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米糠液態(tài)發(fā)酵紫色紅曲霉產(chǎn)色素的營養(yǎng)因子優(yōu)化

2022-10-10 07:47夏欣欣郭明偉劉曼麗孫晶晶吳興泉
關(guān)鍵詞:紅曲米糠氮源

夏欣欣,陳 迪,姜 凌,郭明偉,劉曼麗,孫晶晶,吳興泉

河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院,河南 鄭州 450001

紅曲霉(Monascusspp.)是一種藥食兩用的絲狀真菌[1],在中國、日本和東南亞國家用于食品發(fā)酵和藥物生產(chǎn)已有近2 000年的歷史[2]。紅曲霉可以產(chǎn)生多種有益次級代謝產(chǎn)物,通常具有聚酮結(jié)構(gòu)和生物活性,包括紅曲色素(MPs)[3]、莫納可林K(MK)[4]和γ-氨基丁酸等[5]。紅曲色素作為著色劑在食品領(lǐng)域應(yīng)用廣泛,如腐乳[6]、肉制品[7]、紅曲黃酒[8]、紅曲面包[9]等。由于化學(xué)合成著色劑對健康的不利影響,微生物來源的天然食品著色劑相較來說則更為安全,通過感官和生物安全性評價(jià)發(fā)現(xiàn)紅曲色素具有食品著色劑的生物安全性和適用性[10]。紅曲色素是一種混合色素,其中主要的6種色素是紅色素(紅斑胺(rubropunctamine)[11]、紅曲紅胺(monascorubramine)[12])、橙色素(紅斑素(rubropunctatin)[13]、紅曲紅素(monascorubrin)[12])和黃色素(紅曲素(monascin)[14]、紅曲黃素(ankaflavin)[13])。紅曲色素的各個(gè)組分可以用于不同食品的著色。此外,紅曲色素還具有抗炎[15]、抗癌[16]、抑制肥胖[17]、降血糖[18]等功效。近年來紅曲色素已成為微生物源天然色素中發(fā)展速度最快的食品添加劑之一。

目前,發(fā)酵紅曲霉產(chǎn)紅曲色素的原料主要是大米,而大米作為世界第二大主糧,供給全球1/2人口,完全依賴大米為培養(yǎng)基質(zhì)發(fā)酵產(chǎn)紅曲色素,無疑增加了紅曲色素的生產(chǎn)成本[19]。在大米加工過程中會(huì)產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物米糠,其含量可占糙米的5%~8%,全球年產(chǎn)量約2 930萬t[19]。米糠是米粒的外層,主要由果皮、糊粉層、亞糊粉層和胚芽組成,其營養(yǎng)物質(zhì)豐富,膳食纖維量大,抗氧化能力強(qiáng),對多種代謝性疾病有一定的治療作用,但常被用作動(dòng)物飼料,或被當(dāng)作廢物扔掉[19]。若能將米糠作為紅曲色素的生產(chǎn)原料,可降低生產(chǎn)成本,提高農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物米糠的利用價(jià)值。

近年來利用農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物生產(chǎn)紅曲色素的研究報(bào)道越來越多,De Almeida等[20]以玉米麩皮為原料,采用深度發(fā)酵工藝優(yōu)化紅曲色素的生產(chǎn)工藝。Silva等[21]以農(nóng)業(yè)和工業(yè)廢渣(米粉和甘蔗糖蜜)為基質(zhì)生產(chǎn)紅曲霉色素。Liu等[22]用水稻秸稈添加葡萄糖為培養(yǎng)基提高了紅曲色素的色價(jià)。然而,以米糠為基質(zhì)添加外源營養(yǎng)因子以提高紅曲色素產(chǎn)量的研究報(bào)道并不多見。吳雙雙等[23]以米糠為基質(zhì)發(fā)酵產(chǎn)MPs和MK,發(fā)現(xiàn)米糠更適合紅曲霉產(chǎn)MK,且并未發(fā)現(xiàn)有效提高M(jìn)Ps產(chǎn)量的刺激物。

本試驗(yàn)以米糠為基質(zhì),以色價(jià)為主要評價(jià)指標(biāo),篩選了不同碳源、氮源和無機(jī)鹽作為營養(yǎng)因子,研究其對紫色紅曲霉M9產(chǎn)色素的影響,并采用響應(yīng)曲面分析得到了提高紅曲色素產(chǎn)量的最佳營養(yǎng)組成,同時(shí)采用TLC和HPLC分析了優(yōu)化前后紅曲色素的組分變化,為綜合利用糧食副產(chǎn)物和提高紅曲色素產(chǎn)量提供了技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

從河南省原陽市宴賓米業(yè)購買糙米,經(jīng)碾米機(jī)打磨(1 060 r/min)得到米糠;試驗(yàn)使用菌株為實(shí)驗(yàn)室保藏菌種MonascuspurpureusM9(NO.CGMCC 3.19586)。

1.2 儀器與設(shè)備

TM05C碾米機(jī):佐竹(蘇州)機(jī)械有限公司;Spark酶標(biāo)儀:深圳市恩科生物科技有限公司;DK-S24水浴鍋:上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;BBS-DDC超凈工作臺:濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司;QYC-200搖床:上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;AGILENT 1260高效液相色譜儀:安捷倫(中國)科技有限公司;DHP-500恒溫培養(yǎng)箱:北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 培養(yǎng)基配方

斜面培養(yǎng)基:麥芽汁糖化液(10度)加入3%瓊脂,于121 ℃滅菌20 min。滅菌完成后傾斜擺放,待凝固后備用。

種子培養(yǎng)基:葡萄糖6.0 g,蛋白胨2.0 g,NaNO31.0 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,KH2PO41.0 g,用水定容至100 mL,121 ℃滅菌20 min。

米糠液態(tài)基本培養(yǎng)基:米糠2.5 g,用水定容至50 mL,121 ℃滅菌20 min。

大米液態(tài)基本培養(yǎng)基:大米2.5 g,用水定容至50 mL,121 ℃滅菌20 min。

碳源液態(tài)培養(yǎng)基:米糠2.5 g,外加一定質(zhì)量不同種類碳源,用水定容至50 mL,121 ℃滅菌20 min。

氮源液態(tài)培養(yǎng)基:米糠2.5 g,外加一定質(zhì)量不同種類氮源,用水定容至50 mL,121 ℃滅菌20 min。

無機(jī)鹽液態(tài)培養(yǎng)基:米糠2.5 g,外加一定質(zhì)量不同種類無機(jī)鹽,用水定容至50 mL,121 ℃滅菌20 min。

1.3.2 液態(tài)發(fā)酵紅曲霉M9

刮取斜面菌絲接種于種子培養(yǎng)基,180 r/min培養(yǎng)(36~48 h)得到種子培養(yǎng)液,經(jīng)8層紗布過濾得到孢子懸液,無菌水調(diào)節(jié)孢子濃度達(dá)106個(gè)/mL,取孢子懸液接種于50 mL液體培養(yǎng)基中,接種量6.00%,在28 ℃,180 r/min條件下發(fā)酵5 d。

1.3.3 色素提取液的制備

參照薛原[24]使用的方法進(jìn)行色素液的提取。

1.3.4 色價(jià)的測定

參照薛原[24]使用的方法進(jìn)行胞內(nèi)色價(jià)的測定,于505 nm處測定吸光度,并代入下列公式計(jì)算:

式中:S為樣品的色價(jià),U/g;A為稀釋液的吸光度;n為稀釋倍數(shù);G為菌絲質(zhì)量,g。

1.3.5 單因素試驗(yàn)

碳源選擇添加葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、半乳糖、木糖、甘露醇、木糖醇、果糖,氮源選擇添加蛋白胨、尿素、谷氨酸鈉、(NH4)2SO4、NaNO3、NH4NO3,無機(jī)鹽選擇添加KH2PO4、MgSO4、ZnSO4、FeSO4、MnSO4。通過單因素試驗(yàn)考察外加碳源、氮源、無機(jī)鹽對米糠發(fā)酵產(chǎn)色素的影響。

1.3.6 最陡爬坡試驗(yàn)

通過單因素試驗(yàn),確定對米糠產(chǎn)色素影響較大的碳源、氮源、無機(jī)鹽,選取合適的水平及梯度進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)。

1.3.7 響應(yīng)面分析

根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果,確定中心點(diǎn),利用Design export 12進(jìn)行中心組合設(shè)計(jì),并進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。再根據(jù)響應(yīng)面分析結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。

1.3.8 TLC法初步分離紅曲色素

參照屈炯[25]使用的方法進(jìn)行薄層色譜分離發(fā)酵所產(chǎn)紅曲色素,分離得到紅、黃、橙等色素條帶。

1.3.9 高效液相色譜法測定紅曲色素組分

參照Chen等[26]使用的梯度洗脫方法進(jìn)行紅曲色素組分的測定。

1.3.10 橘霉素的測定

參照薛原[24]使用的高效液相方法進(jìn)行橘霉素的測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值,利用Origin 9.0、SAS 9.0和Design export 12對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源對紫色紅曲霉M9產(chǎn)紅曲色素色價(jià)的影響

由圖1可知:隨著葡萄糖及半乳糖添加量的增加,色價(jià)都呈現(xiàn)下降趨勢,當(dāng)葡萄糖添加量為4.00%時(shí),色價(jià)最高可達(dá)703.90 U/g;半乳糖添加量為3.00%時(shí),色價(jià)最大,為67.90 U/g;添加蔗糖和麥芽糖時(shí),色價(jià)呈現(xiàn)波浪狀的變化趨勢,添加蔗糖的最高色價(jià)僅達(dá)83.32 U/g,而添加麥芽糖的最高色價(jià)可達(dá)555.80 U/g。上述4種碳源中,添加半乳糖和蔗糖的最高色價(jià)甚至低于純米糠發(fā)酵的色價(jià)(106.15 U/g),表明半乳糖和蔗糖對米糠發(fā)酵產(chǎn)紅曲色素沒有提升作用。添加木糖、木糖醇、甘露醇及果糖后,色價(jià)呈先上升后下降的變化趨勢,其中添加甘露醇的色價(jià)最高,可達(dá)1 138.90 U/g(5.00%);添加果糖的色價(jià)次之,可達(dá)981.30 U/g;添加木糖的色價(jià)(707.50 U/g)和木糖醇的色價(jià)(719.00 U/g)不僅趨勢相似,最高色價(jià)也接近。由此可見,以米糠為基質(zhì)添加碳源能顯著提高紅曲色素的色價(jià),其中甘露醇效果最顯著,色價(jià)是純米糠發(fā)酵的(106.15 U/g)10.73倍,其次是果糖。

2.2 氮源對紫色紅曲霉M9產(chǎn)紅曲色素色價(jià)的影響

如圖2所示,隨著氮源添加量的增加,其中添加尿素、谷氨酸鈉、蛋白胨的色價(jià)均呈現(xiàn)一直下降的趨勢。尿素的最高色價(jià)可達(dá)105.60 U/g,谷氨酸鈉的最高色價(jià)僅有95.76 U/g,蛋白胨的最高色價(jià)也只有132.64 U/g,尿素、谷氨酸鈉及蛋白胨的添加并沒有顯著提升米糠的色價(jià)。隨著硫酸銨添加量的增加,紅曲色素的色價(jià)先上升后下降再有所回升,于1.50%處達(dá)最高色價(jià)(172.64 U/g)。NaNO3和NH4NO3隨著添加量的增加,色價(jià)均先上升后下降,NaNO3和NH4NO3的最高色價(jià)分別可達(dá)154.92 U/g、252.64 U/g,添加NH4NO3的色價(jià)是純米糠色價(jià)(106.15 U/g)的2.38倍。綜上所述,所選氮源中NH4NO3對米糠發(fā)酵產(chǎn)色素的能力提升最為顯著,后續(xù)試驗(yàn)選擇NH4NO3進(jìn)一步優(yōu)化。

2.3 無機(jī)鹽對紫色紅曲霉M9產(chǎn)紅曲色素色價(jià)的影響

由圖3可知:隨著FeSO4添加量的增加,色價(jià)先下降再升高,最高色價(jià)可達(dá)229.44 U/g;MnSO4添加后色價(jià)呈起伏式變化,當(dāng)添加量為0.20%時(shí),色價(jià)達(dá)最高值(234.44 U/g);添加KH2PO4后色價(jià)整體呈上升趨勢,于0.30%處達(dá)最高色價(jià)(260.84 U/g);添加MgSO4和ZnSO4后色價(jià)呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢,MgSO4的添加量為0.20%時(shí),色價(jià)最高,為196.80 U/g,當(dāng)ZnSO4添加量為0.40%時(shí),發(fā)酵所得色素的色價(jià)(396.00 U/g)是純米糠的(106.15 U/g)3.73倍。添加ZnSO4能顯著提高米糠發(fā)酵產(chǎn)色素的能力,故選擇ZnSO4作為下一步優(yōu)化的因素之一。

2.4 最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,碳源選取甘露醇、氮源選取NH4NO3、無機(jī)鹽選取ZnSO4,并選擇合適的坡度進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn),試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。由表1可知,第2組(甘露醇添加量為5.00%、ZnSO4添加量為0.40%、NH4NO3添加量為1.00%)的色價(jià)最高(1 209.60 U/g),以這個(gè)添加量為中心點(diǎn)進(jìn)行下一步響應(yīng)面優(yōu)化。

表1 最陡爬坡試驗(yàn)

2.5 響應(yīng)面設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素及最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果,選取合適的因素(甘露醇添加量、ZnSO4添加量、NH4NO3添加量)及水平進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)。響應(yīng)面水平設(shè)計(jì)見表2,試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。利用Design-Expert 12 軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)及回歸分析,以505 nm處的色價(jià)為響應(yīng)值,建立有關(guān)色價(jià)的回歸方程如下:

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)水平與編碼

表3 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果

色價(jià)=1 243.09-30.81A-108.22B-136.96C+21.11AB+11.64AC-108.92BC-114.83A2-156.76B2-118.90C2。

表4 響應(yīng)面方差分析結(jié)果

2.6 優(yōu)化前后培養(yǎng)基與大米培養(yǎng)基對比分析

為了進(jìn)一步考察營養(yǎng)因子優(yōu)化后所產(chǎn)紅曲色素的特性,采用薄層色譜法分析了優(yōu)化前后色素的組成和種類,結(jié)果如圖4所示。由圖4可知,純米糠發(fā)酵色素經(jīng)薄層展開未得到清晰條帶,優(yōu)化后發(fā)酵的色素有兩條清晰的紅色素條帶(Rf=0.20、Rf=0.25),兩條明顯的橙色素條帶(Rf=0.69、Rf=0.76),黃色素條帶(Rf=0.88、Rf=0.93)顏色較淺。對比純米糠培養(yǎng)基、優(yōu)化后培養(yǎng)基及普通大米培養(yǎng)基(505 nm)的色價(jià),如圖4所示,純米糠發(fā)酵的色價(jià)最低,僅為106.15 U/g(505 nm);普通大米發(fā)酵后的色價(jià)最高,可達(dá)1 751.74 U/g;優(yōu)化后所得色價(jià)比優(yōu)化前顯著提升,可達(dá)1 250.83 U/g,且優(yōu)化后所得色價(jià)為普通大米培養(yǎng)基的71.41%。

HPLC色譜結(jié)果(圖5)表明,純米糠發(fā)酵色素響應(yīng)值很低,幾乎未見色素產(chǎn)生。普通大米發(fā)酵后黃色素和橙色素占比較高,紅色素含量較低。優(yōu)化后的米糠培養(yǎng)基發(fā)酵后出現(xiàn)6種色素峰,分別是2種橙色素:紅斑素(rubropunctatin)、紅曲紅素(monascorubrin),2種紅色素:紅斑胺(rubropunctamine)、紅曲紅胺(monascorubramine),2種黃色素:紅曲素(monascin)、紅曲黃素(ankaflavin),其中2種紅色素相對峰面積最大,其次是橙色素,黃色素較低,HPLC分析結(jié)果與TLC結(jié)果一致。對3種培養(yǎng)基發(fā)酵后樣品橘霉素毒素含量進(jìn)行了高效液相分析,結(jié)果如圖6所示。由圖6可知,普通大米發(fā)酵所得橘霉素最高,可達(dá)143.02 μg/g,是優(yōu)化后培養(yǎng)基發(fā)酵的(37.37 μg/g)3.82倍,是純米糠發(fā)酵的(2.42 μg/g)59.10倍。純米糠發(fā)酵所產(chǎn)橘霉素最少,優(yōu)化后培養(yǎng)基所產(chǎn)橘霉素是純米糠的15.44倍。綜上所述,優(yōu)化后發(fā)酵所產(chǎn)紅曲色素的色價(jià)及橘霉素含量均有顯著提升,但都低于大米發(fā)酵二者的水平。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以米糠為基質(zhì)液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)紅曲色素,選取多種碳源、氮源和無機(jī)鹽,考察不同營養(yǎng)因子對紅曲色素產(chǎn)量的影響,發(fā)現(xiàn)甘露醇、ZnSO4和NH4NO3顯著提高了紅曲色素的色價(jià)。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn),確定中心點(diǎn)(甘露醇添加量5.00%、ZnSO4添加量0.40%、NH4NO3添加量1.00%)。經(jīng)過響應(yīng)曲面優(yōu)化,確定以甘露醇5.10%、ZnSO40.40%、NH4NO31.00%加入米糠培養(yǎng)基,得到色價(jià)(505 nm處)最高為1 250.83 U/g,與預(yù)測值十分接近,模型擬合度較高。優(yōu)化后培養(yǎng)基發(fā)酵所得紅曲色素的色價(jià)可達(dá)大米培養(yǎng)基的71.41%,橘霉素含量則為大米的26.13%(37.37 μg/g),并通過TLC和HPLC分析色素特性,發(fā)現(xiàn)優(yōu)化后得到了6種主要紅曲色素,其中2種紅色素含量最高,其次是2種橙色素和少量黃色素。

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