陶曼芝, 吳 席, 朱香豫, 王婷婷, 賈亞峰, 曹樹青

(合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,安徽 合肥 230601)

鐵(Fe)是植物體內(nèi)重要酶反應(yīng)中不可或缺的催化成分,是DNA合成、呼吸和光合作用等基本過程所必需的[1-2]。雖然土壤中的鐵含量豐富,但在大部分土壤中多以氧化鐵的形式存在,氧化鐵在氧氣充足的環(huán)境中溶解度差,使土壤中可被植物直接利用的鐵離子含量大大低于植物的需求[3]。植物缺鐵會(huì)導(dǎo)致缺鐵性黃化病,影響發(fā)育,同時(shí)可食用的植物也是人類的主要飲食來源,植物缺鐵也會(huì)損害人類的健康[4]。據(jù)世界衛(wèi)生組織稱,全世界約有20億人患有缺鐵性貧血,同時(shí)缺鐵也會(huì)導(dǎo)致兒童出現(xiàn)出生缺陷、運(yùn)動(dòng)發(fā)育遲緩和身體素質(zhì)普遍下降等疾病[5]。因此,了解植物攝取鐵和調(diào)節(jié)鐵穩(wěn)態(tài)的分子機(jī)制至關(guān)重要。

WRKY家族在擬南芥中有72個(gè)成員,在一系列植物生物學(xué)過程中,WRKY轉(zhuǎn)錄因子起著重要作用,包括衰老、種子發(fā)育、種子休眠和萌發(fā)、生物和非生物脅迫等以及與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。經(jīng)過前期研究發(fā)現(xiàn),WRKY12參與了植物調(diào)節(jié)鐵穩(wěn)態(tài)的過程,WRKY12功能缺失突變體對(duì)缺鐵環(huán)境表現(xiàn)出明顯的耐受性,但WRKY12基因參與植物鐵穩(wěn)態(tài)調(diào)控的機(jī)制并不清楚。為了進(jìn)一步探究WRKY12基因的表達(dá)模式及其在缺鐵脅迫下表達(dá)變化,本文擬通過構(gòu)建WRKY12-GUS的轉(zhuǎn)基因植株,并利用GUS染色進(jìn)行WRKY12基因的表達(dá)分析,為闡明WRKY12在缺鐵條件下的作用機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與主要試劑

植物材料是哥倫比亞(Columbia,col) 遺傳背景的野生型擬南芥(Arabidopsisthaliana),從美國(guó)擬南芥種質(zhì)資源中心獲得,由合肥工業(yè)大學(xué)植物分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室繁殖所得。載體構(gòu)建所用質(zhì)粒pART27-GUS,大腸桿菌 DH5α,農(nóng)桿菌GV3101。

Plasmid miniprep Kit (TIANGEN DP103-02),T4-DNA Ligase(NEB #M0202S),限制性內(nèi)切酶KpnⅠ(NEB #R3142V),XhoⅠ(NEB #R0146V),2×San Taq 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)(Sangon Biotech B639295-0080),PrimeSTAR HS DNA Polymerase (TaKaRa #R045),異丙醇(67-63-0),SDS(151-21-3),Tris-HCl(1185-53-1),無水乙醇(64-17-5),GT0391-50GUS染色試劑盒(華越洋)等。

1.2 方法

1.2.1 擬南芥無菌苗的培養(yǎng)

配制 MS 固體培養(yǎng)基。稱取蔗糖、瓊脂和 MS,待溶解后調(diào)節(jié)其pH值至 5.8,封膜后用高壓滅菌鍋在121 ℃、101 kPa的條件下高壓蒸汽滅菌20 min,滅菌后得到無菌固體培養(yǎng)基。用0.1%氯化汞對(duì)種子殺菌消毒后,將種子均勻點(diǎn)在培養(yǎng)基上。4 ℃ 冰箱中春化2 d,在22 ℃、16 h光照時(shí)長(zhǎng)的培養(yǎng)箱中豎直培養(yǎng)14 d。

1.2.2 擬南芥DNA的提取

取出培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的擬南芥,置于預(yù)冷的研缽中,加入液氮研磨至粉碎后,加入400 μL SDS DNA提取液繼續(xù)研磨,待充分研磨后收集至離心管中,12 000 r/min、4 ℃離心10 min后,取200 μL上清液于另一干凈離心管中,加入200 μL異丙醇,12 000 r/min離心10 min,之后棄去管中的上清液,加入800 μL體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇,12 000 r/min離心5 min。之后棄上清,將沉淀置于通風(fēng)櫥15 min,吹干沉淀后,加入30 μL的無菌雙蒸水,冷凍保存。

1.2.3WRKY12啟動(dòng)區(qū)基因片段的克隆

利用Oligo 7.0軟件設(shè)計(jì)以下引物進(jìn)行WRKY12啟動(dòng)區(qū)基因片段的克隆。上游引物:ProWRKY12N-F:3’-CGGGGTACCAAAGAAA ACGAAAGGAGAATGAAGG-5’,下游引物:ProWRKY12N-R:5’-CCGCTCGAGTGTTTTT AATCTCAATCTCTCCTTGTTC-3’,以提取出的野生型擬南芥DNA 為擴(kuò)增模板進(jìn)行啟動(dòng)子克隆。

1.2.4 大腸桿菌的轉(zhuǎn)化

取出于-80 ℃ 冰箱中存儲(chǔ)的大腸桿菌 DH5α感受態(tài)細(xì)胞,放置于冰上自然溶解。吸取 5 μL連接產(chǎn)物加入感受態(tài)細(xì)胞中,輕輕吹打混勻,冰上放置30 min,在42 ℃ 金屬浴中熱激60 s,再放置于冰上靜置 2 min。在熱激后的感受態(tài)中加入無抗性的600 μL LB 液體培養(yǎng)基,放在 37 ℃ 恒溫?fù)u床中低速振蕩培養(yǎng) 1.5 h。待培養(yǎng)完成后,涂布于添加了壯觀霉素的LB固體培養(yǎng)基上。平板倒置在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。次日挑取培養(yǎng)基上的單菌落,接種于添加了壯觀霉素的LB液體培養(yǎng)基中,振蕩培養(yǎng)6 h后進(jìn)行PCR鑒定,選取陽性克隆進(jìn)行測(cè)序,并對(duì)結(jié)果分析比對(duì)正確后得到具有重組質(zhì)粒的大腸桿菌菌株。

1.2.5 農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化

取出存儲(chǔ)于-80 ℃冰箱中的農(nóng)桿菌 GV3101 感受態(tài)細(xì)胞,置于冰上解凍。取2 μL重組質(zhì)粒加入到感受態(tài)細(xì)胞中,混勻、吸取至已預(yù)冷的1 cm電擊杯中,電擊后迅速加入 600 μL 無抗性的LB液體培養(yǎng)基,28 ℃ 搖床培養(yǎng)2.5 h,涂布于同時(shí)添加有壯觀霉素和慶大霉素的固體LB培養(yǎng)基上,28 ℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 2 d。培養(yǎng)皿上挑取單菌落接種于添加有壯觀霉素和慶大霉素的液體培養(yǎng)基中,28 ℃ 搖床培養(yǎng)渾濁,然后進(jìn)行PCR鑒定。

1.2.6 轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得

將陽性農(nóng)桿菌接種于添加有壯觀霉素和慶大霉素的液體培養(yǎng)基中,振蕩培養(yǎng)至OD600為1.2～1.4,離心去上清,用侵染緩沖液重懸至溶液OD600為0.8～1.2,最后加入一定量的 SilwettL-77 混勻,侵染花序,黑暗處理 12 h。隔8 d再次侵染。

1.2.7 轉(zhuǎn)基因陽性植株的鑒定

將獲得的擬南芥種子置于含有卡那霉素的 MS 固體培養(yǎng)基中進(jìn)行抗性篩選,培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d,將具有根且子葉顏色嫩綠的幼苗移栽至土質(zhì)培養(yǎng)基中,提取 DNA,經(jīng)PCR鑒定正確后,即獲得轉(zhuǎn)基因陽性植株。

1.2.8 GUS染色

取葉片、花瓣、根莖等組織,于1.5 mL離心管中,加入配置好的GUS染色工作液至完全覆蓋材料,用錫箔紙包裹并置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育8 h后,用70%乙醇脫去樣本的葉綠素,至陰性對(duì)照呈白色,GUS染色陽性的藍(lán)色斑點(diǎn)穩(wěn)定,即可置于70%乙醇中保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 擬南芥WRKY12啟動(dòng)子區(qū)的克隆

為了確定WRKY12基因在擬南芥響應(yīng)缺鐵脅迫中的作用,構(gòu)建WRKY12-GUS載體。以擬南芥野生型DNA作為模板,采用PCR技術(shù)擴(kuò)增片段,得到WRKY12的啟動(dòng)子片段,如圖1所示。圖1中，M代表Marker。

圖1 WRKY12啟動(dòng)子區(qū)的克隆

2.2 目的片段和質(zhì)粒雙酶切

使用KpnⅠ和XhoⅠ2種限制性內(nèi)切酶對(duì)WRKY12啟動(dòng)子片段以及pART27-GUS質(zhì)粒進(jìn)行酶切,得到具有相同黏性末端的片段和質(zhì)粒,如圖2所示。圖2中，M代表Marker。

圖2 WRKY12和pART27-GUS雙酶切酶

2.3 重組質(zhì)粒及大腸桿菌轉(zhuǎn)化后陽性克隆鑒定

采用T4連接酶在16 ℃、12 h的條件下將片段連接質(zhì)粒上,得到重組質(zhì)粒。之后采用熱激轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到DH5α大腸桿菌感受態(tài)中,37 ℃培養(yǎng)過夜,挑取單克隆進(jìn)行PCR鑒定,結(jié)果如圖3所示。

圖3中，M代表Marker;1～8分別代表轉(zhuǎn)化后大腸肝菌單菌落。由圖3可知,測(cè)序后選取4號(hào)陽性菌保存。

圖3 大腸桿菌的鑒定

2.4 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化及花序浸染分析

將重組質(zhì)粒采用電擊轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入GV3101農(nóng)桿菌感受態(tài)中,對(duì)其進(jìn)行鑒定,結(jié)果如圖4所示,圖4中，M代表Marker；1～7分別代表轉(zhuǎn)化后農(nóng)肝菌單菌落。

從圖4可以看出,選取6號(hào)菌進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),采用浸花法侵染擬南芥野生型植株,反復(fù)侵染3遍得到侵染后的種子。

圖4 農(nóng)桿菌鑒定

2.5 WRKY12-GUS轉(zhuǎn)基因植株的抗性篩選

將得到的侵染后的種子撒在添加有卡那霉素的1/2MS培養(yǎng)基中,篩選得到陽性植株,如圖5所示。

圖5 陽性植株的篩選

2.6 ProWRKY12轉(zhuǎn)基因陽性植株的鑒定

提取陽性植株中的DNA進(jìn)行鑒定,結(jié)果如圖6所示,圖6中，M代表Marker；1～4分別代表各轉(zhuǎn)基因重組植株。由圖6可知,選擇6號(hào)植株作為陽性ProWRKY12植株,并進(jìn)一步通過抗性分離純合所得到的陽性植株。

圖6 轉(zhuǎn)基因植株的PCR鑒定

2.7 純合體的篩選

每一代植株都采用抗性分離比篩選得到陽性植株后土培繁殖,在第3代得到了純合的ProWRKY12植株,如圖7所示。

圖7 轉(zhuǎn)基因植株的抗性分離比

2.8 GUS染色結(jié)果分析

取ProWRKY12植株的蓮座葉、花序和果莢進(jìn)行染色,如圖8所示,由圖8可知,在花序中WRKY12基因的表達(dá)量高于在蓮座葉和果莢中的表達(dá)量,具體WRKY12的表達(dá)情況還有待進(jìn)一步確定。

圖8 ProWRKY12陽性植株的部分組織染色圖

3 結(jié) 論

全球大約1/3的可耕種土壤存在潛在的鐵缺乏[6]。土壤缺鐵會(huì)導(dǎo)致作物發(fā)育不良,進(jìn)而導(dǎo)致人類鐵缺乏病[7-8],因此解決因土壤缺鐵導(dǎo)致的植物缺鐵問題至關(guān)重要[9]。

本研究所用種子為自擬南芥種子資源中心獲得WRKY12基因功能缺失型突變體,前期研究結(jié)果顯示W(wǎng)RKY12基因參與了植物對(duì)缺鐵脅迫的響應(yīng),因此通過基因工程技術(shù)構(gòu)建ProWRKY12重組載體,將其轉(zhuǎn)入野生型擬南芥中,從而獲得轉(zhuǎn)基因植株。這為研究WRKY12基因在植物中的表達(dá)模式和缺鐵脅迫調(diào)節(jié)機(jī)制中的作用提供了依據(jù),是一個(gè)非常關(guān)鍵的課題。

通過GUS染色分析發(fā)現(xiàn)WRKY12在擬南芥的蓮座葉、花序和果莢中均有表達(dá),但具體在受到缺鐵脅迫后的表達(dá)變化機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。