唐溫謙 劉金鑫 薛 娟 羅 磊 王 瑤 楊 帆,6△

一直以來，肝癌因其超高的全球發(fā)病率和病死率威脅著人類的健康，肝癌的發(fā)生通常會經(jīng)過一段漫長的肝癌前病變時期[1, 2]，肝癌前病變的實質(zhì)是肝細胞異常增殖、分化及凋亡紊亂[3]，是肝纖維化、肝硬化進展為肝癌的重要階段[4]。

抗纖軟肝顆粒是湖北省中醫(yī)院的院內(nèi)制劑，具有扶正化瘀、軟堅散結(jié)的功效。從20世紀90年代開始，一直被臨床上用于治療肝纖維化以及肝硬化患者，具有很好的療效。之前的研究也證實抗纖軟肝顆粒具有保護肝臟，緩解肝纖維化，改善肝臟微環(huán)境的作用[5, 6]。

為進一步了解抗纖軟肝顆粒對肝癌前病變的阻斷作用和機制，為肝癌的早期防治提供新的思路和方法，筆者觀察了抗纖軟肝顆粒含藥血清對N-甲基-N-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)誘導肝卵圓細胞系WB-F344上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過程中相關(guān)蛋白及細胞上清中甲胎蛋白(AFP)變化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料肝卵圓細胞系WB-F344購自武漢大學細胞典藏中心?？估w軟肝顆粒制劑購自湖北省中醫(yī)院，SD雄性大鼠(購自華中科技大學實驗動物中心，許可證號：420098000027320)。DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)(購自美國GIBCO)，N-甲基-N-硝基-N-亞硝基胍[(Nmethyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine,MNNG)購自中國北京百靈威科技有限公司(J&K Scientific)]。一抗(E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、GAPDH)、山羊抗兔二抗(購自武漢Proteintech Group)。甲胎蛋白(AFP)Elisa試劑盒[購自Elabscience(E-EL-R0153c)]。CCK-8試劑盒購自美國GLPBIO。

1.2 含藥血清的制備健康清潔級SD大鼠20只，體質(zhì)量(200±20)g,隨機分為2組?？估w軟肝顆粒配制成4.06 g/ml藥液，實驗組按成人10倍劑量(即1 ml/100 g體質(zhì)量)給SD大鼠連續(xù)6 d灌胃,每天給藥2次,第6天當夜禁食禁水, 第7天再給藥1次(1 d的量)。對照組予以相同劑量生理鹽水灌胃。給藥1 h后, 用2%戊巴比妥鈉溶液腹腔麻醉, 無菌條件下腹主動脈取血, 立即注入無菌EP管中, 室溫靜置0.5～1 h, 3000 rpm離心10 min, 吸取上清,-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 細胞造模及分組方法取凍存于液態(tài)氮中的WB-F344細胞株, 復蘇后用含10%胎牛血清(FBS)、100 U/L-1青霉素和100 mg/L-1鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基置于培養(yǎng)箱內(nèi)于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。取處于對數(shù)生長期細胞用0.25%胰蛋白酶消化后，用完全培養(yǎng)基制成細胞懸液，按2×104個/ml接種于6孔板，每孔2 ml。隨機分為正常組、模型組、抗纖軟肝顆粒含藥血清高、中、低組，除正常組外，余各組用3 mg/L的MNNG刺激24 h, 之后采用濃度為7×10-7mol/L的H2O2持續(xù)刺激12 h誘導EMT形成[7, 8]。棄上清，PBS漂洗，正常組、模型組予以等量空白血清，余各組分別予以高(原含藥血清濃度)、中(原含藥血清濃度一半)、低(原含藥血清濃度四分之一)不同濃度的抗纖軟肝顆粒藥物血清刺激細胞48 h。

1.4 CCK8法檢測細胞的增殖能力取對數(shù)生長期的細胞懸液, 接種于96孔板, 分組給藥刺激, 將加了相應量細胞培養(yǎng)液和CCK-8溶液但沒有加入細胞的孔作為空白組, 每組6個復孔, 培養(yǎng)24 h后每孔加入10 μl增強型CCK-8溶液。在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育1 h, 用酶標儀檢測450 nm吸光度, 并計算細胞活力。

1.5 Western blot 檢測蛋白的表達用 RIPA裂解液進行細胞裂解提取蛋白質(zhì)，Bicinchonininc acid(BCA)法檢測蛋白濃度。經(jīng)100 g/L SDS—PAGE分離膠電泳，聚偏二氟乙烯(PVDF)膜轉(zhuǎn)膜，50 L脫脂奶粉封閉，免疫反應抗體孵育一抗(E-cadherin, N-cadherin, Vimentin及GAPDH均按1∶1000)，4 ℃過夜。TBST洗滌3次，加入封閉液稀釋的二抗(1∶3000)后，常溫下孵育1.5 h，TBST洗滌3次，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯示液浸泡曝光，暗室發(fā)光、顯影、定影并獲取圖像。

1.6 酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測細胞上清中甲胎蛋白(AFP)含量在酶標包被板上分別設(shè)空白孔、標準孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液100 μl，余孔分別加標準品或待測樣品100 μl。給酶標板覆膜，37 ℃孵育90 min；棄去液體，甩干，每個孔中加入生物素抗體工作液100 μl，酶標板加上覆膜，37 ℃溫育1 h；棄去液體，甩干，每孔加酶結(jié)合物工作液100 μl，加上覆膜，37 ℃溫育3 min；棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每孔加底物溶液90 μl，酶標板加上覆膜37 ℃避光孵育15 min；每孔加終止液50 μl，終止反應，此時藍色立轉(zhuǎn)黃色；5 min內(nèi)用酶標儀在450 nm波長測量各孔的光密度(OD值)

2 實驗結(jié)果

2.1 抗纖軟肝顆粒含藥血清對MNNG誘導肝卵圓細胞系WB-F344增殖能力的影響與正常組比較，模型組細胞OD值高于正常組(P<0.05)，表明MNNG可以促進肝卵圓細胞系WB-F344的惡性增殖，造模成功；與模型組比較，含藥血清組細胞OD值低于模型組胞OD值越低(P<0.05)，表明抗纖軟肝顆，且含藥血清濃度越高，細粒含藥血清可以抑制肝卵圓細胞系WB-F344的惡性增殖。見表1。

表1 各組細胞OD值

2.2 抗纖軟肝顆粒含藥血清對MNNG誘導WB-F344細胞上清中AFP水平的影響與正常組比較，模型組細胞上清中AFP含量高于正常組(P<0.05)；與模型組比較，含藥血清組細胞上清中AFP含量低于模型組，且含藥血清濃度越高，AFP含量越低(P<0.05)，表明KXRG可以抑制MNNG誘導WB-F344細胞中AFP的生成，且抑制作用與其濃度成正相關(guān)。見表2。

表2 各組細胞上清中AFP的含量

2.3 抗纖軟肝顆粒含藥血清對MNNG誘導WB-F344細胞中EMT相關(guān)蛋白的影響與正常組比較，模型組細胞中E-cadherin蛋白表達均低于模型組(P<0.05)，而N-cadherin, Vimentin蛋白在細胞中的表達均高于模型組(P<0.05)；與模型組比較，含藥血清組細胞中E-cadherin蛋白表達均高于模型組，且含藥血清濃度越高，蛋白表達越高(P<0.05)，相反細胞中N-cadherin, Vimentin蛋白表達均低于模型組，且含藥血清濃度越高，蛋白表達越低(P<0.05)。表明KXRG可以抑制MNNG誘導WB-F344細胞中EMT的改變，且具有濃度依賴性。見表3。

表3 各組細胞EMT相關(guān)蛋白的表達

3 討論

肝癌的發(fā)生是一個多階段的發(fā)展過程[9]。研究顯示，在中國，90%以上的肝癌是由肝炎導致的肝纖維化和肝硬化更進一步發(fā)展，成為肝癌[10]。肝癌前病變是肝癌進展中啟動、促進和演變過程的中間階段[11]，其主要病理特征為HOC的增生，不良的微環(huán)境促使HOC的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的平衡打破，增加其對致癌物的易感性，加速了HOC的惡性轉(zhuǎn)變[12]。

研究表明，EMT的發(fā)生在肝癌前病變中起著重要作用[13]，EMT是指在一定條件下，上皮細胞在形態(tài)學上發(fā)生向間質(zhì)細胞表型的改變[14]，當細胞發(fā)生EMT時，不僅有細胞表型的改變，還包括細胞標志蛋白的改變，其特點是上皮細胞標志蛋白(E-cadherin)的減少和間質(zhì)細胞標志蛋白(N-cadherin和Vimentin)的增加[15]。E-cadherin是維持上皮細胞特性的一個重要分子,N-cadherin很少表達于正常上皮細胞中, 當細胞發(fā)生EMT時，N-cadherin表達上調(diào)，細胞間黏附性降低，從而允許細胞發(fā)生遷移或轉(zhuǎn)移，E-鈣黏蛋白向N-鈣黏蛋白的轉(zhuǎn)化, 被稱為鈣黏蛋白的轉(zhuǎn)換, 是肝癌前病變中EMT的關(guān)鍵步驟[16]。Vimentin是蛋白中間纖維家族重要成員, 廣泛表達于正常細胞間質(zhì), 其生物學功能包括維持細胞及細胞器形態(tài)、參與細胞分裂與分化、促進細胞黏附及移行、信號傳導等[17-19]。甲胎蛋白(AFP)是肝卵圓細胞的標志物，當肝卵圓細胞過度增殖，向肝癌細胞轉(zhuǎn)換時，AFP的表達升高[20]。研究證實，AFP作為肝癌干細胞的標志之一，可預示著患者的生存狀態(tài)和腫瘤復發(fā)[21]。因此，將AFP作為肝卵圓細胞已經(jīng)轉(zhuǎn)換為肝癌細胞的動態(tài)觀察指標。

中醫(yī)認為，肝纖維化屬于“癥瘕”“積聚”“臌脹”等范疇。2019年《肝纖維化中西醫(yī)結(jié)合診療指南(2019年版)》[22]提出正虛邪盛，邪毒久稽，肝絡(luò)受損，氣滯血瘀是肝纖維化-肝癌過程中基本病機，可歸納為“虛損生積”?？估w軟肝顆粒作為“軟堅散結(jié)，扶正化瘀”法的代表方，是已故國家級名老中醫(yī)呂繼端先生治療肝纖維化和肝硬化的經(jīng)驗方，具有軟堅散結(jié)、扶正化瘀的功效，之前的研究表明KXRG可以通過抑制肝星狀細胞(HSC)活化，從而抑制肝纖維化的發(fā)展[5, 6]。而HSC的活化也貫穿肝細胞癌癌前病變?nèi)^程[23]。一方面大量活化的HSC降低間質(zhì)膠原酶活性，減少細胞外基質(zhì)蛋白降解，使大量胞外基質(zhì)蛋白沉積，從而調(diào)節(jié)胞外基質(zhì)的降解與合成；另一方面HSC分泌的促炎因子又進一步加重對已損傷肝細胞區(qū)域的浸潤，促進局部炎性細胞的趨化性、黏附性和活性，進而促使肝癌微環(huán)境的形成[24]?；诖?，筆者提出KXRG能夠通過抗肝纖維化改善肝癌微環(huán)境，有利于肝卵原細胞向正常肝細胞的方向分化，抑制肝卵原細胞異常增殖，誘導其凋亡，從而延緩或阻斷肝癌癌前病變的發(fā)生發(fā)展。

本研究顯示KXRG可以抑制肝癌前病變過程中肝卵圓細胞的增值，抑制肝卵圓細胞上皮-間質(zhì)的轉(zhuǎn)化，從而抑制肝癌的發(fā)生和發(fā)展，其可能的機制是調(diào)控EMT過程中相關(guān)蛋白E-cadherin、Vimentin和N-cadherin的表達。

這些發(fā)現(xiàn)為運用“軟堅散結(jié)，扶正化瘀”法在肝纖維、肝硬化階段進行早期干預，防治肝癌提供了基礎(chǔ)研究依據(jù)。然而，由于抗纖軟肝顆粒含藥血清成分的復雜性，無法確定單體成分的作用性及其作用機制，這也會是今后更進一步研究的重點。