王冠錦,趙 暘

(1. 北京體育大學 研究生院，北京 100084；2. 北京交通大學 體育教學部，北京 100044)

運動鍛煉能夠降低常見慢性病如各類癌癥、心腦血管疾病及2型糖尿病的發(fā)病率，對健康的維護及促進具有重要意義。然而，反復的力竭運動可以引起機體發(fā)生炎癥反應，具體表現(xiàn)為促炎因子及炎性介質(zhì)表達增加，進而對心臟、肝臟及腎臟等組織造成較大損傷。如何控制力竭運動后的臟器組織損傷及炎癥反應一直是人們關注的熱點。

黃芪甲苷為羊毛脂醇型四環(huán)三萜類皂苷，是黃芪的主要功效成分之一，具有提高免疫能力、抑制病毒增殖、降低氧化應激水平及下調(diào)炎癥因子表達等多種生物活性。研究發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷可以通過抗炎、抑制細胞凋亡、降低細胞毒性、平衡細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)及調(diào)節(jié)心肌能量代謝等途徑發(fā)揮保護心臟損傷作用。目前為止，在力竭運動導致的心肌損傷模型中，黃芪甲苷能否同樣起到保護作用尚未可知?；诖耍狙芯繑M建立反復力竭運動大鼠模型，灌胃給予黃芪甲苷后，探討其對心肌損傷是否具有保護作用，并進一步明確該作用與炎癥反應及相關信號通路的聯(lián)系，初步分析保護作用的潛在機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑與儀器

黃芪甲苷(含量>98%)購于成都瑞芬思德丹科技公司；H-E染色試劑盒(上海通蔚公司)； iNOS、NO、IL-1β、IL-6、IL-10及TNF-α檢測試劑盒(武漢賽培公司)；TLR4、MyD88及NF-κBp65及β-actin等一抗(美國Abcam公司)；對應二抗，購于北京Sino公司。電子天平(AE100型)，瑞士Metter公司；動物跑步機(FT-201型)，成都泰盟科技公司；光學顯微鏡(型號：ZX-201HC ZX-200HC，深圳眾尋儀器公司)；全自動生化分析儀(型號：NVAS6801，山東諾安諾泰信息系統(tǒng)公司)；酶標儀(型號：SHE-3000，北京賽爾福科技公司)；蛋白電泳儀(型號：1703940型，美國伯樂公司)。

1.2 分組、藥物干預及訓練方案

成年健康雄性SD大鼠，清潔級，由北京科興中維公司提供，生產(chǎn)許可證：SYXK(京)2020-0054。適應環(huán)境后，將40只大鼠分為對照組、運動模型組、運動模型+低劑量黃芪甲苷組(100 mg/kg)及運動模型+高劑量黃芪甲苷組(200 mg/kg)，每組10只。開始運動訓練時即給予藥物干預，運動訓練在每天上午進行，并于訓練結束2 h后藥物干預；給藥劑量參考魏斕等的研究并結合預實驗結果，給藥方式為灌胃給藥，給藥頻率為1次/d。對照組不給予運動訓練，其他操作相同；剩余各組均需給予運動訓練，訓練方案參照徐祖杰等的研究。大鼠首先用20 m/min的速度在跑步機上(坡度0°)跑步0.5 h，每天運動1次，訓練6 d后休息1 d，此過程共訓練1周；隨后調(diào)整坡度為5°，用30 m/min速度跑步，力竭時停止，每天運動1次，訓練6 d后休息1 d，此過程連續(xù)訓練6周。

1.3 血液及心臟組織取材

各組大鼠于6周訓練結束并末次灌胃黃芪甲苷后，禁食24 h。用3 mL/kg烏拉坦溶液(20%)麻醉大鼠，腹主動脈取血，離心制備血清，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｈ⊙螅蛛x心臟，取相同部位心肌組織，在4%多聚甲醛溶液中保存固定，剩余心肌組織在-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 測定指標與方法

1.4.1 心肌組織病理變化 制作石蠟切片后，常規(guī)方法進行H-E染色，封片晾干后，顯微鏡下檢測心肌組織病理變化。

1.4.2 心肌損傷指標 CK、CK-MB、LDH及AST活性等心肌損傷指標檢測采用全自動生化分析儀進行。

1.4.3 炎癥反應指標 心肌組織加入適量裂解液，電動勻漿機勻漿后，在冰水浴中裂解30 min，離心制備10%心肌組織勻漿液。參照試劑盒說明書指南進行操作，在450 nm波長處測吸光度，根據(jù)標準曲線分別計算各組大鼠心肌組織iNOS活性及NO、IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α含量。

1.4.4 心肌組織相關蛋白表達 按照“1.4.3”中的方法，制備10%心肌組織勻漿液，通過Western blot法檢測心肌組織相關蛋白表達，其中TLR4、MyD88、NF-κBp65的稀釋比例為1∶1 000，β-actin的稀釋比例為1∶2 500，二抗的稀釋比例為1∶5 000?？贵w結合后滴加ECL試劑顯色，用Image J1.8.0軟件進行灰度值分析。

1.5 數(shù)據(jù)處理

結果以“平均值±標準差”表示，采用SPSS20.0軟件進行單因素方差分析，<0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 對心肌組織病理變化的影響

由圖1可見，對照組大鼠心肌細胞無炎性浸潤現(xiàn)象發(fā)生，心肌纖維緊密且排列整齊，相互連接成網(wǎng)狀。運動模型組大鼠心肌細胞發(fā)生較多炎性浸潤現(xiàn)象，心肌纖維腫脹，損傷較嚴重。運動模型+低劑量黃芪甲苷組、運動模型+高劑量黃芪甲苷組大鼠心肌組織出現(xiàn)少許炎性細胞浸潤，心肌纖維腫脹及損傷程度有所緩解，其中運動模型+高劑量黃芪甲苷組改善更為明顯。

圖1 黃芪甲苷對力竭運動大鼠心肌組織病理變化的影響(200×)Fig. 1 Effects of astragaloside IV on pathological changes of myocardium in exhaustive exercise rats (200×)

2.2 對心肌損傷標志物的影響

由表1可見，運動模型組大鼠CK、CK-MB、LDH及AST活性與對照組比較均顯著升高(<0.05)；低、高劑量黃芪甲苷能夠顯著降低運動模型大鼠CK、CK-MB、LDH及AST活性(<0.05)；運動模型+高劑量黃芪甲苷組大鼠CK、CK-MB及AST活性與運動模型+低劑量黃芪甲苷組比較進一步降低(<0.05)，而LDH活性無顯著變化(>0.05)。

表1 黃芪甲苷對力竭運動大鼠心肌損傷標志物的影響Table 1 Effects of astragaloside IV on myocardial injury markers in exhaustive exercise rats U/L

2.3 對iNOS活性及NO含量的影響

由表2可見，運動模型組大鼠iNOS活性及NO含量與對照組比較均顯著升高(<0.05)；低、高劑量黃芪甲苷可以顯著使運動模型大鼠iNOS活性及NO含量降低(<0.05)；高劑量黃芪甲苷降低運動模型大鼠iNOS活性及NO含量的能力顯著優(yōu)于低劑量黃芪甲苷(<0.05)。

表2 黃芪甲苷對力竭運動大鼠iNOS活性及NO含量的影響Table 2 Effects of astragaloside IV on iNOS activity and NO content of rats in exhaustive exercise rats

2.4 對IL-1β、IL-6、IL-10及TNF-α含量的影響

由表3可見，運動模型組大鼠IL-1β、IL-6及TNF-α含量與對照組比較均顯著升高(<0.05)，而IL-10含量顯著降低(<0.05)；低、高劑量黃芪甲苷均能夠顯著降低運動模型大鼠IL-1β、IL-6及TNF-α含量(<0.05)，同時顯著升高IL-10含量(<0.05)；運動模型+高劑量黃芪甲苷組大鼠IL-1β、IL-6及TNF-α含量降低及IL-10含量升高的幅度均顯著高于運動模型+低劑量黃芪甲苷組(<0.05)。

表3 黃芪甲苷對力竭運動大鼠IL-1β、IL-6、IL-10及TNF-α含量的影響Table 3 Effects of astragaloside IV on IL-1β, IL-6, IL-10 and TNF-α contents of rats in exhaustive exercise rats pg/mgpro

2.5 對TLR4/MyD88/NF-κB通路的影響

由圖2及表4可見，運動模型組大鼠TLR4/MyD88/NF-κB通路相關蛋白TLR4、MyD88及NF-κBp65表達與對照組比較均顯著升高(<0.05)；低、高劑量黃芪甲苷均可以顯著降低運動模型大鼠TLR4/MyD88/NF-κB通路相關蛋白TLR4、MyD88及NF-κBp65表達(<0.05)，且運動模型+高劑量黃芪甲苷組比運動模型+低劑量黃芪甲苷組相關蛋白下降幅度更為顯著(<0.05)。

圖2 Western blot法檢測黃芪甲苷對力竭運動大鼠TLR4/MyD88/NF-κB通路的影響Fig. 2 Effects of astragaloside IV on TLR4/MyD88/NF-κB pathway in exhaustive exercise rats detected by Western blot assay

3 討 論

適量的運動可增強心臟功能，加快機體新陳代謝，而過度的運動會引起心臟負荷增加，導致心肌組織損傷。已有研究表明，強負荷體育訓練或力竭運動均會使血清中心肌損傷標志物CK、CK-MB、LDH及AST等活性增加。在本研究中，運動模型組大鼠心肌組織出現(xiàn)病理改變，且血清CK、CK-MB、LDH及AST活性均顯著升高，提示建模成功；運動模型+低劑量黃芪甲苷組、運動模型+高劑量黃芪甲苷組大鼠心肌組織病理改變有一定程度的緩解，同時，血清CK、CK-MB、LDH及AST活性均顯著降低，表明黃芪甲苷對力竭運動大鼠心肌損傷具有保護作用。

表4 黃芪甲苷對力竭運動大鼠TLR4/MyD88/NF-κB通路的影響Table 4 Effects of astragaloside IV on TLR4/MyD88/NF-κB pathway in exhaustive exercise rats β-actin

NO被認為具有強大的血管擴張作用，同時也是重要的炎癥介質(zhì)，NO的生成依賴于iNOS的催化。研究發(fā)現(xiàn)，給予牡蠣多糖或黃精多糖干預后，由高強度訓練或力竭運動引起的機體組織iNOS活性及NO含量增加的趨勢會被有效控制，進而通過抑制炎癥反應減弱相關臟器損傷。在炎癥反應中炎癥因子的表達具有重要意義，在生理條件下，體內(nèi)的促炎因子與抗炎因子保持動態(tài)平衡；而在病理或反復力竭運動中，該平衡被打破，從而引發(fā)炎癥反應。IL-1β、IL-6及TNF-α為促炎因子，可以促進炎癥反應的發(fā)生，而IL-10則屬于抗炎因子，其作用為抑制炎癥反應。岑人軍等研究證實，北五味子乙素對力竭運動大鼠心肌損傷的保護作用，與抑制IL-6、TNF-α表達及促進IL-10表達有關。本研究結果同樣證實，運動模型+低劑量黃芪甲苷組、運動模型+高劑量黃芪甲苷組大鼠iNOS活性及NO、IL-1β、IL-6、TNF-α含量顯著降低，而IL-10含量顯著升高，提示抑制炎癥反應是黃芪甲苷發(fā)揮保護心肌損傷的潛在原因。

TLR4/MyD88/NF-κB通路是機體經(jīng)典的炎癥信號通路，其中TLR4為心臟組織中表達量最高的TLR家族成員，在心臟炎癥和損傷過程中發(fā)揮重要作用。TLR4被激活后可與MyD88蛋白結合，促進NF-κB蛋白的表達，啟動IL-1β、IL-6及TNF-α等炎癥因子的轉(zhuǎn)錄，引起組織損傷。Rosa等研究發(fā)現(xiàn)，大鼠在力竭運動后，脂肪組織中促炎因子的增加與TLR4/MyD88/NF-κB通路有關。此外，相關研究證實，在急性心肌梗死模型中，黃芪甲苷可有效降低TLR4、MyD88、NF-κBp65的過表達，從而改善急性心肌梗死程度。本研究結果同樣發(fā)現(xiàn)，在力竭運動后心肌組織TLR4/MyD88/NF-κB通路處于活化狀態(tài)，經(jīng)黃芪甲苷干預后，TLR4、MyD88及NF-κBp65蛋白表達水平顯著降低，提示黃芪甲苷對力竭運動大鼠心肌損傷的保護作用與抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路有關。

4 結 論

黃芪甲苷具有抑制力竭運動大鼠TLR4/MyD88/NF-κB通路及炎癥反應作用，該作用是其保護心肌損傷的潛在原因，說明其在防治運動引起的心肌損傷中具有一定的應用前景。