回虹燕 劉 陽，2 劉 博 張 昊，3

（1.延安大學生命科學學院，陜西 延安 716000；2.商洛市農業(yè)科學研究所，陜西 商洛 726000；3.延安市技術轉移中心，陜西 延安 716000）

0 引言

玉米又稱苞米、苞谷，是全世界范圍內種植廣泛的農作物之一，迄今已有5 000 a栽培歷史。玉米在我國糧食、工業(yè)及藥用等方面有重要的應用價值。因此，玉米產量及品質對我國國民經濟發(fā)展影響重大。

陜北地區(qū)地處黃土高原，平均海拔1 200 m，屬中溫帶干旱大陸性季風氣候，特點是日照充足且四季分明。近年來，陜北地區(qū)主要推廣的玉米品種有登海9號、陜單609等，產量高、抗寒性好、穗大。玉米生長過程中的主要病害有大斑病、粗縮病、褐斑病等，這些病害蔓延速度較快，若防控不及時，將會嚴重影響玉米產量。玉米病害防治過程中會用到大量的化學藥劑，極易造成農藥殘留，對土壤和環(huán)境造成污染。植物內生細菌在植物體內與其共同經歷了長期的生物進化，形成了一種穩(wěn)定的、互利的關系：內生菌株在植物體內生長繁殖，同時為植物生長提供諸多有益代謝產物?？捎行Х乐沃参锊『Φ膬壬毦?，被稱為生防菌；植物利用生防菌可以很好地抵御病害，從而避免或減少化學藥劑的使用。

目前，研究人員在植物中發(fā)現的內生細菌多達120種。已發(fā)現的內生細菌主要為假單胞菌屬（）、芽孢桿菌屬（）、克雷伯氏菌屬（）、腸桿菌屬（）、泛菌屬（）及甲基桿菌屬（）細菌等。玉米的內生細菌種類繁多，且在玉米的種子、根、莖、葉中均有發(fā)現。在玉米根系中發(fā)現的內生細菌主要有芽孢桿菌屬（）、土壤桿菌屬（）、擬諾卡菌屬（）、乳球菌屬（）和貪噬菌屬（）細菌等。從玉米莖、葉中分離得到的內生細菌有泛菌屬（）、短小桿菌屬（）、黃桿菌屬（）、和節(jié)桿菌屬（）細菌等。

植物內生細菌是植物內部的重要組成部分，不僅包括與植物存在互惠關系的共生菌株，同時包括與植物相互作用、相互影響的內生細菌。玉米的內生細菌具有包括促生長、固氮、增強植物抗逆性等多種不同的生物學功能，掌握其作用機制，有利于更好地開發(fā)利用有益內生細菌。

1 材料與方法

1.1 玉米內生細菌的收集

在田間采集不同品種的新鮮玉米，取玉米種子作為材料，進行內生細菌的分離。其中，玉米品種有中榆1號、中榆9號、陜單662、西農2580、殼盛501、陜單652及延科9號。先從經過表面消毒的新鮮玉米種子中篩選內生細菌，然后用LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株，再挑取形狀、大小、顏色有差異的單菌落進行培養(yǎng)，分離純化菌株。

1.2 玉米內生菌DNA提取

先將分離出的內生細菌菌株分別接種于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃條件下，160 r/min振蕩培養(yǎng) 36 h后12 000 r/min離心收集菌體，使用DNA試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）提取各菌株DNA。然后，配制1%瓊脂糖凝膠，在110 V電壓下電泳35 min，使用凝膠成像分析系統檢測DNA。

1.3 細菌16SrDNA PCR序列擴增

使用細菌16SrDNA基因的通用引物對細菌內生細菌的16SrDNA進行擴增。將上述提取的內生菌株DNA作為模板進行PCR擴增反應。采用25 μL PCR擴增體系：DNA模板2 μL，引物27f 1 μL，引物1492r1 μL，2×Power Taq PCR Master Mix 12.5 μL，ddHO補足至25 μL。PCR反應程序：94 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸 1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存產物。PCR擴增產物用1% Agar凝膠電泳檢測。將PCR擴增后的產物送至西北大學太白校區(qū)國家微生物檢測中心進行測序工作，將測序結果與Genbank中的已知序列進行比對。

1.4 內生菌系統發(fā)育樹分析

將上述測序結果和比對結果整理在一起，利用MEGA7.0軟 件，以NJ法 構 建 系 統 發(fā) 育 樹，bootstrap設定值為1 000，對各菌株進行系統的進化關系分析。

2 結果與分析

2.1 玉米內生細菌的多樣性

通過分離純化培養(yǎng)，共篩選出玉米內生細菌10株，菌株提取的DNA凝膠電泳和PCR擴增產物的凝膠電泳檢測結果顯示，10株菌株的DNA條帶清晰可見且均一明亮，且主要集中在1 500 bp左右，與預期吻合。將測序結果比對后發(fā)現，10株內生菌分別為唐菖蒲伯克霍爾德氏菌（）、芽孢桿菌（sp.）、植生拉烏爾菌（）、克雷伯氏菌（sp.）、變棲克雷伯氏菌（）、水生拉恩氏菌（）、肺炎克雷伯菌（）、蔬菜芽孢桿菌（）、成團泛菌（）和耶爾森菌（sp.），共7屬10種。

2.2 玉米內生細菌的系統發(fā)育樹分析

結合細菌形態(tài)特征及16SrDNA基因序列比對，10株玉米內生細菌分布于7屬，多樣性豐富。其中，克雷伯氏（）為優(yōu)勢屬，3株菌株屬于該屬，2株菌株屬芽孢桿菌屬（sp.）（見圖1）。

3 結論與討論

目前，相關學者對玉米內生細菌的研究較多且較深入，如劉娟對鮮食玉米內生細菌的分離鑒定及功能進行了研究等，高增貴等對玉米紋枯病拮抗內生細菌的篩選進行了研究，但對玉米種子內生細菌的具體研究報道較少。玉米種子是玉米種植業(yè)經濟效益的重要來源。因此，筆者以陜北地區(qū)玉米種子為研究材料，分離培養(yǎng)其中的內細生細菌，以期推動對玉米種子內生菌多樣性的研究。

圖1 玉米種子內生細菌的系統發(fā)育樹

筆者采用組織表面消毒法對玉米種子進行預處理，然后分離、培養(yǎng)玉米種子內的內生細菌，并提取菌株DNA，利用細菌16SrRNA引物進行PCR擴增，最后對PCR擴增得到的序列進行測序。根據測序結果，對得到的10株內生細菌進行系統發(fā)育樹分析。結果發(fā)現，10株菌株分屬于7個菌屬。Eb03代表的克隆序列與水生拉恩氏菌（）聚為一類，同源性最高。孫孝文等的研究表明，水生拉恩氏菌可以高效解磷，對植物真菌性病害能夠起到防治作用。這是一種兼性細菌，既可在土壤等環(huán)境中生存，也可作為內生菌生存在植物體內。

分離篩選陜北地區(qū)玉米植株的內生細菌，可以獲得具有研究和應用價值的內生細菌資源，加深對陜北地區(qū)玉米內生細菌生態(tài)學特征的了解，明確陜北地區(qū)玉米與其內生細菌多樣性關系，因此，具有不可忽視的科學價值。同時，在陜北地區(qū)玉米育種過程中合理利用內生細菌，將積極推動當地的玉米生產。