何金嬌，毛雪飛，孫國鵬，馬萌萌，張 靈，吳云舟

(1.新鄉(xiāng)學(xué)院 生命科學(xué)與基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng)453003；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150030)

大腸桿菌()是獸醫(yī)臨床上最常見的導(dǎo)致動(dòng)物細(xì)菌感染的病原菌之一，亦是人及動(dòng)物的腸道共生菌，其發(fā)病率和死亡率位于仔豬之首。隨著我國養(yǎng)豬的規(guī)?；l(fā)展，大腸桿菌病逐漸由條件性疾病演變?yōu)槌０l(fā)性疾病，嚴(yán)重阻礙了養(yǎng)豬業(yè)的快速發(fā)展。在疾病的防治過程中，抗生素的大量使用導(dǎo)致了菌株耐藥性的產(chǎn)生，目前出現(xiàn)了一種細(xì)菌耐多種藥物的情況，而且大腸桿菌的耐藥性也越來越嚴(yán)重。大腸桿菌耐藥性機(jī)制的產(chǎn)生以及如何減少細(xì)菌耐藥性，已經(jīng)成為人們?cè)絹碓疥P(guān)心的問題。目前，國內(nèi)外對(duì)細(xì)菌耐藥性的研究不僅僅停留在表型上，已經(jīng)開始對(duì)耐藥基因進(jìn)行分子水平的研究。從分子層面研究細(xì)菌耐藥性，能夠更深入的揭示細(xì)菌的耐藥機(jī)制和傳播途徑，更好的控制耐藥菌株的產(chǎn)生和傳播，為臨床獸醫(yī)用藥和新藥的研發(fā)提供科學(xué)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。本研究對(duì)河南省新鄉(xiāng)市某規(guī)?；i場(chǎng)進(jìn)行大腸桿菌的分離鑒定、耐藥性分析和耐藥基因檢測(cè)等初步研究，為深入研究耐藥性及其機(jī)制、指導(dǎo)臨床合理用藥和防治豬源大腸桿菌病提供了一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品

2018年9～12月份從河南省新鄉(xiāng)市某規(guī)?；i場(chǎng)采集腹瀉豬的肛門棉拭子。大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC 25922)購自中國獸藥監(jiān)察所。

1.2 主要試劑及引物

氨芐西林、萬古霉素、復(fù)方新諾明、氯霉素、四環(huán)素、慶大霉素和左氧氟沙星等藥敏紙片，伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂培養(yǎng)基均購自杭州微生物試劑有限公司；細(xì)菌DNA提取試劑盒和革蘭氏染色試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司；DL2000 DNA marker、Taq DNA聚合酶等，購自TaKaRa公司。

以GeneBank中查找的相關(guān)序列為模板，通過primer 5.0軟件設(shè)計(jì)大腸桿菌16S rRNA，查找文獻(xiàn)獲得磺胺類1、喹諾酮類(6') --、-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類、氨基糖苷類(3')-Ⅱ、多肽類-1、氯毒素基因的引物，送至上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行合成。序列如表1所示。

1.3 細(xì)菌的分離純化

將無菌條件下采集的肛門拭子接種于營養(yǎng)肉湯中，37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)24 h后，涂布于伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基，置37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，挑取紫黑色并帶有金屬光澤的單個(gè)菌落，通過平板劃線法將其再次接種于伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基中進(jìn)行純化。從中挑取紫黑色并帶有金屬光澤的單菌落，然后通過平板劃線法接種于麥康凱培養(yǎng)基，觀察是否全是粉紅色菌落。從中挑取特征明顯的菌落劃線于麥康凱培養(yǎng)基進(jìn)行再次純化，經(jīng)革蘭氏染色后于光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)菌的染色情況和形態(tài)特征。

1.4 細(xì)菌的生化鑒定

制備生化鑒定培養(yǎng)基，將疑似大腸桿菌分離菌株接種于葡萄糖培養(yǎng)基、乳糖培養(yǎng)基、細(xì)菌微量生化鑒定管(三糖鐵瓊脂實(shí)驗(yàn))進(jìn)行鑒定。以大腸桿菌質(zhì)控菌株ATCC25922作為對(duì)照。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.5 分離菌株的分子鑒定

在無菌條件下，將本實(shí)驗(yàn)所分離的各株大腸桿菌疑似菌株接種于LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)12 h。然后按照細(xì)菌DNA基因組提取試劑盒說明書，提取大腸桿菌的基因組DNA，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

為了進(jìn)一步確定分離菌株的類型，以基因組DNA為模板，采用表1中的相關(guān)上游和下游引物，擴(kuò)增16S rRNA，并將ATCC25922作為陽性對(duì)照。PCR反應(yīng)體系10 μL：Taq DNA 聚合酶 0.5 μL、10×PCR Buffer 1 μL、dNTPs 1 μL、上、下游引物各為1 μL、基因組DNA 1.5 μL、ddHO補(bǔ)至10 μL。反應(yīng)條件為： 94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min、退火溫度為56 ℃、72 ℃延伸1 min，20個(gè)循環(huán)，72 ℃終延伸10 min，4 ℃保存。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，于凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照。并將擴(kuò)增后的16S rRNA送上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.6 藥敏試驗(yàn)

利用K-B法，對(duì)大腸桿菌進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)。將鑒定后的大腸桿菌接種于LB培養(yǎng)基進(jìn)行活化，然后將0.5麥?zhǔn)蠞岫却竽c桿菌純培養(yǎng)物均勻地涂布在LB瓊脂培養(yǎng)基上，室溫下放置數(shù)分鐘后，再用無菌鑷子夾取藥敏紙片，均勻貼在LB瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)18 h后觀察并測(cè)量抑菌圈大小。以ATCC25922作標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株。判定標(biāo)準(zhǔn)：抑菌圈直徑≥20 mm時(shí)，為極度敏感；15 mm≤抑菌圈直徑≤20 mm時(shí)，為高度敏感；10 mm≤抑菌圈直徑≤15 mm時(shí)，為中度敏感；0 mm≤抑菌圈直徑≤10 mm時(shí)，低度敏感；抑菌圈直徑=0 mm時(shí)，為不敏感或耐藥。

1.7 耐藥基因檢測(cè)

以基因組DNA為模板，分別采用已合成的上游和下游引物，對(duì)分離鑒定后大腸桿菌的耐藥基因進(jìn)行PCR檢測(cè)。PCR反應(yīng)體系10 μL：Taq DNA 聚合酶 0.5 μL、10×PCR Buffer 1 μL、dNTPs 1 μL、上、下游引物各為1 μL、基因組DNA 1.5 μL、ddHO補(bǔ)至10 μL。反應(yīng)條件為： 94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min、退火1 min、72℃延伸1.5 min ，30個(gè)循環(huán)，72 ℃終延伸10 min，4 ℃保存。檢測(cè)的耐藥基因及其退火溫度如表1所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌生長(zhǎng)情況

混合菌涂布后，經(jīng)37 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h后，在伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基上可以觀察到帶有紫色金屬光澤，直徑約為1 mm左右的邊緣整齊光滑的菌落(圖1A)。然后再通過平板劃線法將初步篩選到的菌落接種于麥康凱培養(yǎng)基上，經(jīng)37 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h后，在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上可以觀察到圓形、邊緣整齊、表面光滑濕潤(rùn)、直徑約為1 mm左右的呈紅色或粉紅色凸起的菌落(圖1B)。挑取經(jīng)兩次純化培養(yǎng)后的菌株，進(jìn)行革蘭氏染色，在光學(xué)顯微鏡下可觀察到試驗(yàn)菌株為革蘭氏陰性菌，形態(tài)呈卵圓形短小桿菌，可初步鑒定為疑似大腸桿菌(圖2)。

圖1 純化菌株的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of purified strains

圖2 分離菌株的革蘭氏染色(40×)Fig.2 Gram staining of isolated strains (40×)

2.2 細(xì)菌的生化鑒定結(jié)果

將各分離菌株進(jìn)行生化試驗(yàn)，通過觀察發(fā)現(xiàn)分離的15株大腸桿菌疑似菌株均能發(fā)酵葡萄糖、乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，呈陽性。且不產(chǎn)生HS，呈陰性，符合大腸桿菌的生化特性。

2.3 菌株的分子鑒定

分離的大腸桿菌疑似菌株經(jīng)形態(tài)學(xué)、生化特性鑒定后的分離菌株，進(jìn)行特異性16S rRNA的PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果如圖3所示，所擴(kuò)增出的片段均為大小約為1 450 bp的片段，符合目的基因片段的長(zhǎng)度大小，與設(shè)計(jì)引物目的基因片段大小相似，測(cè)序結(jié)果與16S rRNA(登錄號(hào)：NR_024570.1)經(jīng)DNAMAN比對(duì)分析同源性為99.04%。進(jìn)一步確認(rèn)了所分離的菌株為大腸桿菌。

圖3 純化菌株的16S rRNA的PCR鑒定M. DL2000 DNA marker; 1. PCR鑒定;2～3. 陰性對(duì)照;4. 陽性對(duì)照Fig.3 PCR identification of 16S rRNA of purified strainsM. DL2000 DNA marker; 1. PCR identification;2～3. Negative control; 4. Positive control

2.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，15株大腸桿菌對(duì)氨芐西林、萬古霉素、復(fù)方新諾明、氯霉素、四環(huán)素的耐藥率均達(dá)到了100%，對(duì)慶大霉素的耐藥率達(dá)到了60.0%，對(duì)左氧氟沙星的耐藥率達(dá)到了26.7%，其中標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株則對(duì)所測(cè)試的抗生素大部分表現(xiàn)敏感。總體來看，該規(guī)?；i場(chǎng)分離出的15株大腸桿菌無一株完全敏感，對(duì)β-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類、磺胺類、多肽類和氯霉素類具有普遍的耐藥性，臨床上應(yīng)盡量少使用或不使用這5種藥物，對(duì)喹諾酮類和氨基糖苷類抗生素均具有較高的敏感性。

大腸桿菌多重耐藥指數(shù)(MARI)的公式為A/BC，其中A是細(xì)菌總抗菌藥物耐藥值，B是檢測(cè)時(shí)所使用的抗菌藥物的數(shù)目，C是所進(jìn)行檢驗(yàn)的菌株數(shù)，MARI取值范圍為0～1，MARI的數(shù)值越大，說明多重耐藥的水平越高。在此次試驗(yàn)中，A為73、B為7、C為15，MARI為0.695。說明此次試驗(yàn)中分離菌株的多重耐藥性較高，應(yīng)引起養(yǎng)殖廠的重視。

表2 15株大腸桿菌對(duì)7種抗菌藥物的藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Susceptibility results of 15 strains of E. coli against 7 antimicrobial drugs

2.5 耐藥性基因的PCR擴(kuò)增

15株大腸桿菌分離菌株耐藥基因的PCR檢測(cè)結(jié)果匯總?cè)绫?所示，檢出率最高的為氯霉素類的floR基因(100%)，其次是β-內(nèi)酰胺類的基因(80.0%)，四環(huán)素的基因(26.7%)，表明這些耐藥基因可能是導(dǎo)致大腸桿菌對(duì)相應(yīng)抗生素產(chǎn)生耐藥的原因。

由于大腸桿菌在對(duì)某一種藥物產(chǎn)生抗性繼而發(fā)生基因突變時(shí)，突變的方向是不確定的，所產(chǎn)生的抗性基因是多種多樣的，因此所帶有的抗性基因并不是唯一的。在此次試驗(yàn)中對(duì)復(fù)方新諾明、萬古霉素、左氧氟沙星、慶大霉素藥物出現(xiàn)了100%抗性，而未檢驗(yàn)出相應(yīng)的1、-1、(6')--、(3')-Ⅱ基因，可能是因?yàn)闄z測(cè)的大腸桿菌所含的抗性基因?yàn)?、3、-2、-3、(3)-Ⅱ、中的一種，而不是此次試驗(yàn)所檢測(cè)的1、-1、(6')--、(3')-Ⅱ基因。

表3 大腸桿菌分離菌株的耐藥基因分布率Table 3 Distribution of drug resistance genes of E. coli isolates

3 討 論

細(xì)菌耐藥性(AMR)已成為當(dāng)代醫(yī)學(xué)和制藥公司面臨的一個(gè)嚴(yán)重問題。耐藥菌感染數(shù)量的增加已經(jīng)嚴(yán)重威脅全球公共健康，其發(fā)病率和致死率均很高。任何治療劑的成功使用都會(huì)受到從首次使用時(shí)起對(duì)該抗菌藥物可能產(chǎn)生的耐受性或耐藥性的影響?？股刈鳛?0世紀(jì)最重要的醫(yī)學(xué)發(fā)現(xiàn)之一，在食源性動(dòng)物疾病治療中發(fā)揮了不可替代的作用。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2010年，牛、雞和豬每生產(chǎn)1 kg，動(dòng)物的全球平均年抗菌藥物消費(fèi)量分別為45 mg/kg、148 mg/kg和172 mg/kg。2010年至2030年，全球抗菌藥物消費(fèi)量將增長(zhǎng)67%，對(duì)中國來說，抗菌藥物消費(fèi)量的增長(zhǎng)將達(dá)到99%。

此外我國豬源性食品總消費(fèi)量和人均消費(fèi)量居世界首位。豬源性食品的質(zhì)量安全和養(yǎng)豬業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展與我們的健康密切相關(guān)。在養(yǎng)豬生產(chǎn)中，使用抗生素的過程中不僅殺滅了致病菌，也破壞了原有的正常菌群，長(zhǎng)期使用造成了藥物殘留及耐藥性的產(chǎn)生。大腸桿菌是人類和動(dòng)物腸道中的主要棲居菌，從個(gè)體出生后即進(jìn)入腸道，并終生攜帶。其耐藥性的不斷出現(xiàn)，以及耐藥基因的交叉出現(xiàn)必然會(huì)導(dǎo)致以后疾病防治的困難。因此，為了避免新耐藥菌株的產(chǎn)生，研制抗生素替代品已成為必然，否則必將導(dǎo)致大腸桿菌的耐藥情況越來越嚴(yán)峻，對(duì)人類與動(dòng)物的健康造成巨大威脅。

陳慧敏等從河南省不同地區(qū)采集腹瀉死亡仔豬分離鑒定出8株致病性大腸桿菌，通過K-B法測(cè)定8株大腸桿菌對(duì)21種抗菌藥物的耐藥性。李金朋等研究表明，大腸桿菌對(duì)氨芐西林、氨曲南、慶大霉素、卡那霉素、利福平和克林霉素耐藥，其中92.41%的大腸桿菌表現(xiàn)為多重耐藥。張炳亮等研究表明，23株致病性大腸桿菌對(duì)抗生素類藥物均有不同程度的耐藥性，其中對(duì)青霉素、紅霉素、四環(huán)素、卡那霉素、多西環(huán)素、氟哌酸、氨芐西林等7種抗生素的耐藥性較強(qiáng)，且均在70%以上。而此次實(shí)驗(yàn)大腸桿菌的MARI為0.695，說明大腸桿菌的多重耐藥性已較為嚴(yán)重。

耐藥基因可通過質(zhì)粒、整合子、轉(zhuǎn)座子等移動(dòng)元件在不同細(xì)菌間傳播，也可在動(dòng)物、人和環(huán)境間傳播。細(xì)菌一旦獲得耐藥基因，就可以使相應(yīng)的抗菌藥失效，而當(dāng)其獲得多種耐藥基因時(shí)，就會(huì)使該細(xì)菌引起的疾病變得難以救治。本試驗(yàn)從河南省新鄉(xiāng)市某規(guī)?；i場(chǎng)中分離了15株大腸桿菌，檢測(cè)出氯霉素類基因(100%)，β-內(nèi)酰胺類基因(80.0%)，四環(huán)素基因(26.7%)。與張明亮等對(duì)豫北地區(qū)大腸桿菌耐藥基因的檢測(cè)結(jié)果β-內(nèi)酰胺類基因(100%)，彭珂楠等對(duì)四川地區(qū)大腸桿菌耐藥基因檢測(cè)結(jié)果氯霉素類基因(81.82%)結(jié)果相近，說明大腸桿菌對(duì)氯霉素類及β-內(nèi)酰胺類抗生素產(chǎn)生抗性已經(jīng)是一個(gè)較為普遍的現(xiàn)象。從產(chǎn)生抗性的機(jī)理方面來說，β-內(nèi)酰胺類耐藥基因，通過表達(dá)β-內(nèi)酰胺酶消減了β-內(nèi)酰胺類抗菌藥的殺菌作用；四環(huán)素類耐藥基因，與細(xì)菌的核糖體結(jié)合，從而干擾細(xì)菌蛋白質(zhì)的翻譯來發(fā)揮抗菌藥的作用；氯霉素類耐藥基因通過特異/非特異的外排泵基因編碼的外排泵系統(tǒng)使細(xì)菌獲得耐藥性。

本研究從大腸桿菌耐藥率的方面揭示了新鄉(xiāng)市養(yǎng)豬場(chǎng)抗生素的使用情況，對(duì)養(yǎng)豬場(chǎng)抗生素的使用提供了一定的理論基礎(chǔ)及方向。通過對(duì)大腸桿菌攜帶耐藥基因的基因型進(jìn)行分析鑒定，為新鄉(xiāng)市大腸桿菌耐藥性產(chǎn)生的分子機(jī)理研究提供了參考，也為該病的臨床治療奠定了基礎(chǔ)。