（黃瓜靶斑抗性菌株不可使用吡唑醚菌酯）。探明SDHIs不同品種抗藥性突變類型及交互抗性模式后，制定合適的藥劑使用方案。

除此之外，確保用藥時間、用藥量和施藥方式正確。QoIs可有效抑制孢子萌發(fā)，應在病原菌孢子萌發(fā)階段使用。當藥效降低的時候不要盲目增加藥量，首先確認施藥方式是否正確，避免藥劑浪費影響藥效。最后，根據抗藥性監(jiān)測的結果及時調整用藥策略。QoIs可引起毒素含量增加，故不建議防治赤霉病，而井岡霉素與戊唑醇組合使用防治小麥赤霉病可達到抑菌降毒的效果，一舉多得[43]。

5 展望

隨著遺傳一致性的農產品商業(yè)化生產、氣候變暖以及保護地種植面積的不斷增加，農作物病害的發(fā)生與流行將會越來越嚴重。安全、高效的選擇性殺菌劑仍是應急防治農作物病害的主要武器。然而，伴隨選擇性殺菌劑廣泛應用，抗藥性問題是植物病害可持續(xù)綠色防控面臨的嚴峻挑戰(zhàn)。通過種植抗病品種和健康栽培等農藝措施可以降低病害防治壓力；通過科學安全使用農藥和采用綜合防治策略可以降低殺菌劑選擇壓力，二者結合必將能夠延緩抗藥性發(fā)展、延長殺菌劑使用壽命。此外，加強病原菌生物學基礎研究，不斷發(fā)現(xiàn)新的藥物分子靶標及解析分子靶標的藥敏性結構特征，創(chuàng)制新型靶向殺菌劑將是治理抗藥性的根本策略。