溫霓婷 周 杉 楊曉穎 楊麗琦 雷 霆

（四川農業(yè)大學，四川 成都 611130）

0 引言

岷江藍雪花（Stapf）為白花丹科（Plumbaginaceae）藍雪花屬（Bunge）藥用觀賞植物，花為少見藍紫色，花期長（5—10月，部分地區(qū)為4—11月），生命力旺盛，適應性強，耐病蟲害、耐寒，開發(fā)利用前景廣闊。其藥用和康養(yǎng)價值不可小覷。岷江藍雪花作為一種藥用植物，有治療風濕病、跌打損傷、月經不調、氣管炎和一定的鎮(zhèn)痛抗炎等作用；現代藥理學證明，從其根部提取的白花丹醌等具有鎮(zhèn)痛消炎、抗癌、抑菌等功效。目前，除個別科研院所將其作為種質資源收集栽培外，該植物在我國幾乎處于野生狀態(tài)，因此，開展岷江藍雪花新材料研究，對其商業(yè)化開發(fā)具有重要的意義。

甲基磺酸乙酯（Ethyl Methane Sulfonate，EMS）是一種應用廣泛的化學誘變劑，可改變DNA的某些結構，用其進行誘變育種具有簡便易行、多效性、誘變范圍廣及突變頻率高等優(yōu)點。在作物育種研究中，EMS發(fā)揮了十分重要的作用，現已應用于植物、動物、真菌新材料研究領域，如應用于藍花丹、小麥、水稻、沙棗、油莎豆、花生、蕓豆和白樺等植物新種質研究，同時在草魚、啤酒酵母菌、煙酰胺生產菌等動物和微生物誘變上也有一定的應用。誘變后的植物在根長、株高、花色、葉形等方面發(fā)生了突變，出現根長縮短、植株矮化、花色變淺、葉片狹長等現象；菌類和動物誘變后出現發(fā)酵特性變好、酶活性提高現象；草魚吻端組織細胞誘變后具有分裂增殖能力。

該項目以岷江藍雪花種子為試驗材料，以EMS為化學試劑，通過設置誘變劑不同濃度與處理時間，探索適于岷江藍雪花的EMS誘變劑量，進一步研究岷江藍雪花新種質，以獲得新材料，豐富園林花卉資源。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為2020年采集于四川農業(yè)大學現代農業(yè)研發(fā)基地（成都市崇州市隆興鎮(zhèn)）的岷江藍雪花種子。母株均為2年生實生苗，在盛花期6—10月人工隨機異株授粉，12月底采收種子，清除雜物后將種子放入干燥器保存，次年6月用于此次研究。甲基磺酸乙酯（EMS）購于北京博奧拓達公司，用75%乙醇溶解EMS（體積比1∶1）后，加入pH值為7.2～7.4的 0.01 mol/L磷酸緩沖液（PBS）定容，配制成2%EMS母液，再按比例稀釋配制質量分數為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%的EMS溶液備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子處理。種子經75%酒精滅菌0.5 min，用0.1%升汞滅菌8 min，用去離子水（RO水）沖洗后浸泡24 h，挑選吸脹飽滿、完整的種子用于后續(xù)試驗。采用完全隨機試驗設計，將預處理好的種子放入質量分數為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%的EMS溶液中，RO水處理設為CK，pH值為7.2～7.4的0.01 mol/LPBS（含乙醇）處理組設為CK，恒溫培養(yǎng)1 、3 、5 、7 h，共24個處理組合，每組60粒種子。處理完成后，用5%硫代硫酸鈉解毒30 min，再以流水沖洗2 h。將沖洗后的種子均勻地鋪在墊有兩層濾紙的培養(yǎng)皿中，放入20～25 ℃培養(yǎng)箱中待種子發(fā)芽。將發(fā)芽種子移栽于泥炭土和珍珠巖配比為3∶1的穴盤中，置于20～25 ℃、光照 140 μmol/(m·s)、濕度80%培養(yǎng)箱中。待長出真葉后移栽至15 cm雙色盆中，并放入苗圃統一管理。

1.2.2 種子發(fā)芽率與幼苗形態(tài)測定。

岷江藍雪花種子播后90 d，用游標卡尺測量幼苗株高、冠幅，株高每株測定3次，冠幅分東西測量和南北測量，每個方向各3次。

2 結果與分析

2.1 EMS劑量效應方差分析

由表1、2、3可知，EMS濃度、浸種時間對各處理種子萌發(fā)率、株高及冠幅的影響是極顯著的，致死和不同程度植株小型化是由EMS的劑量變化造成的。濃度與浸種時間存在顯著的交互作用，可以進一步進行處理組之間的多重比較。

表1 萌發(fā)率方差分析表

表2 株高方差分析表

表3 冠幅方差分析表

2.2 EMS處理對岷江藍雪花種子發(fā)芽率的影響

由圖1可知，與對照（CK、CK）相比，EMS抑制了種子萌發(fā)。處理時間7 h，EMS濃度為1.0%，發(fā)芽率約89.00%；濃度增加至1.5%，發(fā)芽率急劇下降至33.33%，濃度繼續(xù)增加至2.0%，發(fā)芽率繼續(xù)減少約5.00%，兩濃度之間無顯著差異。處理時間為 5 h，1.5%濃度發(fā)芽率較1.0%顯著下降，2.0%濃度時發(fā)芽率急劇降低至34.00%，此濃度下處理5 h與 7 h之間差異不顯著。CK是RO水浸種，平均發(fā)芽率為92.76%，CK是EMS溶液的溶劑浸種，發(fā)芽率為93.96%，二者幾乎沒有差異。同時可以發(fā)現，CK組內岷江藍雪花種子發(fā)芽率變化與處理時間沒有規(guī)律，表明磷酸緩沖液作為溶劑對種子萌發(fā)有干擾，但對于岷江藍雪花種子發(fā)芽率下降沒有作用，各EMS處理組中種子萌發(fā)率下降主要是溶質EMS產生的效應。

圖1 不同濃度EMS與浸種時間處理對岷江藍雪花種子發(fā)芽率的影響

2.3 EMS處理對幼苗株高的影響

由圖2可知，與對照CK平均株高231.67 mm相比，經EMS處理的幼苗明顯矮化；但CK的株高小于低劑量EMS處理的植株。隨著EMS劑量（濃度與時間）增加，植株矮化越發(fā)明顯。相同的處理時間下，EMS濃度越高，植株平均高度越低。2.0%濃度處理超過1 h，1.5%濃度處理超過3 h，種子雖然能萌發(fā)，但后期逐漸死亡，無法成苗。與CK相比，2.0%EMS處理1 h植株平均高度下降超過30%，0.5%和1.0%濃度處理7 h平均株高下降約50%，1.5%濃度處理3 h平均株高下降至（81.40± 8.47） mm，僅為CK株高的35%，這些差異均具有統計學意義（＜0.05）。

圖2 不同濃度EMS與浸種時間處理下岷江藍雪花株高

2.4 EMS處理對幼苗冠幅的影響

由圖3可知，與對照CK平均冠幅149.70 mm相比，EMS處理的幼苗冠幅縮小10%～60%；CK的冠幅小于CK及低劑量EMS處理的植株。EMS劑量（濃度與時間）增加，冠幅縮減；2.0%濃度處理超過1 h，1.5%濃度處理超過3 h，種子雖然能萌發(fā)，但后期逐漸死亡，無法成苗。與CK相比，2.0%EMS處理1 h植株平均冠幅下降32%，0.5%和1.0%濃度處理7 h平均冠幅下降約45%，1.5%處理3 h的平均冠幅最小，僅為CK冠幅的42%，均達到了統計學意義顯著差異（＜0.05）。

圖3 不同濃度EMS與浸種時間處理下岷江藍雪花冠幅

3 結論與討論

研究設置不同EMS濃度與處理時間，對岷江藍雪花種子進行化學誘變處理。學界通常認為，半致死劑量可以取得存活率與誘變率的平衡。此次研究以發(fā)芽率作為判斷半致死劑量的指標，1.5%EMS處理大于 5 h小于7 h、2.0%EMS處理超過3 h小于5 h，可能是半致死劑量，但需要進一步設計更細致的試驗予以證明。EMS處理通常會引起供試材料小型化，在外觀上表現為株高變矮、冠幅變小、根系縮短等，這為突變體的初步篩選、減少鑒定工作量提供了便利，便于早期挑選潛在的變異植株。在此次研究中，EMS處理后植株高度和冠幅下降最大幅度達到65%和55%，2.0%EMS處理1 h、0.5%和1.0%濃度處理7 h以及1.5%濃度處理3 h，與半致死劑量基本重合，由此獲得的植株小型化最為顯著，是進一步篩選發(fā)現突變體的重點群體。半致死劑量可能是岷江藍雪花種子的最佳誘變條件，為岷江藍雪花進一步構建突變體庫奠定了基礎。

雖然研究觀察到了M代植株顯著的形態(tài)變化，但是否為可遺傳的穩(wěn)定變異尚未可知，需要通過自交獲得穩(wěn)定的遺傳群體，其中M代為關鍵選育期，但岷江藍雪花具有自交不親和特性，自交結實率較低，為后代的鑒定帶來巨大的障礙。因此，可以將M代進行組織培養(yǎng)，繼代3～5代后，對仍表現出小型化的植株通過分子標記或全基因組重測序。將誘變育種與組織培養(yǎng)技術相結合，既克服了岷江藍雪花自交不親和的障礙，也解決了木本植物獲得穩(wěn)定遺傳時間較草本植物更長的難題。