王明明，關(guān)二旗，李萌萌，卞 科

河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001

具有生物活性的小分子多是疏水性的，難以被人體吸收利用，淀粉納米粒子具有良好生物相容性和負載效率，作為載體可提高小分子吸收利用率。由于天然淀粉尺寸較大，晶區(qū)致密，負載和吸附能力較差，為增加其對小分子的接觸概率和吸附能力[1]，可以通過物理(真空冷等離子體處理[2]、超聲波處理[3])或化學(xué)(酸水解[4]、乳液法[5-6])手段將天然淀粉轉(zhuǎn)化為具有較大比表面積的淀粉納米顆粒(SNPs)。

國外研究表明姜黃素(Cur)在治療新冠肺炎中可發(fā)揮潛在作用[7]。姜黃素是從姜黃中提取的一種具有代表性的強疏水多酚，以抗氧化、抗炎、抗菌和抗疲勞而聞名。但是姜黃素不溶于水，極大地限制了其應(yīng)用，而采用生物相容性材料作為載體可大幅度提高姜黃素的穩(wěn)定性和利用率。袁帥[8]通過電噴霧制備了包裹姜黃素的聚乳酸-羥基乙酸共聚物微膠囊，甘招娣[9]通過米糠清蛋白-殼聚糖自組裝了負載姜黃素。

選用支鏈淀粉含量99%以上的糯玉米淀粉(WCS)，因為每個分支由14～18個葡萄糖組成[10]。用淀粉脫支酶水解后，得到大量的短線性葡聚糖(聚合度<20)，比天然直鏈淀粉(聚合度≈1 000)更易自發(fā)形成左旋螺旋結(jié)構(gòu)，內(nèi)部生成疏水空腔[11]，為生物活性分子的封裝提供了良好的條件。比如Yoon等[12]通過將不同鏈長的直鏈淀粉與輔酶Q10結(jié)合，發(fā)現(xiàn)短直鏈淀粉可以更好地包埋疏水物質(zhì)；必需脂肪酸[13]、C10芳香分子[14]、藥物分子環(huán)丙沙星[15]都可與短直鏈淀粉復(fù)合。Zhao等[16]在超聲波和微波的協(xié)同作用下，發(fā)現(xiàn)蓮子淀粉與綠茶多酚能形成V型復(fù)合物。Gao等[17]發(fā)現(xiàn)槲皮素通過氫鍵與淀粉結(jié)合形成了結(jié)晶度較高的復(fù)合物。

作者利用超聲波技術(shù)控制納米級油包水(W/O)乳液的形成，使脫支后的短直鏈淀粉在納米乳滴中回生，通過簡單的溶劑交換，實現(xiàn)姜黃素包封。通過動態(tài)光散射、X射線衍射、傅里葉變換紅外光譜、熱重分析和電鏡分析，對淀粉納米粒子-姜黃素微膠囊進行詳細表征，并驗證了淀粉納米粒子-姜黃素在體外抗氧化的功能特性。本研究首次使用熒光檢測法定位微膠囊體系中被負載姜黃素的位置，并應(yīng)用到薄膜中作為抗氧化包裝。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

糯玉米淀粉(WCS,支鏈淀粉含量≥99%)：美國Kang Biological Products公司；面包片：市售；普魯蘭酶(≥1 000 NPUN/g)、姜黃素(純度≥95%)、2，2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基(DPPH)、分析級大豆油、Span80、異硫氰酸熒光素(FITC)：美國Sigma-Aldrich試劑公司；聚己二酸/對苯二甲酸丁二醇酯(PBAT)：德國巴斯夫公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Infinity1260凝膠滲透色譜：美國Agilent公司；5810R超速離心機：德國Eppendorf公司；FreeZone6Plus真空冷凍干燥機：美國Labconco公司；SPX550探頭式超聲波破碎儀：美國Branson Emerson公司；Quanta250掃描電子顯微鏡：美國FEI公司；HT7700透射電子顯微鏡：日本Hitachi公司；3000激光粒度儀：英國Mastersizer公司；2010-L干法激光粒度分析儀：中國耐克特公司；449C熱重分析儀：德國Netzsch公司；FV3000激光共聚焦掃描顯微鏡：日本Olympus公司；D8 Advance X射線衍射儀：德國Bruker AXS公司；Tensor II傅里葉變換紅外光譜儀：德國Bruker公司；UV-2000紫外-可見分光光度計：美國Unico公司；DS 32雙螺桿擠出機：中國賽信公司；XLB 350四柱熱壓機：上海齊才液壓機械有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 糯玉米淀粉酶法脫支

將WCS溶解于pH 5.0磷酸鹽緩沖液(3 g/100 mL)中，加熱至85 ℃。冷卻后，加入4 NPUN/g普魯蘭酶酶解(58 ℃，24 h)。隨即沸水浴，離心(5 000g，10 min)除去酶。取上清液，加入2倍體積的無水乙醇，靜置30 min，將沉淀真空凍干(-80 ℃，0.01 MPa)得到脫支淀粉(DBS)。

1.3.2 淀粉納米粒子的制備

參照Dehghan-baniani等[5-6]的方法并略有修改，把脫支淀粉用水溶解至質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%，攪拌均勻，油浴加熱(150 ℃，30 min)使脫支淀粉完全糊化(溶液澄清透明)。探頭超聲處理20 min(50%振幅)使淀粉鏈完全分散。加入體積比為2∶3的大豆油和Span80(體積分?jǐn)?shù)2%)，采用高速均質(zhì)器制備粗乳液，超聲脈沖處理30 min(振幅50%，開2 s，關(guān)1 s)，得到均勻的W/O乳狀液。將乳狀液置于4 ℃冰箱中冷藏12 h，使微水滴內(nèi)的脫支淀粉完全回生。對乳液進行3次反復(fù)凍融處理以打破穩(wěn)定的乳液狀態(tài)，破乳后油水分層，去除油相后用乙醚和水洗滌并離心(8 000g，10 min),冷凍干燥得到淀粉納米粒子(SNPs)。

1.3.3 脫支淀粉和淀粉納米粒子的分子量分布

參考Guo等[18]的方法并略有修改。1 mg樣品溶解于100 mL 90%二甲基亞砜溶液中。流動相為0.1 mol/L硝酸鈉，500 mg/L疊氮化鈉水溶液，樣品溶液搖勻，過0.22 μm濾膜后進樣分析。色譜柱：兩根PL aquagel-OH mixed(8 μm)，柱溫30 ℃，進樣50 μL，分析時間30 min。檢測器為RI檢測器和激光光散射檢測器。采用一系列相對分子質(zhì)量(420、1 010、1 970、3 860、3 930、7 920、12 140、21 030、21 230、21 300、49 860、66 200、185 000、272 400、1 046 000)的聚乙二醇(PEG)標(biāo)準(zhǔn)品在相同測試條件下得到GPC標(biāo)準(zhǔn)曲線。使用Agilent GPC/SEC軟件，利用Mark-Houwink參數(shù)[19]計算主要組分的重均分子量(Mw)和數(shù)均分子量(Mn)。因組成淀粉分子的脫水葡萄糖單元的分子量為162，則淀粉分子的聚合度(DP)=Mw/162。樣品的多分散度(PD)=Mw/Mn，PD反映分子量差別的范圍。

1.3.4 淀粉納米粒子負載姜黃素

將SNPs與水混合(2%，W/V)，超聲處理(50%振幅，5 min)，使SNPs完全分散。將Cur溶于無水乙醇(0.2%，W/V)后，將兩個溶液混合，在55 ℃下減壓蒸餾、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇。用乙醇洗去SNPs表面的Cur，離心(12 000g，10 min)后凍干，得到負載姜黃素的淀粉納米粒子(SNPs-Cur)。組裝納米膠囊原理圖(通過3Ds MAX繪制)如圖1所示。

1.3.5 掃描電鏡(SEM)和透射電鏡(TEM)

凍干的SNPs粘在導(dǎo)電膠上，表面噴金后用SEM觀察。SNPs與無水乙醇混合，形成5%的懸浮液，滴在銅網(wǎng)上，自然干燥，在TEM下觀察。

1.3.6 動態(tài)光掃描(DLS)

用水稀釋SNPs至0.1%，超聲處理5 min(振幅50%)，使SNPs完全分散。采用動態(tài)光散射法測量SNPs在液體中的粒徑分布。另用干法激光粒度分析儀直接將凍干SNPs加入吸料口中測量粒徑。

1.3.7 熱重分析(TGA)

在干燥氮氣的動態(tài)氣氛下進行，流速為20 mL/min，溫度為25～600 ℃，升溫速率為10 ℃/min。

1.3.8 激光共聚焦掃描顯微鏡(CLSM)

將凍干后的SNPs-Cur與FITC混合，滴在載玻片上。在激發(fā)光波長分別為425 nm和490 nm下觀察SNPs-Cur復(fù)合物的熒光。

1.3.9 X射線衍射(XRD)

Cu-Kα輻射源(λ=0.154 6 nm)在40 kV和40 mA下工作。樣品在3°～50°(2θ)掃描，速率為5.0°/min。

1.3.10 傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)

KBr粉末在120 ℃中干燥24 h。SNPs、Cur、WCS和SNPs-Cur分別與KBr混勻研磨壓片至質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%。累積分辨率4 cm-1，光譜范圍400～4 000 cm-1。

1.3.11 姜黃素的負載率及體外抗氧化活性測定

采用紫外-可見分光光度計測定Cur的負載率(LC)。用無水乙醇溶解姜黃素配制母液(0.12%)，分別取母液0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 mL，定容到10 mL。測定吸光度，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.051 82x-0.002 91(R2=0.998 19)。將SNPs-Cur加入無水乙醇中，高速振蕩60 min，離心(12 000g，10 min)并取上清液測定吸光度。LC=姜黃素的負載量/淀粉納米粒子的質(zhì)量。

DPPH自由基清除試驗：準(zhǔn)確稱量4 mg DPPH溶于無水乙醇中，定容到100 mL，將4 mL DPPH溶液與提取液混合均勻。在黑暗中放置30 min，在517 nm處測定溶液的吸光度。提取液分為2組：4 mL DPPH和0.5 mL無水乙醇為對照組；4 mL DPPH和0.5 mL的SNPs-Cur提取液為試驗組。

清除率=(A0-A*)/A0×100%,

式中：A0為對照組吸光度;A*為試驗組的吸光度。

1.3.12 薄膜成型工藝

添加1%的SNPs-Cur到PBAT粉料中，攪拌均勻，100 ℃烘24 h除去水分。投料到雙螺桿擠出機中，溫區(qū)設(shè)置為40、90、130 ℃，螺桿轉(zhuǎn)速為180 r/min。物料擠出后，由熱壓機壓制成厚(0.25±0.02)mm薄膜。

1.3.13 面包片的抗氧化包裝儲藏

把面包片置于3種包裝(聚乙烯膜、PBAT膜、添加1%的SNPs-Cur的PBAT膜)中對比。在RH 80%±5%、25 ℃儲藏10 d后取出，檢查面包的外觀變化。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

每個試驗做3次平行試驗。數(shù)據(jù)處理和繪圖采用SPSS 20和Origin 2018。

2 結(jié)果與討論

2.1 DBS和SNPs的分子量分布

由表1和圖2可知，DBS樣品中的主要成分是短線性葡聚糖，DP為11.64，SNPs的DP為11.90；DBS和SNPs的相對分子質(zhì)量分布均較窄，且聚合度相似，可以認為淀粉納米粒子是由單鏈短線性葡聚糖通過自發(fā)形成左旋螺旋而產(chǎn)生的。其他學(xué)者也得到相似的結(jié)論，如Lu等[20]通過不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇沉淀得到DP在6.01～34.57之間的DBS，得出DP在10～16更容易形成結(jié)晶，Li等[21]發(fā)現(xiàn)從糯玉米淀粉脫支的短鏈直鏈淀粉DP比從馬鈴薯淀粉的低，且更易老化。

表1 DBS和SNPs的分子量分布

2.2 淀粉納米粒子的微觀形貌

2.2.1 形態(tài)學(xué)分析

SEM圖像(圖3)顯示SNPs呈圓形和橢圓形，粒徑為(200±40)nm，這種形態(tài)是由于吸附作用相互黏結(jié)形成[6]，證明SNPs具有通過表面吸附作用負載藥物分子的能力。從TEM圖像(圖3中A、B、C、D)觀察到SNPs的內(nèi)部有陰影，在電子束聚焦時，SNPs暴露于200～1 000 K和真空狀態(tài)導(dǎo)致外殼收縮，顆粒尺寸變小，表明SNPs內(nèi)部不是致密無空隙，而是中空的結(jié)構(gòu)，證明SNPs通過自發(fā)形成的螺旋結(jié)構(gòu)產(chǎn)生內(nèi)部疏水區(qū)或間隙為客體小分子提供可容納的空間，中空結(jié)構(gòu)較之實心結(jié)構(gòu)而言具有更高的負載效率，SNPs有成為疏水性活性小分子的外殼或載體的巨大潛力。

2.2.2 淀粉納米粒子的粒徑分布

由圖4可知，在液體環(huán)境中，由于超聲探頭的強烈空化作用，相互黏結(jié)的SNPs均勻分散，SNPs粒徑分布約為200 nm，這與SEM的結(jié)果一致。干式激光粒度分析儀表明，樣品的粒徑主要分布范圍為950～1 350 nm，推測空氣中的SNPs聚集效應(yīng)可能是由靜電吸附引起的。

2.3 熱穩(wěn)定性分析

由圖5可知，SNPs-Cur第一個質(zhì)量損失階段位于130 ℃之前，因為加熱使水分蒸發(fā)。第二階段是在200 ℃之后，SNPs晶體結(jié)構(gòu)逐漸碳化被破壞。在200～280 ℃范圍內(nèi)，SNPs-Cur的質(zhì)量損失率較SNPs慢，因為Cur通過疏水相互作用和氫鍵被封裝在SNPs內(nèi)部，形成V型結(jié)晶結(jié)構(gòu)，SNPs外殼對Cur起到了很好的保護作用，提高了Cur的熱穩(wěn)定性[22]。由于Cur的閃點在209 ℃，隨著溫度繼續(xù)升高導(dǎo)致Cur分解。300 ℃后淀粉開始碳化，SNPs-Cur質(zhì)量逐漸趨于穩(wěn)定，與Abbas等[23]的結(jié)果一樣。

2.4 CLSM熒光檢測淀粉納米粒子負載的姜黃素

Cur本身有兩個苯環(huán)，可以發(fā)出淺綠色熒光。在圖6A、B中，淀粉處于部分團聚狀態(tài)，將光源切換到波長為425 nm的激發(fā)光后，淀粉內(nèi)部出現(xiàn)Cur特異性熒光，且熒光強度隨著SNPs聚集而增加，這表明Cur存在于SNPs內(nèi)部而非表面。為了進一步說明Cur與SNPs緊密結(jié)合，采用FITC對淀粉進行染色，在490 nm和425 nm處獲得了疊加場的照片，由圖6C可以看到，在SNPs中出現(xiàn)了Cur的熒光，這是一個有力的證據(jù)。

2.5 XRD結(jié)晶構(gòu)型分析

由圖7可知，WCS在15°、16.8°、17.9°和23°具有衍射峰，其晶體構(gòu)型為典型的A型，與Wang等[24]的結(jié)果一致。SNPs衍射峰在16.8°、20°、21.7°和23.8°，為B+V型結(jié)晶。SNPs-Cur在13°、15°、16.8°、19.7°和22.4°有衍射峰，是V型結(jié)晶，與Kong等[25]結(jié)論一致，表明形成了淀粉脂質(zhì)復(fù)合物。Cur在天然狀態(tài)下有多個衍射峰，具有高度結(jié)晶結(jié)構(gòu)，當(dāng)Cur被SNPs包含進去后，在復(fù)合物的X射線衍射圖中未看到Cur的特征峰，說明Cur以無定形的形式存在于SNPs內(nèi)部，無定形狀態(tài)有利于人體吸收和利用。

2.6 淀粉納米粒子與姜黃素的結(jié)合方式

2.7 姜黃素的負載率和DPPH自由基清除能力

SNPs-Cur提取液的吸光度是0.432，代入到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程得到母液8.49 mL對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，姜黃素的負載率為75.5 mg/g(P<0.05)。僅使用姜黃素質(zhì)量濃度為0.5 g/300 mL的乙醇溶液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法制備的SNPs-Cur的DPPH自由基清除率為59.3%(P<0.05)，與100 μmol/L 的白藜蘆醇的DPPH自由基清除率相當(dāng)[30]。

2.8 面包抗氧化包裝儲藏試驗

為避免誤差和環(huán)境干擾等偶然性因素的影響，在面包儲藏過程中每個樣品設(shè)置2組平行試驗，結(jié)果如圖9所示。經(jīng)過10 d的貯藏后，聚乙烯包裝(a、b)中的面包片出現(xiàn)輕微程度發(fā)霉，這和聚乙烯薄膜有較好的阻隔性能有關(guān)，環(huán)境水分無法通過薄膜遷移。與PBAT薄膜(c、d)和添加SNPs-Cur的PBAT薄膜(e、f)對比，e、f組的面包片的褐變和霉菌的生長受到明顯抑制，抑制了孢子的形成，并減少了菌絲的生長。結(jié)果表明添加SNPs-Cur的PBAT薄膜具有抗氧化及延緩霉變的能力，可應(yīng)用于鮮濕面制品或水果等的包裝，有效延長食品貨架期。

3 結(jié)論

通過控制W/O乳液法制備的SNPs可通過包埋作用提高Cur的穩(wěn)定性和生物利用率。該方法制備的SNPs對疏水物質(zhì)具有良好的吸附性能。通過簡單的溶劑交換獲得負載Cur的SNPs，在SNPs-Cur中，短直鏈淀粉自發(fā)形成左旋螺旋結(jié)構(gòu)和疏水空腔，Cur通過疏水相互作用和氫鍵復(fù)合在SNPs內(nèi)部，呈V形結(jié)晶，且熱穩(wěn)定性良好。本研究使用熒光定位法檢測到被負載的客體小分子的位置，結(jié)果表明短直鏈淀粉是疏水性生物活性分子的良好載體，對被包埋物質(zhì)具有很強的保護和負載能力，同時，淀粉本身是一種無毒無害的物質(zhì)，具有良好的生物親和力。本研究的方法為合理設(shè)計未來的口服給藥系統(tǒng)提供了參考，該系統(tǒng)可以克服生理障礙，為細胞提供更好的穩(wěn)定性和特異性。且SNPs-Cur添加到包裝材料中通過簡單的面包包裝貯藏試驗證明可長效緩釋姜黃素的抗氧化能力，延長食品貨架期。